鞘氨醇单胞菌及用其生产类胡萝卜素的方法与流程

本发明涉及生物技术领域，具体涉及类胡萝卜素制备领域，更具体地，涉及一种念珠藻黄素生产菌鞘氨醇单胞菌，以及用其生产类胡萝卜素的方法。

背景技术：

类胡萝卜素是高度不饱和多烯类化合物，含有一系列共轭双键和甲基支链。色素的颜色随着共轭双键的数目而变化。由于类胡萝卜素独特的化学结构，它们在医疗保健领域起着重要作用。类胡萝卜素具有抗氧化作用，能够清除单线态氧和过氧化自由基，降低自由基对核酸、蛋白质和脂类等的损伤，从而延缓衰老和预防血栓,动脉硬化等疾病。类胡萝卜素具有增强免疫功能的作用，提高t淋巴细胞的活力，协助b淋巴细胞产生抗体。许多医学研究表明，类胡萝卜素在预防心血管疾病、抗癌防癌等方面起着十分重要的作用。目前，类胡萝卜素作为食用色素、着色剂、营养增补剂等被广泛应用在食品、保健品等领域。然而，动物和人体并不能合成类胡萝卜素，主要依赖饮食中类胡萝卜素的供应。随着类胡萝卜素药用价值的不断发现，人类对类胡萝卜素的种类和产量需求越来越大，但现在采用的微生物如薇藻，细菌等发酵制备天然类胡萝卜素成本较高，产量较低，还有很大的提升空间。

鞘氨醇单胞菌属是一类丰富的新型微生物资源，其在地球上分布及其广泛，在各种水体，土壤，大气以及极端环境都有它存在的踪影。鞘氨醇单胞菌生长环境粗糙，生长迅速，操作方便，培养条件易于控制，能够利用生物反应器实现大规模培养且不易污染。大多数的鞘氨醇单胞菌会产生一种叫念珠藻黄素的黄色类胡萝卜素，念珠藻黄素是一种β-胡萝卜素的聚羟基衍生物，其生物合成步骤为：牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸→八氢番茄红素→番茄红素→β胡萝卜素→玉米黄素→念珠藻黄素，催化酶依次为crte，crti，crty,crtz，crtg,其中crtg还可以β胡萝卜素为底物，在β环2’位加羟基。目前只在某种原核生物及一些蓝细菌中发现了这种罕见类胡萝卜素，由于念珠藻黄素在自然界的存在量有限，至今还未对它进行深入的功能研究。本发明分离得到的鞘氨醇单胞菌念珠藻黄素含量高，可达3.98±0.5mg/g，占总色素的90％及以上，具有极大的工业化生产潜力，也可为念珠藻黄素功能研究提供较好的基础条件。

玉米黄质是眼睛晶状体中仅有的2种类胡萝卜素之一，是一种强氧化剂，它可以淬灭单线态氧和光敏剂的三重态，清除损害性氧自由基，防止膜脂过氧化，减少脂褐素的形成，进而防止白内障的形成。如果没有正常功能的黄斑区，认得主要视力功能会逐渐损坏，甚至有失明的危险。在黄斑区中心点，入射光最强，产生的活性氧也最多。大量流行病学研究结果也表明，玉米黄质具有特异性吸收对视网膜最具损伤性的蓝色光线的作用，从而保护视网膜中央凹的视锥细胞。许多研究表明，短期增加玉米黄质的摄入量，可以使黄斑色素增加，从而增强黄斑区对抗有害物质和光射线损害的能力，预防和减缓老年性黄斑变性。另外，玉米黄质本身具有很高的营养价值，对促进人体的生长发育、保护视力与上皮细胞、提高抗病能力、延长寿命等具有特殊的功效。而人体并不能合成玉米黄质，必须从饮食中获取。

虾青素，是一种独特的酮式类胡萝卜素，也是类胡萝卜素合成的最高级别产物，呈深粉红色，化学结构类似于β-胡萝卜素。而β-胡萝卜素、叶黄素、角黄质等都是类胡萝卜素合成的中间产物。虾青素具有极强的抗氧化活性，广泛存在于生物界，特别是虾、蟹、鱼、藻体，是海洋生物内主要的类胡萝卜素之一。虾青素最初被用作水产业的饲料添加剂，后来人们发现它具有极强的抗氧化活性、增强机体免疫力活性及抗肿瘤活性，在食品、医药和化妆品等领域中有着广阔的应用前景。到目前为止，虾青素的来源主要有：化学合成、从甲壳类动物的废弃物中提取、雨生红球藻、红发夫酵母。化学合成的动物利用率低；甲壳类动物的废弃物提取成本高，产量低；雨生红球藻生长条件苛刻，周期长，占地面积大。所以有必要寻找新型虾青素生产来源。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种鞘氨醇单胞菌，一种类胡萝卜素生产菌株的培育方法,及其在生产类胡萝卜素中的应用；同时还提供类胡萝卜素无色八氢番茄红素生产菌sp-phy，红色番茄红素生产菌sp-lyc，深黄色玉米黄素生产菌sp-zea的培育方法，在工业化生产类胡萝卜素中的应用；虾青素生产菌株的培育方法所得虾青素生产菌株sp-ast，及其在在工业化生产虾青素中的应用。

