专利名称：：一种恰塔努加链霉菌及培养方法
技术领域：
：本发明属微生物领域，涉及一株恰塔努加链霉菌菌株LIO以及培养方法。
背景技术：
：纳他霉素是一种高效、广谱的抗真菌剂，属于大环内酯类抗生素，它能有效抑制几乎所有的酵母和霉菌的生长，阻止丝状真菌中黄曲霉毒素的形成。而且纳他霉素对哺乳动物细胞的毒性极低，很难被动物或人体的肠胃吸收,因为纳他霉素难溶于水和油脂，摄入的大部分随粪便排出。纳他霉素的溶解度低，可用其对食品表面进行处理以增加食品的保质期，却不影响食品的风味和口感。其实际使用剂量为10—6数量级，具有低剂量，高效率，抗菌作用时间长的特点，是一种高效、安全的天然生物防腐剂和抗菌剂。美国FDA(Foodanddrugadministrition)正式批准纳他霉素可用作食品防腐剂；美国FDA建议纳他霉素作为食品添加剂使用，还被归类为GRAS产品之列。我国1997年食品添加剂委员会对纳他霉素进行评价并建议批准使用，现已列入食品添加剂使用标准，其商品名称为霉克(NatamycinTM)。纳他霉素不仅在调味品、烘烤食品和乳酪食品等中作为食品防腐剂广泛应用，其抑菌作用比山梨酸强50倍左右，且不易引起靶标真菌形成抗性。而且还作为高效抗菌剂应用于滴眼液或软膏等中用来治疗真菌性角膜炎、脚藓等真菌性皮肤感染疾病。目前已经成为30多个国家使用的一种天然生物性食品防腐剂和抗菌添加剂。在工业上多采用褐黄孢链霉菌(Sfr^tom^^yg/Zvo^o^ws)发酵生长纳他霉素。
发明内容本发明的一个目的是提供一株恰塔努加链霉菌菌株，该菌株能产生纳他霉素。本发明所提供的链霉菌属为恰塔努加链霉菌(5^印tomycesctoto"oogm^)LIO，其已于2006年8月27日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏登记号为CGMCCNo.2644，具有SEQIDNOl的核苷酸序列，更具有具有SEQIDN02的核苷酸序列。本发明提供的L10菌株在ISP2琼脂培养基培养710天后，基内菌丝和气生菌丝发育良好，孢子丝柔曲，成熟的孢子链孢子个数在10个以上，孢子呈卵圆形，表面具刺。能同化利用D-葡萄糖、D-果糖、麦芽糖、蔗糖、甘油、肌醇和D-甘露醇，不能利用L-阿拉伯糖、D-木糖、L-鼠李糖、棉子糖、山梨醇和醋酸钠。明胶液化，牛奶凝固。淀粉水解。不产生类黑色素和H2S。本发明的另一个目的是提供该恰塔努加链霉菌的培养方法，通过以下步骤实现(1)固体培养把恰塔努加链霉菌LIO(CGMCCNo.2644)菌株接种于斜面培养基中，于25'C培养箱中培养7天，并于常温下放置10天；(2)液体培养斜面培养后，将菌丝体接种于种子培养基中，在3(TC摇床上培养24小时，转速250rpm，先一级种子培养24小时，再二级种子培养24小时，两级种子培养的条件相同，然后再接种至发酵培养基中，接种量10%(V/V)，培养96小时，即得。步骤(1)所述的斜面培养基为酵母提取物0.4%,麦芽提取物1%,葡萄糖0.4%，琼脂糖1.5~2%,其余为水，pH值调至6.0，所述百分含量均为质量百分步骤(2)所述的种子培养基为葡萄糖1.75%，蛋白胨1.5%,NaCl1.0%，其余为水，所述百分含量均为质量百分含量，pH自然。步骤(2)所述的发酵培养基为生黄豆饼粉2.8%，酵母粉0.7%，葡萄糖6%，其余为水，所述百分含量均为质量百分含量，pH自然。本发明的再一个目的是提供该菌株在产生纳他霉素中的应用。本发明的有益之处(优点或特点)是本发明提供了一种新的恰塔努加链霉菌，命名为S^eptomycesc/z""awoogera^L10,以及该菌的培养方法。本发明提供的菌株能产生纳他霉素，可在制备广谱的抗真菌剂、制备生物性食品防腐剂和抗菌添加剂中应用。图1是恰塔努加链霉菌L10在光学显微镜(1000x)下孢子丝的形态照片。图2是恰塔努加链霉菌L10在扫描电子显微镜(7700x)下孢子的形态照片。图3是以恰塔努加链霉菌L10和相关菌种的16SrDNA序列构建的系统进化树。图4是以恰塔努加链霉菌L10和相关菌种的r/7oB(RNA聚合酶p亚基)基因序列构建的进化树。具体实施例方式本发明结合附图和具体实施例作进一步的说明。下述实施例中的实验方法4如无特殊说明均为常规方法。实施例中所使用的培养基1.斜面培养基酵母提取物0.4%，麦芽提取物1°/。,葡萄糖0.4%，琼脂糖1.52y。，其余为水,pH值调至6.0，所述百分含量均为质量百分含量。2.种子培养基葡萄糖1.75%，蛋白胨1.5%，NaC11.0%，其余为水，所述百分含量均为质量百分含量，pH自然。3.发酵培养基生黄豆饼粉2.8%，酵母粉0.7%，葡萄糖6%，其余为水，所述百分含量均为质量百分含量。pH自然。实施例lL10的微生物学特性鉴定(1)菌体的形态特征菌株L10在ISP2琼脂培养基培养710d后，基内菌丝和气生菌丝发育良好，孢子丝柔曲或弯曲，成熟的孢子链孢子个数在10个以上(见附图l)，孢子呈卵圆形，表面具刺(见附图2)。在各种不同的培养基中的表观特征，结果见表hL10的生理生化特性见表2.