本发明属于发酵技术领域，特别是涉及一种利用灰色链霉菌发酵生产阿维菌素的培养基。
背景技术：
阿维菌素是由日本北里大学大村智等和美国Merck公司首先开发的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯化合物，由链霉菌中灰色链霉菌Streptomyces avermitilis发酵产生。天然阿维菌素中含有8个组分，主要有4种即A1a、A2a、B1a和B2a，其总含量≥80%；对应的4个比例较小的同系物是A1b、A2b、B1b和B2b，其总含量≤20%。其中B1a为主要杀虫成分，故而阿维菌素含量以B1a的含量来标定。阿维菌素具有农 、牧、医三用的特点。有很强的驱虫、杀虫活性，是世界上目前最有效的杀寄生虫剂、杀螨虫剂和杀昆虫剂。阿维菌素在自然条件下容易降解,对人畜安全,对天敌影响小,属于绿色生物农药。
目前，国内阿维菌素的发酵生产采用三级发酵模式，存在的主要问题有以下几点：
1 发酵单位低，一般较好水平在5500u/ml左右。阿维菌素发酵前期，起步效价低，发酵后期，产素能力弱，效价增幅小，影响发酵效价总体放罐水平。
2发酵周期长，一般在240h左右，导致能耗较高，增加了生产成本。
技术实现要素：
本发明的目的就在于克服上述现有技术的缺陷，提供一种利用灰色链霉菌发酵生产阿维菌素的培养基，包括二级种子培养基，发酵中、后期补料培养基，通过提供适宜的二级种子培养基，发酵中、后期补料培养基，提高菌种活力，促进菌丝生长和代谢，有效提高发酵单位，缩短发酵周期，降低生产成本。
为实现上述目的所采取的技术方案为：
一种利用灰色链霉菌发酵生产阿维菌素的培养基，包括二级种子培养基及补料培养基，其特征在于所述二级种子培养基组成为：玉米淀粉26～32g/L、发酵豆粕10～13g/L、酵母粉10g/L、玉米浆16～20g/L、硫酸铵0.8～1.2g/L、氯化钴0.025～0.027 g/L、钼酸铵0.04～0.08g/L、乳酸锌0.02～0.06g/L、磷酸二氢钾0.3～0.7g/L、轻质碳酸钙2～6g/L、糖化酶0.05～0.09g/L、聚醚改性硅0.008～0.012g/L。
所述补料培养基是由发酵中期补料培养基和发酵后期补料培养基组成，其中
发酵中期补料培养基组成为：质量浓度为45%的玉米淀粉液化糖900～1200g/L、硫酸铵38～42g/L、大豆蛋白胨15～19g/L；
发酵后期补料培养基组成为：质量浓度为45%的玉米淀粉液化糖160～180g/L、大豆蛋白胨12～16g/L。
所述发酵豆粕质量指标为内含70%生物活性小肽和50-55%粗蛋白。
所述乳酸锌质量符合Q/LST001-2004标准。
所述二级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮60～80mg/100ml、溶磷70～90ug/ml、总糖3.2～3.5g/100ml、pH6.5～7.5。
所述发酵中期是指发酵90～180h,发酵后期是指发酵181h～放罐。
本发明的技术优势：
1 本发明确认了利用灰色链霉菌发酵生产阿维菌素的二级种子培养基的碳源、氮源最佳配伍比例。
2 本发明二级种子培养基中使用了发酵豆粕、乳酸锌，提高菌种活力，促进菌丝生长和代谢，有效提高发酵单位，进而提高二级种子液质量，有利于提高发酵起步效价。
3本发明在发酵中、后期进而补料，且补料培养基中使用了大豆蛋白胨，该大豆蛋白胨中富含氨基酸，尤其含有颉氨酸、色氨酸，有利于阿维菌素生物合成，提高B1a组份含量。
4采用本发明的培养基生产阿维菌素，最终使得阿维菌素发酵单位（发酵罐186m3）达到6200u/ml以上，同国内技术相比，发酵单位提高了18.2%以上；发酵周期控制在230h以内。
具体实施方法
下面用实例予以说明本发明，应该理解的是，实例是用于说明本发明而不是对本发明的限制。本发明的范围与核心内容依据权利要求书加以确定。
下述实施例的菌种选用二级种子液的质量要求为：菌体浓度35～40%、pH值6.8～7.6，移种比例为1:0.10～0.12（V/V）。
发酵培养工艺：
发酵温度：28±0.5℃；空气流量1300-1800m3/h；搅拌转速100-120r/min；pH控制在6.2-6.5，菌体浓度25-35%。
发酵补料工艺：
发酵PH6.2～6.4，糖浓度1.0～3.0g/100ml，氨基氮30～60mg/100ml。
发酵培养结束要求：
阿维菌素发酵单位达到6000u/以上，发酵周期控制在230h以内。
实施例1
一级种子培养：种子培养基有效体积2m3。
种子培养基：玉米淀粉60kg、黄豆饼粉16kg、花生饼粉70kg、酵母浸膏8kg、氯化钴0.06 kg、α-淀粉酶0.08kg。