为了实现本发明的上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

一种鞘氨醇单胞菌，保藏号为cgmccno.12394。

类胡萝卜素生产菌株的培育方法,该方法包括下述步骤：

(1)菌种准备：以念珠藻黄素生产菌保藏号为cgmccno.12394的鞘氨醇单胞菌野生型菌株为出发菌株，将鞘氨醇单胞菌出发菌株接种至lb琼脂培养基斜面中培养，培养温度为25-28℃，培养时间为40-48h；从活化的斜面上挑一环菌体接种到tb培养基中摇瓶振荡培养12-20h，tb培养基为酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5，使od600＝0.7-0.9；得到培养菌液后，取培养菌液10ml离心，得到菌体，用等体积磷酸缓冲盐溶液将菌体洗涤2次，将洗涤后的菌液离心收集；

(2)ntg诱变：向(1)得到的菌体中加入10ml磷酸缓冲盐溶液，再加入0.05-0.2mg/mlntg，在20-25℃,60-80rpm摇床中避光处理20-30min，取出用ntg处理后的液体，离心收集菌体，用磷酸缓冲盐溶液洗涤，再用浓度为1mol/l的nacl重悬，将诱变后的菌体于再生培养基中再生诱变菌株，28摄氏度培养，220rpm,避光培养6小时。再生培养基为酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(3)将步骤(2)中再生后的诱变菌株，离心收集菌体，用1ml灭菌ddh2o悬浮菌体，涂布于10到15个lb固体培养平板上，放于28摄氏度培养箱，培养48小时后可长出单克隆。

(4)菌株初筛：取出步骤(3)中的已长出单克隆的lb固体培养平板，挑取有颜色变化的菌落；

(5)菌株复筛：将初筛得到的有颜色变化的菌株挑到tb培养基中进行摇床培养，用hplc方法检测其色素种类和含量；

(6)连续传代稳定性考察：经hplc检测诱变菌株色素组成和含量，共获得三株有色素变化的突变株，将有色素变化的突变株连续传代五代，重复测其色素种类及产量，检测其遗传稳定性，得到无色八氢番茄红素生产菌sp-phy，红色番茄红素生产菌sp-lyc，深黄色玉米黄素生产菌sp-zea。

所述的类胡萝卜素生产菌株的培育方法所得无色八氢番茄红素生产菌sp-phy，红色番茄红素生产菌sp-lyc，深黄色玉米黄素生产菌sp-zea。

所述的无色八氢番茄红素生产菌sp-phy，红色番茄红素生产菌sp-lyc，深黄色玉米黄素生产菌sp-zea在工业化生产类胡萝卜素中的应用。

鞘氨醇单胞菌八氢番茄红素生产菌株sp-phy的选育方法，该方法包括如下步骤：

(1)将鞘氨醇单胞菌出发菌株kib接种至lb琼脂培养基斜面中，于28℃培养48h，lb琼脂培养基为蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph6.5；

(2)从活化的斜面上挑取一环菌体接种到摇瓶，28℃,220rpm培养12-18h，使od600＝0.7-0.9，其中摇瓶培养基为tb，tb培养基为酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(3)取上述培养好的菌液10ml,离心收集菌体，用等体积的磷酸缓冲盐溶液将菌体洗涤两次，将洗涤后的菌液离心收集；

(4)ntg诱变：向离心得到的菌体中加入10ml磷酸缓冲盐溶液，然后加入ntg，使ntg终浓度为0.05-0.2mg/ml，于28℃，60rpm，避光处理60min；

(5)取出上述用ntg处理后的液体，离心收集菌体，用10ml磷酸缓冲盐溶液洗涤两次，再用浓度为1mol/l的nacl重悬，将诱变后的菌体于再生培养基中再生诱变菌株，28摄氏度培养，220rpm,避光培养6小时。再生培养基为酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(6)将步骤(5)中再生后的诱变菌株，离心收集菌体，用1ml灭菌ddh2o悬浮菌体，涂布于10到15个lb固体培养平板上，放于28摄氏度培养箱，培养48小时后可长出单克隆。

(7)菌株初筛：取出步骤(6)中的已长出单克隆的lb固体培养平板，光下观察，根据下述特点进行初筛；类胡萝卜素的颜色随着共轭双键的数目而变动，共轭双键的数目越多，颜色移向红色越深，从八氢番茄红素、番茄红素、玉米黄素、念珠藻黄素颜色依次递增，挑取颜色变化成白色的菌落若干；

(8)菌株复筛：将上述挑选好的有颜色变化成白色的菌落若干，转接到tb培养基中，于28℃,220rpm摇床培养48h，测其类胡萝卜素种类及含量；

(9)类胡萝卜素含量测定：取步骤(8)挑选的菌株发酵液1ml加入离心管中，用200μl丙酮振荡，萃取类胡萝卜素，将萃取液用0.22μm有机相过滤膜过滤，滤液用于hplc色素分析，其色素谱中，如图1，信号峰ⅴ为鞘氨醇单胞菌诱变株sp-phy的色素组成，主要成分为八氢番茄红色，获得八氢番茄红素生产菌。

鞘氨醇单胞菌番茄红素生产菌株sp-lyc的选育方法，该方法包括下述步骤：

(1)将鞘氨醇单胞菌出发菌株接种至lb琼脂培养基斜面中，于28℃培养48h。lb琼脂培养基为蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph6.5；

