本发明属于抗生素发酵领域，具体涉及一种添加木瓜蛋白酶的金霉素发酵培养基及其应用。
背景技术：
金霉素生物发酵法主要采用现代生物发酵工程技术，通过发酵基质中的玉米淀粉、花生饼粉、黄豆饼粉、无机盐等原料培养金色链霉菌，使其代谢产生金霉素。玉米淀粉作为主要碳源，是细胞生长和代谢不可或缺的成分；花生饼粉、黄豆饼粉、酵母粉等作为主要氮源，为细胞生长及含氮代谢物的合成提供长效氮源，还提供细胞生长所需要的维生素、生长因子等。但是，在自然的发酵过程中这些原材料实际利用率非常低，主要原因就是：目前抗生素的发酵主要依靠发酵过程中微生物自身分泌的酶将基料中的原料蛋白酶解为小肽或氨基酸，但微生物自身分泌的酶量有限，而且酶解效率较低，一方面，造成了原料浪费以及延长了抗生素的发酵周期，增加了原料投入成本和时间投入成本，另一方面，严重限制了抗生素的大量合成。因此，在未来资源紧缺的时代，如何能有效的提高这些天然原材料的酶解效率，真正的提高这些原材料的利用率，才是未来抗生素发酵行业的竞争重点。
木瓜蛋白酶（Papain），又称木瓜酶，是一种蛋白水解酶。在酸性、中性、碱性环境下均能分解蛋白质，它是一种含巯基(-SH)肽链内切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，有较广泛的特异性，对动植物蛋白、多肽、酯、酰胺等有较强的水解能力。它具有酶活高、热稳定性好、天然卫生安全等特点，因此在食品、医药、饲料、日化、皮革及纺织等行业得到广泛应用。
专利CN 104263712 A描述了一种复合木瓜蛋白酶，由下述重量份原料组成：木瓜蛋白酶50-70份，生姜蛋白酶20-40份，菠萝蛋白酶5-15份，提供了复合木瓜蛋白酶在啤酒澄清、肉类软化、饼干松化、制备抗肿瘤、抗淋巴性白血病、抗病原菌、抗寄生虫药物、美白皮肤、抗衰老等中的应用。专利CN 102719422 A提供的复合木瓜蛋白酶组合物，在传统木瓜蛋白酶中加入了低聚木糖，提高了木瓜蛋白酶的活性，专利还提供了复合木瓜蛋白酶组合物在医药工业、食品工业、美容工业、日化品工业、饲料工业及皮革工业中的应用。
目前关于木瓜蛋白酶的报道基本上都是基于如何进行木瓜蛋白酶复配来提高木瓜蛋白酶的活性以及扩大其应用范围；而木瓜蛋白酶在生物发酵领域尤其是金霉素发酵方面未见相关的应用报道。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种能稳定金霉素发酵生产水平、提高原材料的利用率、降低生产中原材料的投入成本的添加木瓜蛋白酶的金霉素发酵培养基及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案方案是：一种添加木瓜蛋白酶的金霉素发酵培养基，每1 L 培养基（水溶液）中的具体成分为：花生饼粉 12~25g、黄豆饼粉5~15g、玉米淀粉50~100g、玉米浆 10~15g、酵母粉1~5g、豆油2.5~5g、木瓜蛋白酶0.28~0.35g、淀粉酶 0.1~0.2g、氯化钠 1.0~3.5g、硫酸铵 5.5~8g、碳酸钙 5.6~8.0g、硫酸镁0.1~0.3g。
所述木瓜蛋白酶活力≥400000U/mL。
所述金霉素发酵培养基在金霉素发酵生产中应用，具体包括以下步骤：
（1）斜面菌丝培养，将斜面保藏的金色链霉菌孢子，32±1℃培养3~5 天制备母瓶斜面菌丝；
（2）二级种子液制备，将步骤（1）中母瓶内斜面菌丝接种到一级种子罐中，26~33℃、110～140转/ 分下发酵20～26h 制备一级种子液；将一级种子液接种到二级种子罐中，26~33℃、110～140转/ 分下发酵4～8h 制备二级种子液；
（3）制备金霉素发酵液，将步骤（2）中二级种子液接种于发酵罐内，30-35℃条件下发酵90-124 h（培养压力控制在 0.01Mpa-0.04Mpa，发酵培养粘度控制在 50-120cp）即为金霉素发酵液。
金色链霉菌孢子的筛选及斜面保藏均为本领域很常规的技术手段，此处不太赘述。本发明中的添加木瓜蛋白酶的金霉素发酵培养基在步骤（3）中的发酵罐内使用。
本发明产生的有益效果是：通过添加木瓜蛋白酶，降低有机氮源的加入量，提高有机氮源的利用率，相比现有的发酵配方中酵母粉减少比例50～60%（W/W）或者黄豆饼粉减少比例50%（W/W），而其它原料配比不变时，还能使金霉素（CTC）的发酵产量略有提高；降低了工业发酵生产中的原料投入成本，而且在一定程度上避免了原材料未被充分利用而造成的浪费现象，具有重要经济和环境效益。
