一种用于制备感受态细胞的缓冲液及制备感受态细胞的方法与流程

本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种用于制备感受态细胞的缓冲液及制备感受态细胞的方法。
背景技术：
：外源dna转化受体菌的方法是分子生物学研究中最常用的方法之一，外源dna包括质粒和连接载体。外源dna必须转入适当的受体菌进行繁殖，才能获得大量的阳性重组子克隆或表达目的基因产物。现有的是将受体菌培养于lb平板培养基中，挑取单菌落接种于sob(superoptimalbroth)摇瓶培养基中发酵，实现单菌落的繁殖，18℃振荡培养至od600值为0.6，冰浴10min，4℃下离心10min，菌体悬浮于预冷的tb缓冲液中，冰浴10min，4℃下离心10min，菌体悬浮于预冷的tb缓冲液中，并加入1.5m浓度为7％的二甲亚砜，冰浴10min后，得到感受态细胞并分装保存。其中，tb缓冲液为包括哌嗪-1,4-二乙磺酸、氯化钙、氯化钾和氯化镁的水溶液，且tb缓冲液包括：浓度为10mm的哌嗪-1,4-二乙磺酸，浓度为15mm的氯化钙、浓度为250mm的氯化钾和浓度为55mm的氯化镁。tb缓冲液中的ca2+的作用主要是破坏细胞膜上的脂质阵列，并与细胞膜上的多聚羟基丁酸化合物和多聚无机磷酸形成复合物以利于外源dna的渗入，再通过42s热休克促使细胞能够吸收外源dna。该方法转化长度为7000bp以上的连接载体时，很难获得的阳性重组子克隆。技术实现要素：为了解决现有技术化学法制备感受态细胞转化效率低的问题，本发明实施例提供了一种用于制备感受态细胞的缓冲液及制备感受态细胞的方法。所述技术方案如下：一方面，本发明实施例提供了一种用于制备感受态细胞的缓冲液，所述缓冲液为包括哌嗪-1,4-二乙磺酸、n,n-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、氯化钙、氯化钾和氯化锰的水溶液，所述缓冲液的ph值为6.0～7.0，所述缓冲液中哌嗪-1,4-二乙磺酸、n,n-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、氯化钙、氯化钾和氯化锰的浓度分别为11～30mm、3～20mm、5～25mm、50～300mm和10～50mm。具体地，所述缓冲液中哌嗪-1,4-二乙磺酸、n,n-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、氯化钙、氯化钾和氯化锰的浓度分别为12～20mm、5～15mm、10～20mm、150～250mm和30～40mm，所述缓冲液的ph值为6.7。更具体地，所述缓冲液中哌嗪-1,4-二乙磺酸、n,n-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、氯化钙、氯化钾和氯化锰的浓度分别为15mm、10mm、15mm、200mm和35mm。另一方面，本发明实施例提供了一种采用上述缓冲液制备感受态细胞的方法，所述方法包括：繁殖受体菌的单克隆并离心，得到第一沉淀物；将所述第一沉淀物用所述缓冲液重悬，得到第一重悬液；将所述第一重悬液冰浴后离心，去上清液，得到第二沉淀物；将所述第二沉淀物用所述缓冲液重悬，得到第二重悬液；将所述第二重悬液离心，去上清液，得到第三沉淀物；将所述第三沉淀物置于所述缓冲液和所述二甲基亚砜的混合液中进行重悬，冰浴20～30min后，得到感受态细胞。发明人意外地发现，采用本发明实施例所述缓冲液化学法制备感受态细胞，同时延长第三沉淀物置于所述缓冲液和所述二甲基亚砜的混合液中进行重悬后冰浴时间由通常的10min延长至20～30min后，所得感受态细胞转化效率大大提高。具体地，所述第一沉淀物与所述缓冲液的体积比125:(4～8)。具体地，所述第二沉淀物与所述缓冲的体积比为(2～3):1。具体地，将所述第三沉淀物置于预冷后的所述缓冲液和二甲基亚砜的混合液进行重悬，所述第三沉淀物、所述缓冲液和所述二甲基亚砜的体积比为200:93:7。进一步地，预冷的所述缓冲液和二甲基亚砜的混合液的温度为4℃。具体地，受体菌的单克隆的制备方法可以选用现有技术中公知的方法进行制备，例如将所述受体菌的菌液涂布在平板培养基上，将所述平板培养基倒置于37℃下培养，直至在所述平板培养基上出现单克隆。具体地，所述繁殖所述受体菌的单克隆并离心包括：挑取所述单克隆置于soc摇瓶培养基中，在15～20℃下振荡培养至od600值为0.6；将培养后的所述soc摇瓶培养基置于冰上10min后离心。本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的缓冲液用于制备化学法感受态细胞时，其中氯化钙、氯化钾和氯化锰中的阳离子均可以刺激受体菌，使受体菌变成容易接受外源dna的形态，哌嗪-1,4-二乙磺酸可以稳定受体菌的细胞活性，通过添加n,n-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸能够在保证细胞活性的前提下，增加细胞膜的通透性，从而使制备的感受态细胞的转化效率大大提高，且所得感受态细胞能够适用于长片段的转化；同时，本发明实施例提供的制备方法能够高效快速地制备感受态细胞。