(2)从活化的斜面上挑取一环菌体接种到摇瓶，28℃,220rpm培养12-18h，使od600＝0.7-0.9，其中摇瓶培养基为tb培养基：为酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(3)取上述培养好的菌液10ml,离心收集菌体，用等体积的磷酸缓冲盐溶液将菌体洗涤两次，将洗涤后的菌液离心收集；

(4)ntg诱变：向离心得到的菌体中加入10ml磷酸缓冲盐溶液，然后加入ntg，使ntg终浓度为0.05-0.2mg/ml，于28℃，60rpm，避光处理60min；

(5)取出上述用ntg处理后的液体，离心收集菌体，用10ml磷酸缓冲盐溶液洗涤两次，再用1.0mol/l的nacl10ml重悬，将诱变后的菌体于再生培养基中再生诱变菌株，28摄氏度培养，220rpm,避光培养6小时。再生培养基为酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(6)将步骤(5)中再生后的诱变菌株，离心收集菌体，用1ml灭菌ddh2o悬浮菌体，涂布于10到15个lb固体培养平板上，放于28摄氏度培养箱，培养48小时后可长出单克隆。

(7)菌株初筛：取出步骤(6)中的已长出单克隆的lb固体培养平板，光下观察，根据下述特点进行初筛；类胡萝卜素的颜色随着共轭双键的数目而变动，共轭双键的数目越多，颜色移向红色越深，从八氢番茄红素、番茄红素、玉米黄素、念珠藻黄素颜色依次递增，挑取颜色变化成红色的菌落若干；

(8)菌株复筛：将上述挑选好的有颜色变化成红色的菌落若干，转接到tb培养基中，于28℃,220rpm摇床培养48h，测其类胡萝卜素种类及含量；

(9)类胡萝卜素测定：取步骤(8)挑选的菌株发酵液1ml加入离心管中，用200μl丙酮振荡，萃类胡萝卜素，将萃取液用0.22μm有机相过滤膜过滤，滤液用于hplc色素分析，其色素谱中，如图1，信号峰ⅳ为鞘氨醇单胞菌诱变株sp-lyc的色素组成，主要成分是番茄红素，获得番茄红素生产菌。

鞘氨醇单胞菌玉米黄素生产菌株sp-zea的选育方法，该方法包括下述步骤：

(1)将鞘氨醇单胞菌出发菌株kib接种至lb琼脂培养基斜面中，于28℃培养48h，lb琼脂培养基为蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph6.5；

(2)从活化的斜面上挑取一环菌体接种到摇瓶，28℃,220rpm培养12-18h，使od600＝0.7-0.9，其中摇瓶培养基为tb。tb培养基为酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(3)取上述培养好的菌液10ml,离心收集菌体，用等体积的磷酸缓冲盐溶液将菌体洗涤两次，将洗涤后的菌液离心收集；

(4)ntg诱变：向离心得到的菌体中加入10ml磷酸缓冲盐溶液，然后加入ntg，使ntg终浓度为0.05-0.2mg/ml，于28℃，60rpm，避光处理60min；

(5)取出上述用ntg处理后的液体，离心收集菌体，用10ml磷酸缓冲盐溶液洗涤两次，再用1.0mol/l的nacl10ml重悬，将诱变后的菌体于再生培养基中再生诱变菌株，28摄氏度培养，220rpm,避光培养6小时。再生培养基为酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(6)将步骤(5)中再生后的诱变菌株，离心收集菌体，用1ml灭菌ddh2o悬浮菌体，涂布于10到15个lb固体培养平板上，放于28摄氏度培养箱，培养48小时后可长出单克隆。

(7)菌株初筛：取出步骤(6)中的已长出单克隆的lb固体培养平板，光下观察，根据下述特点进行初筛；类胡萝卜素的颜色随着共轭双键的数目而变动，共轭双键的数目越多，颜色移向红色越深，从八氢番茄红素、番茄红素、玉米黄素、念珠藻黄素颜色依次递增，挑取深黄色的菌落；

(8)菌株复筛：将上述挑选好的深黄色的菌落若干，转接到tb培养基中，于28℃,220rpm摇床培养48h，测其类胡萝卜素种类及含量；

(9)类胡萝卜素测定：取步骤(8)挑选的菌株发酵液1ml加入离心管中，用200μl丙酮振荡，萃取类胡萝卜素，将萃取液用0.22μm有机相过滤膜过滤，滤液用于hplc色素分析，其色素谱中，如图1，信号峰ⅲ为鞘氨醇单胞菌诱变株sp-zea的色素组成，主要成分为玉米黄素，获得玉米黄素生产菌。

虾青素生产菌株的培育方法,该方法包括下述步骤：

(1)菌种准备：以念珠藻黄素生产菌保藏号为cgmccno.12394的鞘氨醇单胞菌野生型菌株kib为出发菌株。将鞘氨醇单胞菌出发菌株kib接种至lb琼脂培养基斜面中，于28℃培养48h，lb琼脂培养基为蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph6.5；

(2)从活化的斜面上挑取一环菌体接种到摇瓶，28℃,220rpm培养12-18h，使od600＝0.7-0.9，其中摇瓶培养基为tb。tb培养基为酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(3)取上述培养好的菌液10ml,离心收集菌体，用等体积的磷酸缓冲盐溶液将菌体洗涤两次，将洗涤后的菌液离心收集；