具体实施方式
以下通过实施例对本发明进行阐述，但本发明的保护范围并不局限于此。
以下实施例中所用木瓜蛋白酶活力≥400000U/mL。
实施例1
一种添加木瓜蛋白酶的金霉素发酵培养基，每1 L 培养基中的具体成分为：花生饼粉 20g、黄豆饼粉10g、玉米淀粉75g、玉米浆 12g、酵母粉5g、豆油4g、木瓜蛋白酶0.28g、淀粉酶 0.15g、氯化钠 2.0g、硫酸铵 6.5g、碳酸钙 6.6g、硫酸镁0.2g。
所述金霉素发酵培养基在金霉素发酵生产中应用，具体包括以下步骤：
（1）斜面菌丝培养，将斜面保藏的金色链霉菌孢子，32±1℃培养4 天制备母瓶斜面菌丝；
（2）二级种子液制备，将步骤（1）中母瓶内斜面菌丝接种到一级种子罐中，30℃、120转/ 分下发酵24h 制备一级种子液；将一级种子液接种到二级种子罐中，30℃、120转/ 分下发酵5h 制备二级种子液；
（3）制备金霉素发酵液，将步骤（2）中二级种子液接种于发酵罐内，30℃条件下发酵100h即为金霉素发酵液（50m3）。
实施例1得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7312 kg。
对照例1
对照例1与实施例1的不同之处在于：发酵培养基中不添加木瓜蛋白酶，黄豆饼粉的添加量为20g。
对照例1得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7282 kg。
实施例2
一种添加木瓜蛋白酶的金霉素发酵培养基，每1 L 培养基中的具体成分为：花生饼粉 20g、黄豆饼粉12g、玉米淀粉50g、玉米浆 15g、酵母粉3g、豆油5g、木瓜蛋白酶0.28g、淀粉酶 0.2g、氯化钠 1.0g、硫酸铵8g、碳酸钙 5.6g、硫酸镁0.1g。
所述金霉素发酵培养基在金霉素发酵生产中应用，具体包括以下步骤：
（1）斜面菌丝培养，将斜面保藏的金色链霉菌孢子，32±1℃培养5 天制备母瓶斜面菌丝；
（2）二级种子液制备，将步骤（1）中母瓶内斜面菌丝接种到一级种子罐中，26℃、140转/ 分下发酵26h 制备一级种子液；将一级种子液接种到二级种子罐中，26℃、140转/ 分下发酵8h 制备二级种子液；
（3）制备金霉素发酵液，将步骤（2）中二级种子液接种于发酵罐内，30℃条件下发酵90 h即为金霉素发酵液（50m3）。
实施例2得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7312 kg。
对照例2
对照例2与实施例2的不同之处在于：发酵培养基中不添加木瓜蛋白酶，酵母粉的添加量为7.5g。
对照例2得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7282 kg。
实施例3
一种添加木瓜蛋白酶的金霉素发酵培养基，每1 L 培养基中的具体成分为：花生饼粉 24g、黄豆饼粉5g、玉米淀粉100g、玉米浆 10g、酵母粉4g、豆油5g、木瓜蛋白酶0.34g、淀粉酶 0.2g、氯化钠 3.5g、硫酸铵 5.5g、碳酸钙 8.0g、硫酸镁0.1g。
所述金霉素发酵培养基在金霉素发酵生产中应用，具体包括以下步骤：
（1）斜面菌丝培养，将斜面保藏的金色链霉菌孢子，32±1℃培养3天制备母瓶斜面菌丝；
（2）二级种子液制备，将步骤（1）中母瓶内斜面菌丝接种到一级种子罐中，33℃、110转/ 分下发酵20h 制备一级种子液；将一级种子液接种到二级种子罐中，33℃、110转/ 分下发酵4h 制备二级种子液；
（3）制备金霉素发酵液，将步骤（2）中二级种子液接种于发酵罐内，33℃条件下发酵90-114 h即为金霉素发酵液（50m3）。
实施例3得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7312 kg。
对照例3
对照例3与实施例3的不同之处在于：发酵培养基中不添加木瓜蛋白酶，酵母粉的添加量为8g。
对照例3得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7282 kg。
实施例4
一种添加木瓜蛋白酶的金霉素发酵培养基，每1 L 培养基中的具体成分为：花生饼粉 12g、黄豆饼粉15g、玉米淀粉80g、玉米浆 12g、酵母粉5g、豆油3.5g、木瓜蛋白酶0.32g、淀粉酶 0.15g、氯化钠 2.0g、硫酸铵 7g、碳酸钙 7.0g、硫酸镁0.15g。
