一种降解邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯的菌株及其在烟草种植中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明涉及一种降解邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的菌株及其在烟草种植中的应用，属于农业生物技术应用领域。本发明的微生物菌株为嗜温鞘氨醇杆菌（ Sphingobacteriumthalpophilum ）zh-x-08菌株，于2013年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.8075。本发明的菌株经发酵后得到发酵液，发酵液以适宜的比例添加烟草根际中可明显降低烟草根系自毒物质邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的含量，促进烟株生长。CGMCC No.80752013.08.27
【专利说明】-种降解邻苯二甲酸二（2-乙基己基）醒的菌株及其在烟 草种植中的应用
[0001]
【技术领域】： 本发明涉及一种降解邻苯二甲酸二（2-己基己基)醋的菌株及其在烟草种植中的应用， 属于农业生物技术应用领域。
[000引【背景技术】： 邻苯二甲酸二（2-己基己基)醋[di-(2-eth}dhe;syl)地thalate，DEHP]是駄酸醋类化 合物（phthalic acid esters, PAEs)中最为常用的一种，作为增塑剂应用于生产聚氯己帰 树脂（PVC)D PAEs全球年产量约为600万T，DEHP产量约占PAEs总量的（80-85) %，在终端 产品中含量可达到75%左右。塑料制品的广泛应用，使PAEs成为全球最普遍的环境有机污 染物。
[0003] 环境介质中存在的DEHP极少部分源于自然，绝大多数源自人类活动的释放。塑料 制品在使用和处理过程中释放出DEHP能污染大气、水体、±壤^及食物等，DEHP已成为水 体和±壤中最常被检出的内分泌干扰素类优控有机污染物，多年前就有在包括人体在内的 很多生物体中均有被检出的报道。
[0004] DEHP在环境中化学性质稳定，难被降解，具有生物积累效应(憂湘平，李桂英， 吴志辉，等.4种駄酸醋在龙须菜-篮子鱼食物链中的积累放大研究[J].海洋科学， 2008，32 (1) : 19-23. )。±壤中的DEHP不仅影响植物的生理代谢，降低产质量，而且还抑 制植物种子萌发和幼苗生长，是一种较为典型的化感物质，并可被吸收积累于植物体内，通 过食物链传递。±壤中的DEHP能够降低祀蝴的体重，且下降程度与±壤中DEHP浓度呈现 线性相关(陈强，孙红文，王兵，等.邻苯二甲酸二异辛醋值EH巧对±壤中微生物和动 物的影响[J].农业环境科学学报，2004，23化）：1156-1159.)。动物实验表明，DEHP能 降低雌性动物的雌激素水平和受孕率，损伤雄性动物的睾丸，具有较强的生殖毒性，还具有 致崎性和胚胎毒性，也是导致男性不育的可疑诱因之一。
[0005] 微生物的降解作用被认为是DEHP从自然环境中消除的主要途径。DEHP在好 氧条件下的生物降解比较快，半衰期2-3周，在厌氧条件下的半衰期约300天(Arias E. Effects of the peroxisome proliferator di(2-ethylhexyl)phthalate on cell turnover and peroxisome proliferation in primary chick embryo hepatocytes[J]. !Environmental Toxicology and Qiemistry, 2012, 31 (12): 2856-2860. )〇
[0006] 国内外就DEHP的微生物降解做了大量的工作，目前已筛选到的能降解DEHP的微 生物菌株主要属于假单胞菌属(Ae化/offlimas巧7.)(柴素芬，曾锋，傅家漠.DEHP的微 生物降解性研究[J].中山大学学报（自然科学版），2000，39(4): 57-60.)、微球菌属 (iZ/crococc化巧7.)、棒状杆菌属沁ritt?巧7)、銷胺醇单胞菌属（成如? W.)等，另外铜绿微囊藻对水体中DEHP亦具有明显的降解作用（迟杰，董林林，李金 娟.铜绿微囊藻对DBP和DEHP的富集和降解特性[J].天津大学学报，2006，39 (12): 1395-1398.)。銷氨醇单胞菌属（成Ain妍遍mas)是由Y油uuchi在1990年首先提出划 分的一个新属，是一类丰富的新型微生物资源，能够降解高分子有机污染物(胡杰，何晓 红，李大平，等.銷氨醇单胞菌研究进展[J].