(4)ntg诱变：向离心得到的菌体中加入10ml磷酸缓冲盐溶液，然后加入ntg，使ntg终浓度为0.05-0.2mg/ml，于28℃，60rpm，避光处理60min；

(5)取出上述用ntg处理后的液体，离心收集菌体，用10ml磷酸缓冲盐溶液洗涤两次，再用1.0mol/l的nacl10ml重悬，将诱变后的菌体于再生培养基中再生诱变菌株，28摄氏度培养，220rpm,避光培养6小时。再生培养基为酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(6)将步骤(5)中再生后的诱变菌株，离心收集菌体，用1ml灭菌ddh2o悬浮菌体，涂布于10到15个lb固体培养平板上，放于28摄氏度培养箱，培养48小时后可长出单克隆。

(7)菌株初筛：取出步骤(6)中的已长出单克隆的lb固体培养平板，光下观察，根据下述特点进行初筛；类胡萝卜素的颜色随着共轭双键的数目而变动，共轭双键的数目越多，颜色移向红色越深，从八氢番茄红素、番茄红素、玉米黄素、念珠藻黄素颜色依次递增，挑取深黄色的菌落；

(8)菌株复筛：将上述挑选好的深黄色的菌落若干，转接到tb培养基中，于28℃,220rpm摇床培养48h，测其类胡萝卜素种类及含量；

(9)类胡萝卜素测定：取步骤(8)挑选的菌株发酵液1ml加入离心管中，用200μl丙酮振荡，萃取类胡萝卜素，将萃取液用0.22μm有机相过滤膜过滤，滤液用于hplc色素分析，其色素谱中，如图1，信号峰ⅲ为鞘氨醇单胞菌诱变株sp-zea的色素组成，主要成分为玉米黄素，获得玉米黄素生产菌sp-zea。

(9)受体细胞sp-zea感受态的制备：1)取出从4℃冰箱中保藏的(9)所得玉米黄素生产菌sp-zea,挑取至lb液体培养基中，于28℃,220rpm过夜培养15-18小时，活化菌体；2)用移液枪吸取2.5ml步骤1的培养物在无菌超净台接种于50mltb培养基中，28℃，220rpm振荡培养至od600nm＝0.8；3)将步骤2的菌液冰浴10min后，放入离心管中，4℃/5000rpm离心5min，弃上清，收集细胞；4)在无菌超净台上用4℃预冷的20ml的10％甘油通过移液枪吹悬上一步骤所得细胞，4℃、5000rpm离心5min，弃上清，收集细胞，漂洗2次；5)在无菌超净台上用2ml10％甘油吹悬步骤4得到的细胞，分装于离心管中，-80℃保存；

(10)载体构建：1)将质粒phsg398-reps用限制性内切酶smaⅰ酶切及去磷酸化，回收dna片段，2)以衣藻基因组为模板，以bktf和bktr分别为上下游引物，扩增酮化酶bkt基因，3)连接步骤1,2所得到的dna片段，得到重组质粒phsg398-reps-bkt；

(11)电击转化：1)取上述步骤所构建的质粒phsg398-reps-bkt100ng，分别加入到1管步骤1制备的感受态细胞中，在冰上通过移液枪轻微吐吸使所述质粒dna和感受态细胞充分混匀，冰浴2min；2)将完成步骤1)的体系转移至0℃预冷的电击杯中，用电转仪进行电击；3)完成步骤2)后，立即向电击杯中加入tb培养基，混匀；4)完成步骤3)后，将电击杯中的菌液全部吸出至离心管中，28℃,220rpm振荡培养2小时，5)将完成步骤4的培养体系涂布于含有终浓度为15μg/ml氯霉素的lb固体培养基平板，28℃培养48小时；

(12)转化子色素分析：1)随机挑取若干转化子，转接到tb培养基中，于28℃,220rpm摇床培养48h，测其类胡萝卜素种类及含量；2)类胡萝卜素测定：取上述挑选的菌株发酵液1ml加入离心管中，用200μl丙酮振荡，萃取类胡萝卜素，将萃取液用0.22μm有机相过滤膜过滤，滤液用于hplc，经hplc色素分析其色素谱，如图1，信号峰ⅱ为鞘氨醇单胞菌工程菌株sp-ast的色素组成，主要成分为虾青素，得到虾青素生产菌株sp-ast。

所述的虾青素生产菌株的培育方法所得虾青素生产菌株sp-ast。

所述的虾青素生产菌株sp-ast在工业化生产虾青素中的应用。

本发明所述的方法得到的八氢番茄红素生产菌sp-phy、番茄红素生产菌sp-lyc及玉米黄素生产菌sp-zea可用于工业化生产八氢番茄红素、番茄红素及玉米黄素。

本发明得到的3种突变株连续传代5次后，类胡萝卜素种类及产量稳定。同时将这3株摇瓶培养，其八氢番茄红素、番茄红素、玉米黄素的含量分别可达3.7±0.5mg/g，3.9±0.5mg/g，4.0±0.5mg/g，分别占总色素的90％及以上。具有极大的工业化生产的潜力。