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1是本发明实施例一提供的感受态细胞的转化效率检测图；图2是本发明实施例一提供的感受态细胞的蓝白斑筛选实验图。图3是本发明实施例一提供的商业化的感受态细胞的蓝白斑筛选实验图；图4是本发明实施例一提供的感受态细胞的获得的重组质粒pcr检测结果图，图中，泳道1和2是随机挑选本发明实施例一提供的感受态细胞转化后的白色菌落pcr检测结果，泳道3是al15000的marker，泳道4和5是商业化的感受态细胞转化后获得的菌落pcr检测结果；图5是本发明实施例一提供的感受态细胞的获得的重组质粒的双酶切检测结果，图中，泳道1和6分别是al15000和al5000的marker，泳道2和3利用是本发明实施例一提供的感受态细胞获得的重组质粒双酶切结果，泳道4和5是利用商业化制备的感受态细胞重组质粒的双酶切结果；图6是本发明实施例二提供的感受态细胞的转化效率检测图；图7是本发明实施例三提供的感受态细胞的转化效率检测图。具体实施方式为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明实施方式作进一步地详细描述。本发明实施例中所用试剂均为市售试剂，其中，哌嗪-1,4-二乙磺酸、n,n-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸均为生化试剂，均购于武汉时代博驰科技有限公司；氯化钙、氯化钾、氯化锰和氢氧化钾均为分析纯化学试剂，均购于武汉时代博驰科技有限公司。实施例一本发明实施例提供了一种用于制备感受态细胞的缓冲液，该缓冲液为包括哌嗪-1,4-二乙磺酸、n,n-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、氯化钙、氯化钾和氯化锰的水溶液，该缓冲液的ph值为6.7，在本实施例中，向缓冲液中加入4.5354g哌嗪-1,4-二乙磺酸、2.1325gn,n-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、1.6647g氯化钙、14.9102g氯化钾和5.6656g氯化锰，加水1000ml，使得哌嗪-1,4-二乙磺酸、n,n-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、氯化钙、氯化钾和氯化锰的浓度分别为15mm、10mm、15mm、200mm和35mm，在制备缓冲液时，用氢氧化钾调节缓冲液的ph值，并过滤除菌，将制备好的缓冲液保存于4℃待用，通过氢氧化钾调节缓冲液的ph值能够保证制备出的感受态细胞的感受态活性。在本实施例中选择的受体菌为大肠杆菌，具体为大肠杆菌dh5α，购于takara公司。将受体菌的菌液涂布在平板培养基上，将平板培养基(成分参照molecularcloning:alaboratorymannual)倒置于37℃下过夜培养，直至在平板培养基上出现单克隆；挑取单克隆置于装有摇瓶培养基的摇瓶中，1l摇瓶装有500ml摇瓶培养基，且摇瓶培养基为soc(superoptimalbrothwithcataboliterepression)摇瓶培养基(成分参照molecularcloning:alaboratorymannual)，在15℃下振荡培养至od600值为0.6，且振荡时的转速为100-110rpm；将培养后的soc摇瓶培养基置于冰上10min，再将soc摇瓶培养基于4℃条件下离心10min，且离心转速为2500rpm，去上清液，得到第一沉淀物；将500ml第一沉淀物用本实施例提供的16ml缓冲液重悬，得到第一重悬液；将第一重悬液冰浴10min后于4℃条件下离心10min，且离心转速为2500rpm，去上清液，得到第二沉淀物；将16ml第二沉淀物用实施例一提供的8ml缓冲液重悬，得到第二重悬菌液；将第二重悬液4℃条件下离心10min，且离心转速为2500rpm，去上清液，得到第三沉淀物；将8ml第三沉淀物置于预冷后的实施例一提供的3.72ml缓冲液和0.28ml二甲基亚砜的混合液中进行重悬，冰浴30min后，预冷的缓冲液和二甲基亚砜的混合液的温度为4℃，得到感受态细胞。将制备好的感受态细胞保存于-70℃待用。将所得的感受态细胞用于长度为3000bp的质粒(该质粒为pgem(r)-teasyvector)转化，转化过程参考molecularcloning:alaboratorymannual中的标准转化流程，共获得转化子8758个，转化效率为8.758×109cfu/μg，其实验结果如图1所示，由此可见，该感受态细胞的转化效率很高。