应用与环境生物学报，2007，13(3): 431-437.)，已成为微生物研究的热点之一（2册口 Lisha, LI Hui, ZHANG Ying, ef a7. Development of genus-speci円c primers for better understanding the diversity and population structure of Sphingomonas in soils[J]. J Basic Microbiol, 2014, 54巧）：880-888. ;YANG Suijuan, ZHang Xin曲ai, CAO 化aoyun, ef a7. Growth-promoting Sphingomonas paucimobilis ZJSHl associated with Dendrobium officinale through phytohormone production and nitrogen fixation[J]. Microb Biotechnol, 2014.)〇
[0007] 但尚未见嗜温銷氨醇杆菌（成Ai略C!知C沁化3如(9/7如可降解DEHP的研 究报道。
[000引
【发明内容】
： 本发明的目的在于针对现有技术的不足提供一种降解邻苯二甲酸二（2-己基己基）醋 的菌株及其在烟草种植中的应用，该菌株是发明人从郑州郊区塑料废弃物中分离并筛选出 来，是具有降解邻苯二甲酸二（2-己基己基)醋能力的菌株，经发酵后应用于烟草种植中，可 明显促进烟株生长。
[0009] 本发明的目的是通过W下技术方案来实现的：一种降解邻苯二甲酸二（2-己基己 基）醋的菌株，为嗜温銷氨醇杆菌(成如'略沁化3如(9/7如ai-X-〇8菌株，该菌 株于2013年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中也，保藏单位 地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编为100101，保 藏号；CGMCC No. 8075。
[0010] 所述化-X-08菌株在LB平板上圆形，直径1. 5?2. 5 mm,淡黄，表面光滑，湿润，低 凸起，边缘裂叶状。菌体杆状，无鞭毛，不运动，大小为（0. 5(T〇. 60)ymX (0. 9(T2. 0)ym; 结合生理生化特性(革兰氏染色、巧樣酸盐利用、硝酸盐还原W及碳源与利用等指标）及 ieSrDNA序列，可鉴定为嗜温銷氨醇杆菌。
[0011] 将成Ain妍Aac沁ritt?化3如(9/7如ZH-X-08菌株接种于无机盐培养基中，28 °C 培养3 d，加入5血无菌水，振荡得到菌息液；将菌息液W 5-7 %的比例接种至装有30-50 HiL发酵培养基的250 mL H角瓶中进行发酵培养；培养温度28-30 C，摇床转速200巧m， 培养时间72 h，即制得菌株ZH-X-08发酵液。
[0012] 将由化-X-08菌株制备的ZH-X-08菌株发酵液稀释4-8倍后，在烟草移栽时，每株 烟草德灌稀释液100 ml至根系周围，可明显降低±壤中邻苯二甲酸二（2-己基己基）醋的 含量，促进烟株生长。
[0013] 所述无机盐培养基成分及配制方法如下；化2册〇4 ? 12&0 1. 5-2. 5 g, KH2PO4 0. 3-0. 6g，M拆O4 . 7&0 0. 15- 0. 25 g，（畑4)25〇4 0. 8-1. 2 g，酵母粉 0. 025-0. 06 g，蒸 觸水比，用4 mol/L化OH调节抑至7. 5 ;邻苯二甲酸二（2-己基己基)醋(作为底物，能够 保持并提升菌株降解活性)，溶于丙丽后抽滤灭菌，加到预先灭菌的无机盐培养基中，使邻 苯二甲酸二（2-己基己基）醋的浓度为20-30 mg/l，待丙丽挥发后使用。
[0014] 所述发酵培养基组成为；葡萄糖0. 05 g/l，酵母粉0. 05 g/l，KH2PO4 0. 6 g/l， (NH4)2S04 I. 5 g/L，MgS〇4 ? 7&0 0. 3 g/L，pH7. 5。
[0015] 本发明的最大特点是；利用化-X-08菌株经摇瓶发酵所得菌息液，在烟草种植中 能够降低烟草自毒物质邻苯二甲酸二（2-己基己基）醋含量、促进烟株生长。
[0016]
【具体实施方式】： W下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中实验方法，女口 无特殊说明，均为常规方法。W下实施例中的试验，均设置H次重复，结果取平均值。