本发明向突变株玉米黄素生产菌sp-zea引入酮化酶基因bkt，使其改造成虾青素生产菌sp-ast，sp-ast的虾青素含量可达4.05mg/g，占总色素的90％及以上，具有极大的工业化生产价值。

附图说明

图1为实施例1-4中sp-kib，sp-ast，sp-zea，sp-lyc，sp-phy的hplc色素分析图谱。信号峰ⅰ为鞘氨醇单胞菌野生型菌株sp-kib的色素组成，主要成分为念珠藻黄素，其保留时间为2.198min,最大吸收波长为480.8nm；信号峰ⅱ为鞘氨醇单胞菌工程菌株sp-ast的色素组成，主要成分为虾青素，其保留时间为2.842min,最大吸收波长为480.8nm；信号峰ⅲ为鞘氨醇单胞菌诱变株sp-zea的色素组成，主要成分为玉米黄素，其保留时间为3.137min，最大吸收波长为480.0nm；信号峰ⅳ为鞘氨醇单胞菌诱变株sp-lyc的色素组成，主要成分是番茄红素，其保留时间为5.396min，最大吸收波长为480.8nm；信号峰ⅴ为鞘氨醇单胞菌诱变株sp-phy的色素组成，主要成分为八氢番茄红色，其保留时间为8.121min，最大吸收波长为280.8nm。

图2为实施例1中sp-kib及sp-phy的crti部分氨基酸比对图。第一行为sp-kib菌株的crti部分氨基酸序列，第二行为sp-phy菌株的crti部分氨基酸序列，由图可以看出诱变株的crti蛋白第476位氨基酸由甘氨酸变成天冬氨酸。

图3为实施例1中sp-phy诱变株5次连续传代稳定性研究。

图4为实施例2中sp-kib及sp-lyc的crty部分氨基酸比对图。第一行为sp-kib菌株的crty部分氨基酸序列，第二行为sp-lyc菌株crty部分氨基酸序列，由图可以看出诱变株的crty蛋白第308位氨基酸由色氨酸变成终止密码子。

图5为实施例2中sp-lyc诱变株5次连续传代稳定性研究。

图6为实施例3中sp-kib及sp-zea的crtg部分氨基酸比对图。第一行为sp-kib菌株的crtg部分氨基酸序列，第二行为sp-zea菌株crtg部分氨基酸序列，，由图可以看出诱变株的crtg蛋白第127位氨基酸由组氨酸变成酪氨酸。

图7为实施例3中sp-zea诱变株5次连续传代稳定性研究。

图8为实施例4中的sp-ast工程菌株5次连续传代稳定性研究。

具体实施方法

以下结合附图，用本发明的实施例来进一步地说明本发明的实质性内容，便于更好的理解本发明，但并不限定本发明。

下述实施例的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

仪器或设备：

色谱柱购自：美国安捷伦科技有限公司，eclipseplusc18rrhd1.8μm，pcr仪购自：美国abi公司，veriti。超高效液相色谱购自：美国安捷伦科技有限公司，1290infinity。超净工作台购自：北京恒奥生物科技有限公司，9sw-cj-1f。ph计购自：丹佛仪器(北京)有限公司，ub-7。恒温摇床购自：上海比朗生物科技有限公司，bilon-cos-211b。高压灭菌器购自：上海博迅实业有限公司，yxq-ls-50s。电击转化仪购自：美国bio-rad公司，genepulserxcell。电泳仪购自：美国bio-rad公司，powerpac。凝胶自动成像仪购自：美国labnet公司，uvpec3-310。恒温水浴锅购自：常州国宇仪器制造有限公司，hh。普通分光光度计购自：美国thermoscientific公司，biomate3s。高速离心机购自：德国eppendorf公司，5804r。

实施例1：

鞘氨醇单胞菌八氢番茄红素生产菌株sp-phy的选育。

鞘氨醇单胞菌出发菌株kib：由本实验室分离，是在培养海洋微藻aurantiochytriumsp.sk4时，平板培养基上的污染物，平板培养基配方为：将5g葡萄糖、2g酵母提取物、50％人工海水、8g琼脂粉和蒸馏水充分混匀并用蒸馏水定容至1l；121摄氏度高温灭菌20min；人工海水培养为：30gnacl、0.7gkcl、10.8gmgcl2·6h2o、2.638gmgso4、0.756gcacl2和蒸馏水充分混匀并用蒸馏水定容至1l。该菌颜色鲜艳，菌落光滑圆润，挑取单克隆于lb培养液中，28摄氏度，220rpm培养。鞘氨醇菌(sphingobiumsp.)于2016年4月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，电话：010-64807355，传真：010-64807288，电子邮件：cgmcc@im.ac.cn，网址：http://www.im.ac.cn)，保藏号为cgmccno.12394。该生物材料(株)的存活性经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏中心于2016.04.25检测为“存活”。

(1)将鞘氨醇单胞菌出发菌株kib接种至lb琼脂培养基斜面中，于28℃培养48h，lb琼脂培养基为蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph6.5；

(2)从活化的斜面上挑取一环菌体接种到摇瓶，28℃,220rpm培养12-18h，使od600＝0.7-0.9，其中摇瓶培养基为tb，tb培养基为酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(3)取上述培养好的菌液10ml,离心收集菌体，用等体积的磷酸缓冲盐溶液将菌体洗涤两次，将洗涤后的菌液离心收集；