所述金霉素发酵培养基在金霉素发酵生产中应用，具体包括以下步骤：
（1）斜面菌丝培养，将斜面保藏的金色链霉菌孢子，32±1℃培养5 天制备母瓶斜面菌丝；
（2）二级种子液制备，将步骤（1）中母瓶内斜面菌丝接种到一级种子罐中，32℃、140转/ 分下发酵22h 制备一级种子液；将一级种子液接种到二级种子罐中，32℃、140转/ 分下发酵4h 制备二级种子液；
（3）制备金霉素发酵液，将步骤（2）中二级种子液接种于发酵罐内，32℃条件下发酵95 h即为金霉素发酵液（50m3）。
实施例4得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7312 kg。
对照例4
对照例4与实施例4的不同之处在于：发酵培养基中不添加木瓜蛋白酶，酵母粉的添加量为10g。
对照例4得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7282 kg。
实施例5
一种添加木瓜蛋白酶的金霉素发酵培养基，每1 L 培养基中的具体成分为：花生饼粉 12g、黄豆饼粉10g、玉米淀粉80g、玉米浆 13g、酵母粉5g、豆油4.5g、木瓜蛋白酶0.32g、淀粉酶 0.13g、氯化钠3.1g、硫酸铵 7.5g、碳酸钙 7.6g、硫酸镁0.18g。
所述金霉素发酵培养基在金霉素发酵生产中应用，具体包括以下步骤：
（1）斜面菌丝培养，将斜面保藏的金色链霉菌孢子，32±1℃培养3天制备母瓶斜面菌丝；
（2）二级种子液制备，将步骤（1）中母瓶内斜面菌丝接种到一级种子罐中，26℃、140转/ 分下发酵26h 制备一级种子液；将一级种子液接种到二级种子罐中，26℃、140转/ 分下发酵8h 制备二级种子液；
（3）制备金霉素发酵液，将步骤（2）中二级种子液接种于发酵罐内，30℃条件下发酵124 h即为金霉素发酵液（50m3）。
实施例5得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7312 kg。
对照例5
对照例5与实施例5的不同之处在于：发酵培养基中不添加木瓜蛋白酶，酵母粉的添加量为12g。
对照例5得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7282 kg。
实施例6
一种添加木瓜蛋白酶的金霉素发酵培养基，每1 L 培养基中的具体成分为：花生饼粉 15g、黄豆饼粉5g、玉米淀粉75g、玉米浆 10g、酵母粉5g、豆油5g、木瓜蛋白酶0.30g、淀粉酶 0.1g、氯化钠 2.0g、硫酸铵 5.5g、碳酸钙8.0g、硫酸镁0.1g。
所述金霉素发酵培养基在金霉素发酵生产中应用，具体包括以下步骤：
（1）斜面菌丝培养，将斜面保藏的金色链霉菌孢子，32±1℃培养4 天制备母瓶斜面菌丝；
（2）二级种子液制备，将步骤（1）中母瓶内斜面菌丝接种到一级种子罐中，28℃、120转/ 分下发酵24h 制备一级种子液；将一级种子液接种到二级种子罐中，28℃、120转/ 分下发酵6h 制备二级种子液；
（3）制备金霉素发酵液，将步骤（2）中二级种子液接种于发酵罐内，31℃条件下发酵94 h即为金霉素发酵液（50m3）。
实施例6得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7312 kg。
对照例6
对照例6与实施例6的不同之处在于：发酵培养基中不添加木瓜蛋白酶，酵母粉的添加量为12.5g。
对照例6得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7282 kg。
实施例7
一种添加木瓜蛋白酶的金霉素发酵培养基，每1 L 培养基中的具体成分为：花生饼粉 20g、黄豆饼粉10g、玉米淀粉90g、玉米浆 10g、酵母粉3g、豆油2.5g、木瓜蛋白酶0.33g、淀粉酶 0.1g、氯化钠 1.0g、硫酸铵 8g、碳酸钙 5.6g、硫酸镁0.1g。
所述金霉素发酵培养基在金霉素发酵生产中应用，具体包括以下步骤：
（1）斜面菌丝培养，将斜面保藏的金色链霉菌孢子，32±1℃培养5 天制备母瓶斜面菌丝；