首先，将一级种子培养基121℃灭菌，保压30分钟，冷却至25℃，用无菌空气保压，一级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮42mg/100ml、总糖2.8g/100ml、pH7.2。然后在火焰保护下，将已经培养好的灰色链霉素母瓶发酵液按照0.1L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速160r/min。至菌体浓度25.2%、pH值6.6，培养时间33h移种。
二级种子培养：二级种子培养基体积21m3。
玉米淀粉546kg、发酵豆粕210kg、酵母粉210、玉米浆336kg、硫酸铵16.8kg、氯化钴0.525kg、钼酸铵0.84kg、乳酸锌0.42kg、磷酸二氢钾6.3kg、轻质碳酸钙42kg、糖化酶1.05kg、聚醚改性硅0.168kg。
二级种子培养：首先将二级种子培养基121℃灭菌，保压30分钟，冷却至25℃，用无菌空气保压，二级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮62mg/100ml、总糖3.3g/100ml、pH6.9。然后，用压差法将培养好的一级种子接入二级种子培养基中进行种子培养，移种比例为10%（V/V），二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；空气流量150m3/h；搅拌转速120r/min；至菌体浓度35%、pH值6.8、培养时间20h后停止二级种子培养。
发酵培养：发酵培养基有效体积140m3。
玉米淀粉19600kg、高温黄豆粉3500kg、酵母粉1400kg、氯化钴28kg、硫酸锰0.336kg、钼酸钠3.22kg、淀粉酶5.6kg、轻质碳酸钙42kg、聚醚改性硅140kg、磷酸二氢钾30kg。
发酵中期补料培养基：7m3。
45%（w/w）液糖6300kg、硫酸铵266kg、大豆蛋白胨105kg。
补料从发酵90h起至180h，残糖低于1.0g/100ml起补入，间隔4小时补入，补加量300L/h。
发酵后期补料培养基：4m3。
45%（w/w）液糖640kg、大豆蛋白胨48kg。
补料从发酵181h起至放罐前8小时，残糖低于1.0g/100ml起补入，间隔4小时补入，补加量300L/h。
二级种子液的质量结果：菌体浓度35.6%、pH值6.84，移种量为14.7m3。
发酵过程中，发酵温度28±0.5℃；空气流量1300-1800m3/h；搅拌转速100-120r/min；pH控制在6.2-6.5，菌体浓度25-35%。
发酵培养结束，阿维菌素发酵单位6120u/ml，发酵周期226h。
实施例2
一级种子培养：种子培养基有效体积2m3。
种子培养基：玉米淀粉60kg、黄豆饼粉16kg、花生饼粉70kg、酵母浸膏8kg、氯化钴0.06 kg、α-淀粉酶0.08kg。
首先，将一级种子培养基121℃灭菌，保压30分钟，冷却至25℃，用无菌空气保压，一级种子培养基灭菌后的的质量要求为：氨基氮42mg/100ml、总糖2.8g/100ml、pH7.2。然后在火焰保护下，将已经培养好的灰色链霉素母瓶发酵液按照0.1L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速160r/min。至菌体浓度24.6%、pH值6.7、培养时间31h移种。
二级种子培养：二级种子培养基体积21m3。
玉米淀粉588kg、发酵豆粕231kg、酵母粉210、玉米浆358kg、硫酸铵18.9kg、氯化钴0.546kg、钼酸铵1.05kg、乳酸锌0.63kg、磷酸二氢钾8.4kg、轻质碳酸钙63kg、糖化酶1.26kg、聚醚改性硅0.189kg。
二级种子培养：首先将二级种子培养基121℃灭菌，保压30分钟，冷却至25℃，用无菌空气保压，二级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮68mg/100ml、总糖3.4g/100ml、pH7.1。然后，用压差法将培养好的一级种子接入二级种子培养基中进行种子培养，移种比例为10%（V/V），二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；空气流量150m3/h；搅拌转速120r/min；至菌体浓度35%、pH值6.8、培养时间20h后停止二级种子培养。
发酵培养：发酵培养基有效体积140m3。
玉米淀粉19600kg、高温黄豆粉3500kg、酵母粉1400kg、氯化钴28kg、硫酸锰0.336kg、钼酸钠3.22kg、淀粉酶5.6kg、轻质碳酸钙42kg、聚醚改性硅140kg、磷酸二氢钾30kg。