(4)ntg诱变：向离心得到的菌体中加入10ml磷酸缓冲盐溶液，然后加入ntg，使ntg终浓度为0.05-0.2mg/ml，于28℃，60rpm，避光处理60min；

(5)取出上述用ntg处理后的液体，离心收集菌体，用10ml磷酸缓冲盐溶液洗涤两次，再用浓度为1mol/l的nacl重悬，将诱变后的菌体于再生培养基中再生诱变菌株，28摄氏度培养，220rpm,避光培养6小时。再生培养基为酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(6)将步骤(5)中再生后的诱变菌株，离心收集菌体，用1ml灭菌ddh2o悬浮菌体，涂布于10到15个lb固体培养平板上，放于28摄氏度培养箱，培养48小时后可长出单克隆。

(7)菌株初筛：取出步骤(6)中的已长出单克隆的lb固体培养平板，光下观察，根据下述特点进行初筛；类胡萝卜素的颜色随着共轭双键的数目而变动，共轭双键的数目越多，颜色移向红色越深，从八氢番茄红素、番茄红素、玉米黄素、念珠藻黄素颜色依次递增，挑取颜色变化成白色的菌落若干；

(8)菌株复筛：将上述挑选好的有颜色变化成白色的菌落若干，转接到tb培养基中，于28℃,220rpm摇床培养48h，测其类胡萝卜素种类及含量；

(9)类胡萝卜素含量测定：取步骤(8)挑选的菌株发酵液1ml加入离心管中，用200μl丙酮振荡，萃取类胡萝卜素，将萃取液用0.22μm有机相过滤膜过滤，滤液用于hplc色素分析，其色素谱中，如图1，信号峰ⅴ为鞘氨醇单胞菌诱变株sp-phy的色素组成，主要成分为八氢番茄红色，其保留时间为8.121min，最大吸收波长为280.8nm。获得八氢番茄红素生产菌。

(10)基因水平检测诱变体：分别以突变株sp-phy和野生型念珠藻黄素生产菌sp-kib基因组为模板，以spcrtif-ctgatgaccaggaaagcgataat和spcrtir-ctagcccagatcttccagcatc为上下游引物扩增后分别得到片段pcrti和kcrti，测序后，氨基酸序列比对。pcr体系和步骤如下：

pcrti扩增步骤如下：

总反应体积20μl，98℃预变性1min，98℃变性10s，56℃退火5s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸5min。扩增得到pcrti。

kcrti扩增步骤如下：

总反应体积20μl，98℃预变性1min，98℃变性10s，56℃退火5s，72℃延伸45s，35个循环，72℃延伸5min。扩增得到kcrti。

将扩增得到的pcrti和kcrti送去测序公司测序，得到的测序结果在http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/网站在线翻译成氨基酸并比对，其诱变株的pcrti蛋白第476位氨基酸由甘氨酸变成天冬氨酸(图2)，导致其丧失酶活性，类胡萝卜素合成通路中断，八氢番茄红素无法进行脱氢反应，造成诱变株中八氢番茄红素的积累。

连续传代稳定性考察：将突变株sp-phy在lb平板上连续传代，培养24h，取一环接种到摇瓶再培养48h，测定每一代的生物量及八氢番茄红素含量，观察其稳定性。由图3可发现突变株sp-phy的生物量和八氢番茄红素含量略有波动，但总体比较稳定。突变株sp-phy即为八氢番茄红素生产菌株。

实施例2

鞘氨醇单胞菌番茄红素生产菌株sp-lyc的选育。

(1)将鞘氨醇单胞菌出发菌株接种至lb琼脂培养基斜面中，于28℃培养48h。lb琼脂培养基为蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph6.5；

(2)从活化的斜面上挑取一环菌体接种到摇瓶，28℃,220rpm培养12-18h，使od600＝0.7-0.9，其中摇瓶培养基为tb培养基：为酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(3)取上述培养好的菌液10ml,离心收集菌体，用等体积的磷酸缓冲盐溶液将菌体洗涤两次，将洗涤后的菌液离心收集；

(4)ntg诱变：向离心得到的菌体中加入10ml磷酸缓冲盐溶液，然后加入ntg，使ntg终浓度为0.05-0.2mg/ml，于28℃，60rpm，避光处理60min；

(5)取出上述用ntg处理后的液体，离心收集菌体，用10ml磷酸缓冲盐溶液洗涤两次，再用1.0mol/l的nacl10ml重悬，将诱变后的菌体于再生培养基中再生诱变菌株，28摄氏度培养，220rpm,避光培养6小时。再生培养基为酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(6)将步骤(5)中再生后的诱变菌株，离心收集菌体，用1ml灭菌ddh2o悬浮菌体，涂布于10到15个lb固体培养平板上，放于28摄氏度培养箱，培养48小时后可长出单克隆。

(7)菌株初筛：取出步骤(6)中的已长出单克隆的lb固体培养平板，光下观察，根据下述特点进行初筛；类胡萝卜素的颜色随着共轭双键的数目而变动，共轭双键的数目越多，颜色移向红色越深，从八氢番茄红素、番茄红素、玉米黄素、念珠藻黄素颜色依次递增，挑取颜色变化成红色的菌落若干；