（2）二级种子液制备，将步骤（1）中母瓶内斜面菌丝接种到一级种子罐中，31℃、130转/ 分下发酵22h 制备一级种子液；将一级种子液接种到二级种子罐中，31℃、130转/ 分下发酵4～8h 制备二级种子液；
（3）制备金霉素发酵液，将步骤（2）中二级种子液接种于发酵罐内，32℃条件下发酵94 h即为金霉素发酵液（50m3）。
实施例7得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7312 kg。
对照例7
对照例7与实施例7的不同之处在于：发酵培养基中不添加木瓜蛋白酶，酵母粉的添加量为6g。
对照例7得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7282 kg。
实施例8
一种添加木瓜蛋白酶的金霉素发酵培养基，每1 L 培养基中的具体成分为：花生饼粉 25g、黄豆饼粉15g、玉米淀粉85g、玉米浆 10g、酵母粉1g、豆油5g、木瓜蛋白酶0.33g、淀粉酶 0.15g、氯化钠 2.5g、硫酸铵 6.5g、碳酸钙 7.6g、硫酸镁0.23g。
所述金霉素发酵培养基在金霉素发酵生产中应用，具体包括以下步骤：
（1）斜面菌丝培养，将斜面保藏的金色链霉菌孢子，32±1℃培养5 天制备母瓶斜面菌丝；
（2）二级种子液制备，将步骤（1）中母瓶内斜面菌丝接种到一级种子罐中，32℃、125转/ 分下发酵24h 制备一级种子液；将一级种子液接种到二级种子罐中，32℃、125转/ 分下发酵4h 制备二级种子液；
（3）制备金霉素发酵液，将步骤（2）中二级种子液接种于发酵罐内，35℃条件下发酵90h即为金霉素发酵液（50m3）。
实施例8得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7312 kg。
对照例8
对照例8与实施例8的不同之处在于：发酵培养基中不添加木瓜蛋白酶，黄豆饼粉的添加量为30g。
对照例8得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7282 kg。
实施例9
一种添加木瓜蛋白酶的金霉素发酵培养基，每1 L 培养基中的具体成分为：花生饼粉 20g、黄豆饼粉5g、玉米淀粉85g、玉米浆 12g、酵母粉5g、豆油4.5g、木瓜蛋白酶0.30g、淀粉酶 0.18g、氯化钠 2.5g、硫酸铵 6.8g、碳酸钙 6.9g、硫酸镁0.19g。
所述金霉素发酵培养基在金霉素发酵生产中应用，具体包括以下步骤：
（1）斜面菌丝培养，将斜面保藏的金色链霉菌孢子，32±1℃培养5 天制备母瓶斜面菌丝；
（2）二级种子液制备，将步骤（1）中母瓶内斜面菌丝接种到一级种子罐中，33℃、110转/ 分下发酵26h 制备一级种子液；将一级种子液接种到二级种子罐中，33℃、110转/ 分下发酵5h 制备二级种子液；
（3）制备金霉素发酵液，将步骤（2）中二级种子液接种于发酵罐内，35℃条件下发酵90h即为金霉素发酵液（50m3）。
实施例9得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7312 kg。
对照例9
对照例9与实施例9的不同之处在于：发酵培养基中不添加木瓜蛋白酶，酵母粉的添加量为10g。
对照例9得到的金霉素发酵液送到提炼车间进行提取，15%CTC的产量为7282 kg。
由上述实施例可知，本发明在发酵配方中，通过添加木瓜蛋白酶，降低有机氮源的加入量，提高有机氮源的利用率，使用的木瓜蛋白酶的加入比例为机氮源添加量的0.8～1.2%（W/W），发酵配方中酵母粉减少比例为50～60%（W/W），或者黄豆饼粉减少比例为50%（W/W），其它原料配比不变时，还能金霉素CTC的发酵产量略有提高。
通过以上数据分析，本发明通过添加木瓜蛋白酶，降低发酵配方中有机氮源的投入量，不仅没有降低金霉素CTC的发酵产量，而且本发明中CTC产量相对于对照略有提高；经过收益核算（只考虑原料成本收益）：木瓜蛋白酶按照最优比例加入（加入比例为机氮源添加量的1.0%（W/W）），有机氮源按目前市场价格黄豆饼粉4980元/吨，木瓜蛋白酶单价约为300000元/吨，安琪酵母粉12100元/吨计算，每罐可降低原料投入成本330～674元。
本发明提供了木瓜蛋白酶在金霉素发酵过程中的应用，通过在金霉素发酵配方中添加木瓜蛋白酶，减少抗生素发酵行业对原材料的大量使用，同时也避免了发酵过程中原材料未被充分利用而造成的大量浪费现象。