发酵中期补料培养基：7m3。
45%（w/w）液糖7000kg、硫酸铵273kg、大豆蛋白胨112kg。
补料从发酵90h起至180h，残糖低于1.0g/100ml起补入，间隔4小时补入，补加量300L/h
发酵后期补料培养基：4m3。
45%（w/w）液糖680kg、大豆蛋白胨52kg。
补料从发酵181h起至放罐前8小时，残糖低于1.0g/100ml起补入，间隔4小时补入，补加量300L/h。
二级种子液的质量结果：菌体浓度36.8%、pH值6.91，移种量为15.5m3。
发酵过程中，发酵温度28±0.5℃；空气流量1300-1800m3/h；搅拌转速100-120r/min；pH控制在6.2-6.5，菌体浓度25-35%。
发酵培养结束，阿维菌素发酵单位6320u/ml，发酵周期224h。
实施例3
一级种子培养：种子培养基有效体积2m3。
种子培养基：玉米淀粉60kg、黄豆饼粉16kg、花生饼粉70kg、酵母浸膏8kg、氯化钴0.06 kg、α-淀粉酶0.08kg。
首先，将一级种子培养基121℃灭菌，保压30分钟，冷却至25℃，用无菌空气保压，一级种子培养基灭菌后的的质量要求为：氨基氮42mg/100ml、总糖2.8g/100ml、pH7.2。然后在火焰保护下，将已经培养好的灰色链霉素母瓶发酵液按照0.1L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速160r/min。至菌体浓度26.4%、pH值6.9、培养时间34h移种。
二级种子培养：二级种子培养基体积21m3。
玉米淀粉630kg、发酵豆粕252kg、酵母粉210、玉米浆378kg、硫酸铵21kg、氯化钴0.567kg、钼酸铵1.26kg、乳酸锌0.84kg、磷酸二氢钾10.5kg、轻质碳酸钙84kg、糖化酶1.47kg、聚醚改性硅0.21kg。
二级种子培养：首先将二级种子培养基121℃灭菌，保压30分钟，冷却至25℃，用无菌空气保压，二级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮71mg/100ml、总糖3.5g/100ml、pH7.2。然后，用压差法将培养好的一级种子接入二级种子培养基中进行种子培养，移种比例为10%（V/V），二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；空气流量150m3/h；搅拌转速120r/min；至菌体浓度35%、pH值6.8、培养时间20h后停止二级种子培养。
发酵培养：发酵培养基有效体积140m3。
玉米淀粉19600kg、高温黄豆粉3500kg、酵母粉1400kg、氯化钴28kg、硫酸锰0.336kg、钼酸钠3.22kg、淀粉酶5.6kg、轻质碳酸钙42kg、聚醚改性硅140kg、磷酸二氢钾30kg。
发酵中期补料培养基：7m3。
45%（w/w）液糖7700kg、硫酸铵280kg、大豆蛋白胨119kg。
补料从发酵90h起至180h，残糖低于1.0g/100ml起补入，间隔4小时补入，补加量300L/h。
发酵后期补料培养基：4m3。
45%（w/w）液糖720kg、大豆蛋白胨56kg。
补料从发酵181h起至放罐前8小时，残糖低于1.0g/100ml起补入，间隔4小时补入，补加量300L/h。
二级种子液的质量结果：菌体浓度37.1%、pH值6.95，移种量为16.2m3。
发酵过程中，发酵温度28±0.5℃；空气流量1300-1800m3/h；搅拌转速100-120r/min；pH控制在6.2-6.5，菌体浓度25-35%。
发酵培养结束，阿维菌素发酵单位6330u/ml，发酵周期228h。
实施例4
一级种子培养：种子培养基有效体积2m3。
种子培养基：玉米淀粉60kg、黄豆饼粉16kg、花生饼粉70kg、酵母浸膏8kg、氯化钴0.06 kg、α-淀粉酶0.08kg。
首先，将一级种子培养基121℃灭菌，保压30分钟，冷却至25℃，用无菌空气保压，一级种子培养基灭菌后的的质量要求为：氨基氮42mg/100ml、总糖2.8g/100ml、pH7.2。然后在火焰保护下，将已经培养好的灰色链霉素母瓶发酵液按照0.1L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速160r/min。至菌体浓度27.5%、pH值7.30、培养时间33h移种。
二级种子培养：二级种子培养基体积21m3。
玉米淀粉672kg、发酵豆粕273kg、酵母粉210、玉米浆400kg、硫酸铵23.1kg、氯化钴0.546kg、钼酸铵1.47kg、乳酸锌1.05kg、磷酸二氢钾1.26kg、轻质碳酸钙105kg、糖化酶1.68kg、聚醚改性硅0.231kg。