(2)表l:菌株L10的培养特性:<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注"W"表示弱阳性结果，"+"表示阳性结果，"一"表示阴性结果(4)16SrDNA序列与rpoB序列系统进化分析菌株LIO的近似全长的16SrDNA序列如序列表中SEQIDNO1所示，与GenBank中相关序列Blast比较结果表明其属于链霉菌属；其已知16SrDNA序列(1521bp)中1459bp与恰塔努加链霉菌菌株C^r卬tomycesc/ia^awoogem^)NBRC12754在数据库中保存的1459bp的序列相似性达到100%，与利迪链霉菌菌株((幼印tow少ces/;^'c^)NBRC13058相似性为99.93%(1480/1481bp)，与恰塔努加链霉菌菌株(&r^tow少cesc/2a/to"00gew&)DSM40002相似性为99.79%(1481/1484bp)，与褐黄孢链霉菌菌株(5^eptomycesg"vos/orews)ATCC13326相似性为99.23%(1421/1432bp)，与纳塔尔链霉菌菌株(5"加/7to附KM""to/ms&)NBRC13367相似性为99.32%(1474/1484bp)，以恰塔努加链霉菌L10和相关菌种的16SrDNA序列构建的系统进化树见附图3。菌株L10的部分rpoB基因序列如序列表中SEQIDNO2所示，与Blast比较结果表明其与与褐黄孢链霉菌菌株OS^甲/om;;cesg//vos/om^)ATCC13326相似性为99.14%(347/350bp)，与恰塔努加链霉菌菌株(5^印towycesc/z"to"oogew^)ATCC13358相似性为98.37%G01/306bp)。以恰塔努加链霉菌L10和相关菌种的^7oB(RNA聚合酶卩亚基)基因序列构建的进化树见附图4。菌株L10与邻近几株链霉菌菌株的形态与生理生化特性比较见表3。表3:菌株L10和邻近几株链霉菌菌株的形态与生理生化特性比较DataforreferencestrainsweretakenfromShiriing&Gottlieb(1972),Karwowskietal(1992)andLinetal(1993)_<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table><formula>formulaseeoriginaldocumentpage7</formula>注意"+"表示阳性结果，"一"表示阴性结果，"ND"表示该项指标为检测或没有数据，"Smooth"表示孢子表面光滑，"Spiny"表示孢子表面带小刺，"Spirales"表示孢子丝呈螺旋形，"Flexuous"表示孢子丝呈柔曲状。综合其形态学、培养特性、生理生化、16SrDNA序列和rpoB序列分析结果，将其鉴定为恰塔努加链霉菌(S^/7tom>;cMc/w"flwoogm^)的一个变种，并将其命名为恰塔努加链霉菌(5^印tom;;casc/zato"oogm^)L10。恰塔努加链霉菌(5^e;tow少cesc/w"a"ooge似/s)L10已于2008年8月27日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏登记号为CGMCCNo.2644。实施例2L10菌株的培养方式为(1)固体培养把菌种接种于斜面培养基中，于25"C培养箱中培养7天;并于常温下放置10天。(2)液体培养斜面培养后，菌丝体接种于种子培养基中，在3(TC摇床上培养24小时，转速250rpm。一级种子培养24后接种于二级种子培养基中以相同的条件进行培养。二级种子培养24小时后接种至发酵培养基中，接种量10%(V/V)，培养96小时，即得。本发明涉及的序列<110>浙江大学，浙江震元制药有限公司<120>—株恰塔努加链霉菌菌株及培养方法<160>2<210>1<211>1521<212>DNA<213>恰塔努加链霉菌CSfrepto附jcasc/Mf"awooge"s/5^L10<400>1agagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcttaacacatgcaagtcgaac60gatgaacctccttcgggaggggattagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggcaatctg120cccttcactctgggacaagccctggaaacggggtctaataccggatacgacacggggtcg180catgacctccgtgtggaaagctccggcggtgaaggatgagcccgcggcctatcagcttgt240tggtggggtgatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggcgaccggcc300acactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcac360aatgggcgaaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaa420cctctttcagcagggaagaagcgagagtgacggtacctgcagaagaagcgccggctaact480acgtgccagcagccgcggtaatacgtagggegcaagcgttgtccggaattattgggcgta540aagagctcgtaggcggcttgtcacgtcggatgtgaaagcccggggcttaaccccgggtct600gcattcgatacgggcaggctagagttcggtaggggagatcggaattcctggtgtagcggt660gaaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcggatctctgggccgatactg720acgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccg780taaacgttgggaactaggtgtgggcgacattccacgtcgtccgtgccgcagctaacgcat840taagttccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggc900ccgcacaagcagcggagcatgtggcttaattcgacgcaacgcgaagaaccttaccaaggc960ttgacatacaccggaaaaccctggagacagggtcccccttgtggtcggtgtacaggtggt1020gcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaac1080ccttgttctgtgttgccagcatgcccttcggggtgatggggactcacaggagactgccgg1140ggtcaactcggaggaaggtggggacgacgtcaagtcatcatgccccttatgtcttgggct1200gcacacgtgctacaatggccggtacaatgagctgcgataccgcgaggtggagcgaatctc1260aaaaagccggtctcagttcggattggggtctgcaactcgaccccatgaagtcggagttgc1320tagtaatcgcagatcagcattgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcc1380cgtcacgtcacgaaagtcggtaacacecgaagccggtggcccaaccccttgtgggaggga1440atcgtcgaaggtgggactggcgattgggacgaagtcgtaacaaggtagccgtaccggaag1500gtgcggctggatcacctcctt1521<210>2<211>352<212>DNA<213>恰塔努加链霉菌(^reptom;;casc/2a"a"ooge"s&JL10<400>2cgatcgggcacatgcggccgtagtgcgaggggtgcacgtcacggacgtccaggccggccc60gctcacgggagagaccacccgggcccagcgccaacagacggcgcttgtgggtcagacccg120acagcgggttggtctggtccatgaattgggacagctggctggtgccgaagaactccttga180tggaggcgacgaccggccggatgttgatcagggtctgcggcgtgatcgcctcgacgtcct240gggtggtcatgcgctcgcgcacgacgcgctccatacgggcgagacccgtacggacctggt300tctggatgagctcgccgacgttgcgcagacggcggttgccgaagtggtcgaa35权利要求1.一种恰塔努加链霉菌，其特征在于所述恰塔努加链霉菌命名为StreptomyceschattanoogensisL10，其已于2006年8月27日保藏于中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心，保藏登记号为CGMCCNo.2644，其核苷酸序列是SEQIDNO1。2.根据权利要求1所述的一种恰塔努加链霉菌，其特征在于所述恰塔努加链霉菌的核苷酸序列是SEQIDNO2。3.根据权利要求1所述的恰塔努加链霉菌的培养方法，其特征在于通过以下步骤实现(1)固体培养把恰塔努加链霉菌LIO的菌株接种于斜面培养基中，于25'C培养箱中培养7天，并于常温下放置10天；(2)液体培养斜面培养后，将菌丝体接种于种子培养基中，在3(TC摇床上培养24小时，转速250rpm,—级种子培养24小时后接种于二级种子培养基中以相同的条件进行培养，二级种子培养24小时后接种至发酵培养基中，接种量10%(V/V)，培养96小时，即得。4.根据权利要求3所述的恰塔努加链霉菌的培养方法，其特征在于步骤(l)所述的斜面培养基为酵母提取物0.4%，麦芽提取物1%，葡萄糖0.4%，琼脂糖1.52%，其余为水，pH值调至6.0，所述百分含量均为质量百分含量。5.根据权利要求3所述的恰塔努加链霉菌的培养方法，其特征在于步骤(2)所述的种子培养基为葡萄糖1.75%，蛋白胨1.5%，NaCll.0%,其余为水，所述百分含量均为质量百分含量。6.根据权利要求3所述的恰塔努加链霉菌的培养方法，其特征在于步骤(2)所述的发酵培养基为生黄豆饼粉2.8%，酵母粉0.7%，葡萄糖6%，其余为水，所述百分含量均为质量百分含量。7.根据权利要求1或2所述的一种恰塔努加链霉菌在产生纳他霉素中的应用。全文摘要本发明提供一种恰塔努加链霉菌，命名为StreptomyceschattanoogensisL10，保藏登记号为CGMCCNo.2644，具有SEQIDNO1的核苷酸序列。本发明首先将恰塔努加链霉菌株接种于斜面培养基中固体培养，再将菌丝体接种于种子培养基中进行二级培养，然后再接种至发酵培养基中进行液体培养。本发明提供的菌株能产生纳他霉素，可在制备广谱的抗真菌剂、制备生物性食品防腐剂和抗菌添加剂中应用。文档编号C12P19/00GK101423810SQ200810162820公开日2009年5月6日申请日期2008年12月11日优先权日2008年12月11日发明者李永泉,杜艺岭,樊伟明,程良英,陈时飞申请人:浙江大学;浙江震元制药有限公司