将连接载体转入实施例一所获得的感受态细胞进行蓝白斑筛选实验，其中，连接载体总长度为8100bp，该连接载体包括长度为5100的质粒(来自于自于拟南芥pwr基因编码区克隆)和t载体(pgem-t-easy，购置于promega公司)连接而成(连接载体的制备方法为：5μl2×buffer、1μlt4ligase、1μlpgem-teasyvector、3μl拟南芥pwr基因编码区克隆组成10μl的连接反应体系，于4℃条件下进行过夜连接反应，从而得到连接载体)，其实验结果如图2所示，由图2可见，其能够同时获得白色和蓝色的菌落。同时，将商业化的感受态细胞(购买于北京康为世纪生物科技有限公司)的按照同样的方法制备连接载体，并将其进行蓝白斑筛选实验，其实验结果如图3所示，由图3可见，其仅获得蓝色的菌落(由于图片调整为灰色图片，使得蓝色的菌落显示为灰色的菌落)，结合图2和图3可知，连接载体转入本发明实施例一提供的感受态细胞后能够得到白色的菌落(阳性克隆)，而连接载体转入商业化的感受态细胞后则未能够得到白色的菌落，由此可见，本发明实施例提供的感受态细胞能够转化长片段质粒，而商业化的感受态细胞则不能转化长片段质粒。将上述两种转化子随机挑选菌落，并进行菌落pcr(polymerasechainreaction，聚合酶链式反应简称)检测，操作方法参考molecularcloning:alaboratorymannual中的标准菌落pcr检测流程，反应体系如表1所示。菌落pcr反应中所用的引物包括序列表中seqidno:1所示的上游引物和序列表中seqidno:2所示的下游引物，其中，pcr反应试剂2×longtaqmastermix购于北京艾德莱公司。表1为pcr扩增的反应体系试剂体积(μl)ddh2o8.22×longtaqmastermix10上游引物(10μm)0.4下游引物(10μm)0.4模板1pcr扩增的反应体系共20μl。将表1中的pcr扩增的反应体系按照如下pcr反应程序进行：pcr扩增的程序为：95℃预变性5min；94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸5min30s，扩增35个循环，循环结束后于72℃延伸10min。pcr扩增结束后，得到pcr扩增产物，吸取10μlpcr扩增产物进行浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳检测。其检测结果如图4所示，由图4可知，仅有本发明实施例提供的感受态制备的转化子的pcr检测结果是阳性。而商业化的感受态细胞制备的转化子则为阴性。由此可见，本发明实施例提供的感受态细胞能够转化长片段质粒，而商业化的感受态细胞则不能转化长片段质粒。进一步地，利用琼脂糖电泳对本发明实施例一提供的感受态细胞获得的重组质粒和商业化制得的感受态细胞的获得的重组质粒分别提取质粒后进行双酶切检测。具体方法为：挑取单克隆菌落，在液体培养基中进行扩大培养，然后利用质粒小提试剂盒(购于北京艾德莱公司)，获得重组质粒。利用限制性内切酶(购于neb公司)对重组质粒进行双酶切检测，酶切反应体系如表2所示表2为双酶切反应体系将上述双酶切反应体系于37℃过夜酶切，然后进行浓度为1％的琼脂糖电泳鉴定，鉴定结果如图5所示，由图5可知，仅有本发明实施例提供的感受态细胞随机挑选的白色克隆的双酶切结果是阳性，这进一步证明本发明实施例提供的感受态细胞能成功将长片段质粒转入。实施例二本发明实施例提供了一种用于制备感受态细胞的缓冲液，该缓冲液为包括哌嗪-1,4-二乙磺酸、n,n-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、氯化钙、氯化钾和氯化锰的水溶液，该缓冲液ph值为6.0，在本实施例中，向1l缓冲液中加入3.326g哌嗪-1,4-二乙磺酸、0.6398gn,n-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、0.5549g氯化钙、3.7276g氯化钾和1.6187g氯化锰，加水1000ml，使得哌嗪-1,4-二乙磺酸、n,n-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、氯化钙、氯化钾和氯化锰的浓度分别为11mm、3mm、5mm、50mm和10mm。将制备好的缓冲液保存于4℃待用。在本实施例中选择的受体菌为大肠杆菌，具体为大肠杆菌dh5α。