(8)菌株复筛：将上述挑选好的有颜色变化成红色的菌落若干，转接到tb培养基中，于28℃,220rpm摇床培养48h，测其类胡萝卜素种类及含量；

(9)类胡萝卜素测定：取步骤(8)挑选的菌株发酵液1ml加入离心管中，用200μl丙酮振荡，萃类胡萝卜素，将萃取液用0.22μm有机相过滤膜过滤，滤液用于hplc色素分析，其色素谱中，如图1，信号峰ⅳ为鞘氨醇单胞菌诱变株sp-lyc的色素组成，主要成分是番茄红素，其保留时间为5.396min，最大吸收波长为480.8nm。获得番茄红素生产菌。

(10)基因水平检测诱变体：分别以突变株sp-lyc和野生型念珠藻黄素生产菌sp-kib基因组为模板，以spcrtyf-atgacaaaccggttggactgcgat和spcrtyr-tcaggcgggcggattcagc为上下游引物扩增后分别得到片段lcrty和kcrty，测序后，氨基酸序列比对。pcr体系和步骤如下：

pcrti扩增步骤如下：

总反应体积20μl，98℃预变性1min，98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸5min。扩增得到lcrty。

kcrty扩增步骤如下：

总反应体积20μl，98℃预变性1min，98℃变性10s，58℃退火5s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸5min。扩增得到kcrty。

将扩增得到的lcrty和kcrty送去测序公司测序，得到的测序结果在http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/网站在线翻译成氨基酸并比对，其诱变株的lcrty蛋白第308位氨基酸由色氨酸变成终止密码子(如图4)，导致其丧失酶活性，类胡萝卜素合成通路中断，番茄红素无法进行环化反应，造成诱变株中番茄红素的积累。

连续传代稳定性考察：将突变株sp-lyc在lb平板上连续传代，培养24h，取一环接种到摇瓶再培养48h，测定每一代的生物量及番茄红素含量，观察其稳定性。有图5可发现突变株sp-lyc的生物量和番茄红素含量略有波动，但总体比较稳定。突变株sp-lyc即为番茄红素生产菌株。

实施例3

鞘氨醇单胞菌玉米黄素生产菌株sp-zea的选育。

(1)将鞘氨醇单胞菌出发菌株kib接种至lb琼脂培养基斜面中，于28℃培养48h，lb琼脂培养基为蛋白胨10g/l，酵母提取物5g/l，氯化钠10g/l，ph6.5；

(2)从活化的斜面上挑取一环菌体接种到摇瓶，28℃,220rpm培养12-18h，使od600＝0.7-0.9，其中摇瓶培养基为tb。tb培养基为酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(3)取上述培养好的菌液10ml,离心收集菌体，用等体积的磷酸缓冲盐溶液将菌体洗涤两次，将洗涤后的菌液离心收集；

(4)ntg诱变：向离心得到的菌体中加入10ml磷酸缓冲盐溶液，然后加入ntg，使ntg终浓度为0.05-0.2mg/ml，于28℃，60rpm，避光处理60min；

(5)取出上述用ntg处理后的液体，离心收集菌体，用10ml磷酸缓冲盐溶液洗涤两次，再用1.0mol/l的nacl10ml重悬，将诱变后的菌体于再生培养基中再生诱变菌株，28摄氏度培养，220rpm,避光培养6小时。再生培养基为酵母提取物24g/l，蛋白胨12g/l，葡萄糖4g/l，k2hpo4·3h2o16.416g/l,kh2po42.312g/l，ph6.5；

(6)将步骤(5)中再生后的诱变菌株，离心收集菌体，用1ml灭菌ddh2o悬浮菌体，涂布于10到15个lb固体培养平板上，放于28摄氏度培养箱，培养48小时后可长出单克隆。

(7)菌株初筛：取出步骤(6)中的已长出单克隆的lb固体培养平板，光下观察，根据下述特点进行初筛；类胡萝卜素的颜色随着共轭双键的数目而变动，共轭双键的数目越多，颜色移向红色越深，从八氢番茄红素、番茄红素、玉米黄素、念珠藻黄素颜色依次递增，挑取深黄色的菌落；

(8)菌株复筛：将上述挑选好的深黄色的菌落若干，转接到tb培养基中，于28℃,220rpm摇床培养48h，测其类胡萝卜素种类及含量；

(9)类胡萝卜素测定：取步骤(8)挑选的菌株发酵液1ml加入离心管中，用200μl丙酮振荡，萃取类胡萝卜素，将萃取液用0.22μm有机相过滤膜过滤，滤液用于hplc色素分析，其色素谱中，如图1，信号峰ⅲ为鞘氨醇单胞菌诱变株sp-zea的色素组成，主要成分为玉米黄素，其保留时间为3.137min，最大吸收波长为480.0nm。获得玉米黄素生产菌。

(10)基因水平检测诱变体：分别以突变株sp-zea和野生型念珠藻黄素生产菌sp-kib基因组为模板，以spcrtgf-atggtcgcagctattcttttgtccg和spcrtgr-ggcatccgggtgacgcagac为上下游引物扩增后分别得到片段zcrtg和kcrtg，测序后，氨基酸序列比对。pcr体系和步骤如下：

zcrtg扩增步骤如下：

总反应体积20μl，98℃预变性1min，98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸40s，35个循环，72℃延伸5min。扩增得到zcrtg。

kcrtg扩增步骤如下：

总反应体积20μl，98℃预变性1min，98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸40s，35个循环，72℃延伸5min。扩增得到kcrtg。