二级种子培养：首先将二级种子培养基121℃灭菌，保压30分钟，冷却至25℃，用无菌空气保压，二级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮75mg/100ml、总糖3.4g/100ml、pH7.4。然后，用压差法将培养好的一级种子接入二级种子培养基中进行种子培养，移种比例为10%（V/V），二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；空气流量150m3/h；搅拌转速120r/min；至菌体浓度35%、pH值6.8、培养时间20h后停止二级种子培养。
发酵培养：发酵培养基有效体积140m3。
玉米淀粉19600kg、高温黄豆粉3500kg、酵母粉1400kg、氯化钴28kg、硫酸锰0.336kg、钼酸钠3.22kg、淀粉酶5.6kg、轻质碳酸钙42kg、聚醚改性硅140kg、磷酸二氢钾30kg。
发酵中期补料培养基：7m3。
45%（w/w）液糖8400kg、硫酸铵287kg、大豆蛋白胨126kg。
补料从发酵90h起至180h，残糖低于1.0g/100ml起补入，间隔4小时补入，补加量300L/h。
发酵后期补料培养基：4m3。
45%（w/w）液糖660kg、大豆蛋白胨60kg。
补料从发酵181h起至放罐前8小时，残糖低于1.0g/100ml起补入，间隔4小时补入，补加量300L/h。
二级种子液的质量结果：菌体浓度39.2%、pH值7.25，移种量为16.5m3。
发酵过程中，发酵温度28±0.5℃；空气流量1300-1800m3/h；搅拌转速100-120r/min；pH控制在6.2-6.5，菌体浓度25-35%。
发酵培养结束，阿维菌素发酵单位6260u/ml，发酵周期227h。
实施例5
一级种子培养：种子培养基有效体积2m3。
种子培养基：玉米淀粉60kg、黄豆饼粉16kg、花生饼粉70kg、酵母浸膏8kg、氯化钴0.06 kg、α-淀粉酶0.08kg。
首先，将一级种子培养基121℃灭菌，保压30分钟，冷却至25℃，用无菌空气保压，一级种子培养基灭菌后的的质量要求为：氨基氮42mg/100ml、总糖2.8g/100ml、pH7.2。然后在火焰保护下，将已经培养好的灰色链霉素母瓶发酵液按照0.1L的接种量接入一级种子培养基中进行种子培养，一级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；罐温28±0.5℃；空气流量180m3/h；搅拌转速160r/min。至菌体浓度26.1%、pH值6.8、培养时间34h移种。
二级种子培养：二级种子培养基体积21m3。
玉米淀粉609kg、发酵豆粕252kg、酵母粉210、玉米浆378kg、硫酸铵21kg、氯化钴0.546kg、钼酸铵1.26kg、乳酸锌0.84kg、磷酸二氢钾10.5kg、轻质碳酸钙84kg、糖化酶1.47kg、聚醚改性硅0.21kg。
二级种子培养：首先将二级种子培养基121℃灭菌，保压30分钟，冷却至25℃，用无菌空气保压，二级种子培养基灭菌后的质量要求为：氨基氮70mg/100ml、总糖3.3g/100ml、pH7.0。然后，用压差法将培养好的一级种子接入二级种子培养基中进行种子培养，移种比例为10%（V/V），二级种子培养条件为：罐压0.03～0.05MPa；空气流量150m3/h；搅拌转速120r/min；至菌体浓度35%、pH值6.8、培养时间20h后停止二级种子培养。
发酵培养：发酵培养基有效体积140m3。
玉米淀粉19600kg、高温黄豆粉3500kg、酵母粉1400kg、氯化钴28kg、硫酸锰0.336kg、钼酸钠3.22kg、淀粉酶5.6kg、轻质碳酸钙42kg、聚醚改性硅140kg、磷酸二氢钾30kg。
发酵中期补料培养基：7m3。
45%（w/w）液糖7350kg、硫酸铵294kg、大豆蛋白胨133kg。
补料从发酵90h起至180h，残糖低于1.0g/100ml起补入，间隔4小时补入，补加量300L/h。
发酵后期补料培养基：4m3。
45%（w/w）液糖700kg、大豆蛋白胨64kg。
补料从发酵181h起至放罐前8小时，残糖低于1.0g/100ml起补入，间隔4小时补入，补加量300L/h。
二级种子液的质量结果：菌体浓度38.7%、pH值7.10，移种量为16.2m3。
发酵过程中，发酵温度28±0.5℃；空气流量1300-1800m3/h；搅拌转速100-120r/min；pH控制在6.2-6.5，菌体浓度25-35%。
发酵培养结束，阿维菌素发酵单位6350u/ml，发酵周期226h。