将受体菌的菌液涂布在平板培养基上，将平板培养基倒置于37℃下过夜培养，直至在平板培养基上出现单克隆；挑取单克隆置于装有soc摇瓶培养基的摇瓶中，1l摇瓶装有500ml的soc摇瓶培养基，在20℃下振荡培养至od600值为0.6，且振荡时的转速为100-110rpm；将培养后的soc摇瓶培养基置于冰上10min，再将soc摇瓶培养基于4℃条件下离心10min，且离心转速为2500rpm，去上清液，得到第一沉淀物；将500ml第一沉淀物用实施例二提供的32ml缓冲液重悬，得到第一重悬液；将第一重悬液冰浴10min后于4℃条件下离心10min，且离心转速为2500rpm，去上清液，得到第二沉淀物；将16ml第二沉淀物用实施例二提供的8ml缓冲液重悬，得到第二重悬菌液；将第二重悬液4℃条件下离心10min，且离心转速为2500rpm，去上清液，得到第三沉淀物；将8ml第三沉淀物置于预冷后的实施例二提供的3.72ml缓冲液和0.28ml二甲基亚砜的混合液中进行重悬，冰浴20min后，预冷的缓冲液和二甲基亚砜的混合液的温度为4℃，8ml重悬菌液形成的第三沉淀物，得到感受态细胞。将制备好的感受态细胞保存于-70℃待用。将所得的感受态细胞用于质粒(与实施例一的质粒相同)转化，转化过程参考molecularcloning:alaboratorymannual中标准转化流程，共获得转化子1050个，转化效率为1.05×109cfu/μg，其实验结果如图6所示。实施例三本发明实施例提供了一种用于制备感受态细胞的缓冲液，该缓冲液为包括哌嗪-1,4-二乙磺酸、n,n-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、氯化钙、氯化钾和氯化锰的水溶液，该缓冲液ph值为7.0，在本实施例中，向缓冲液中加入9.0708g哌嗪-1,4-二乙磺酸、4.265gn,n-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、2.7745g氯化钙、22.3653g氯化钾和8.094g氯化锰，加水1000ml，使得哌嗪-1,4-二乙磺酸、n,n-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸、氯化钙、氯化钾和氯化锰的浓度分别为30mm、20mm、25mm、300mm和50mm，在制备缓冲液时，用氢氧化钾调节缓冲液的ph值，并过滤除菌，将制备好的缓冲液保存于4℃待用。在本实施例中选择的受体菌为大肠杆菌，具体为大肠杆菌dh5α。将受体菌的菌液涂布在平板培养基上，将平板培养基倒置于37℃下过夜培养，直至在平板培养基上出现单克隆；挑取单克隆置于装有soc摇瓶培养基的摇瓶中，1l摇瓶装有500ml的soc摇瓶培养基，在18℃下振荡培养至od600值为0.6，且振荡时的转速为100-110rpm；将培养后的soc摇瓶培养基置于冰上10min，再将soc摇瓶培养基于4℃条件下离心10min，且离心转速为2500rpm，去上清液，得到第一沉淀物；将500ml第一沉淀物用实施例三提供的20ml缓冲液重悬，得到第一重悬液；将第一重悬液冰浴10min后于4℃条件下离心10min，且离心转速为2500rpm，去上清液，得到第二沉淀物；将24ml第二沉淀物用实施例三提供的8ml缓冲液重悬，得到第二重悬菌液；将第二重悬液4℃条件下离心10min，且离心转速为2500rpm，去上清液，，得到第三沉淀物；将8ml第三沉淀物置于预冷后的实施例三提供的3.72ml缓冲液和0.28ml二甲基亚砜的混合液中进行重悬，冰浴25min后，预冷的缓冲液和二甲基亚砜的混合液的温度为4℃，得到感受态细胞。将制备好的感受态细胞保存于-70℃待用。将所得的感受态细胞用于质粒(与实施例一的质粒相同)转化，转化过程参考molecularcloning:alaboratorymannual中标准转化流程，共获得转化子2467个，转化效率为2.467×109cfu/μg，其实验结果如图7所示。本发明实施例提供的缓冲液用于制备化学法感受态细胞时，其中氯化钙、氯化钾和氯化锰中的阳离子均可以刺激细菌细胞，使受体菌变成容易接受外源dna的形态，哌嗪-1,4-二乙磺酸可以稳定细胞活性，通过添加n,n-(2-羟乙基)-2-氨基乙磺酸能够在保证细胞活性的前提下，增加细胞膜的通透性，从而使制备的感受态细胞的转化效率大大提高，且所得感受态细胞能够适用于长片段(如片段长度为8100bp的连接载体)的转化，增加细胞膜的通透性后使得短片段更容易转入该感受态细胞中；同时，本发明实施例提供的制备方法能够高效快速地制备感受态细胞。以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。序列表<110>江汉大学<120>一种用于制备感受态细胞的缓冲液及制备感受态细胞的方法<160>2<170>patentinversion3.4<210>1<211>25<212>dna<213>人工序列<400>1ttttttcttcagcggtgaaatctcc25<210>2<211>25<212>dna<213>人工序列<400>2ctctgctacaccatttacccctcct25当前第1页12