将扩增得到的zcrtg和kcrtg送去测序公司测序，得到的测序结果在http://www.ebi.ac.uk/tools/msa/clustalw2/网站在线翻译成氨基酸并比对，其诱变株的127位氨基酸由组氨酸变成酪氨酸(如图6)，导致其丧失酶活性，类胡萝卜素合成通路中断，玉米黄素的β环无法进行2’羟化反应，造成诱变株中玉米黄素的积累。

连续传代稳定性考察：将突变株sp-zea在lb平板上连续传代，培养24h，取一环接种到摇瓶再培养48h，测定每一代的生物量及玉米黄素含量，观察其稳定性。有图7可发现突变株sp-lyc的生物量和玉米黄素含量略有波动，但总体比较稳定。突变株sp-zea即为玉米黄素生产菌株。

实施例4

鞘氨醇单胞菌虾青素生产菌株sp-ast的构建。

(1)受体细胞sp-zea感受态的制备：1)取出从4℃冰箱中保藏的玉米黄素生产菌sp-zea,挑取至lb液体培养基中，于28℃,220rpm过夜培养15-18小时，活化菌体；2)用移液枪吸取2.5ml步骤1的培养物在无菌超净台接种于50mltb培养基中，28℃，220rpm振荡培养至od600nm＝0.8；3)将步骤2的菌液冰浴10min后，放入离心管中，4℃/5000rpm离心5min，弃上清，收集细胞；4)在无菌超净台上用4℃预冷的20ml的10％甘油通过移液枪吹悬步骤3得到的细胞，4℃、5000rpm离心5min，弃上清，收集细胞，漂洗2次；5)在无菌超净台上用2ml10％甘油吹悬步骤4得到的细胞，分装于离心管(100μl/管)中，-80℃保存。

(2)载体构建：1)质粒phsg398-reps是由phsg398插入鞘氨醇单胞菌自身复制子改造而成，可在鞘氨醇单胞菌体内复制。将质粒phsg398-reps用限制性内切酶smaⅰ消化，回收dna片段。酶切及去磷酸化反应的步骤如下所示：

总反应体积20μl，在25℃温浴两小时，琼脂糖凝胶电泳回收相应dna片段。回收所得片段去磷酸化，步骤如下：

总反应体积50μl，在37℃温浴30min，过回收柱终止反应。

2)以衣藻基因组为模板，以bktf和bktr分别为上下游引物，扩增酮化酶bkt基因。pcr体系和步骤如下：

总反应体积20μl，98℃预变性1min，98℃变性10s，60℃退火5s，72℃延伸30s，35个循环，72℃延伸5min。将扩增得到的dna片段，胶回收后末端磷酸化，磷酸化反应步骤如下所示：

总反应体积25μl，37℃温浴30min，过回收柱终止反应。

3)连接步骤1,2所得到的dna片，得到质粒phsg398-reps-bkt，步骤如下：

总反应体积为10μl，16℃过夜连接。将连接产物转化至大肠杆菌jm109，随机挑取单克隆于摇菌管中，37℃过夜培养，取2ml培养物提取质粒，pcr检测，确认构建成功后得到重组质粒phsg398-reps-bkt。

(3)电击转化：1)取100ng步骤2所构建的质粒phsg398-reps-bkt，分别加入到1管步骤1制备的感受态细胞中，在冰上通过移液枪轻微吐吸使所述质粒dna和感受态细胞充分混匀，冰浴2min；2)将完成步骤1)的体系转移至0℃预冷的电击杯(1mm)中，用电转仪进行电击(电压25kv/cm，时间常数＝5ms)；3)完成步骤2)后，立即向电击杯中加入1mltb培养基，混匀；4)完成步骤3)后，将电击杯中的菌液全部吸出至离心管中，28℃,220rpm振荡培养2小时。5)将完成步骤4的培养体系涂布于含有终浓度为15μg/ml氯霉素的lb固体培养基平板，28℃培养48小时。

(4)转化子色素分析：1)随机挑取若干转化子，转接到tb培养基中于28℃,220rpm摇床培养48h，测其类胡萝卜素种类及含量。2)类胡萝卜素测定：取上述挑选的菌株发酵液1ml加入离心管中，用200μl丙酮振荡，萃取类胡萝卜素，类胡萝卜素极易提取。将萃取液用0.22μm有机相过滤膜过滤，滤液用于hplc。经hplc色素分析，其色素谱如图1，红色信号峰为鞘氨醇单胞菌工程菌株sp-ast的色素组成，主要成分为虾青素，其保留时间为2.842min,最大吸收波长为480.8nm，将sp-zea改造成了一株虾青素工程菌sp-ast。

(5)连续传代稳定性考察：将sp-ast在lb平板上连续传代，培养24h，取一环接种到摇瓶再培养48h，测定每一代的生物量及虾青素含量，观察其稳定性。有图8可发现sp-ast的生物量和虾青素含量略有波动，但总体比较稳定。工程菌sp-ast即为虾青素生产菌株。