[0017] 实施例1 、傷如iingobacterium thalpo地ilum 难獻按照5%接种量餐两予无敢盐镇泰 基（化2册〇4 ? 12&0 2. 0 g，KH2PO4 0. Sg, M拆〇4 ? 7&0 0. 2 g，（畑4)25〇4 1. 0 g，酵母粉 0. 05 g，邻苯二甲酸二（2-己基己基）醋30 mg/L)中，28 C培养3山加入5血无菌水，振荡得 到菌息液。将菌息液W 5 %的比例接种至装有30 mL发酵培养基的250 mL H角瓶中进行 发酵培养。培养温度28 °C，摇床转速200 rpm，培养时间72 h。即制得菌株ZH-X-08发酵 液。
[0018] 发酵培养基组成；葡萄糖 0. 05 g/l，酵母粉 0. 05 g/l，KH2PO4 0. 6 g/l，（NH4)2S04 I. 5 g/L，M拆O4 ? 7&0 0. 3 g/L，pH 7. 5。
[0019] 壤盆栽方式进行验证试验，试验在郑州烟草研究院温室内进行。盆栽±壤采 自郑州市郊，±壤有机质含量为20. 33 g ? kg-i，总氮2. 63 g ? kg-i，pH值6. 89让水比为 1:2. 5)，有效磯 26. 31 mg .kg-i，速效钟 96. 72 mg ^kg-IiDEHP 含量方 4. 23 mg .kg-i。±壤风 干后过20目筛，在盆栽前一周采用惨±法拌入nh4N〇3、kh2P〇4、kn〇3和K2SO4等化学纯试剂， 使±壤含N量达1. 0径/1^干±，曲伸)边。2〇日)边化2〇)=1:1:3,同时采用惨±法设置5. 0 mg/kg 和10 mg/kg两个DEHP添加水平，每盆装入±壤2. 0 kg。将发酵稀释4倍和8倍后作稀释 液备用。施用方式1 :在装盆时采用惨±法将稀释液100 ml均匀拌入盆栽±壤中(惨±法)； 施用方式2;将100 ml稀释液在移栽时W灌根方式德灌在烟草根部±壤周围(灌根法)。同 时设置空白对照，重复3次，试验共计30盆。盆栽每3天德200 ml去离子水1次，移栽后 30 d采用破坏性取样，分别采集±壤和烟株样品，测定±壤中DEHP含量和烟草生物量(地 上部和根系)。试验结果详见表1。该菌株发酵液能够降低±壤中邻苯二甲酸二（2-己基己 基）醋含量15 % W上，较对照提高烟草生物量10 % W上。
[0020]
【权利要求】
1. 一种降解邻苯二甲酸二（2-乙基己基)酯的菌株，其特征在于：所述降解邻苯二甲酸 二（2-乙基己基）酯的菌株为嗜温鞘氨醇杆菌成37/7〇/7力以?) Zh-X-08 菌株，该菌株于2013年08月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中 心，保藏号：CGMCCNo.8075。
2. 根据权利要求1所述的降解邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的菌株，其特征在于：该菌株在LB平板上圆形，直径1. 5~2. 5 mm，淡黄，表面光滑，湿润，低凸起，边缘裂叶状；菌 体杆状，无鞭毛，不运动，大小为（〇. 5(T〇. 60) iimX (0. 9(T2. 0) iim;结合生理生化特性及 16SrDNA序列，可鉴定为嗜温鞘氨醇杆菌。
3. -种利用权利要求1所述的菌株制备Zh-X-08菌株发酵液的方法，其特征在于：将 Zh_X-〇8菌株接种于无机盐培养基中，28 °C培养3 d，加 入5 mL无菌水，振荡得到菌悬液；将菌悬液以5 %的比例接种至装有30 mL发酵培养基的 250 mL三角瓶中进行发酵培养；培养温度28 °C，摇床转速200 rpm，培养时间72 h，即制得 菌株Zh-X-08发酵液。
4. 根据权利要求3所述的制备Zh-X-08菌株发酵液的方法，其特征在于：所述无机盐 培养基成分及配制方法如下：Na2HP04 ? 12H20 1. 5-2. 5 g，KH2P04 0? 3-0. 6g，MgS04 ? 7H20 0.15- 0.25 g，（NH4)2S04 0 . 8-1.2 g，酵母粉 0.025-0. 06 g，蒸馏水 1L，用 4 mol/L NaOH 调节pH至7.5 ;邻苯二甲酸二（2-乙基己基)酯溶于丙酮后抽滤灭菌，加到预先灭菌的无机 盐培养基中，使邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的浓度为20-30 mg/L，待丙酮挥发后使用。
5. 根据权利要求3所述的制备Zh-X-08菌株发酵液的方法，其特征在于：所述发酵 培养基组成为：葡萄糖 0.05 g/L，酵母粉 0.05 g/L，KH2P04 0 . 6 g/L，（NH4)2S04 1.5 g/L， MgS04 ? 7H20 0? 3 g/L，pH7. 5。
6. -种权利要求1所述的降解邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的菌株在烟草种植中的 应用，其特征在于：将由Zh-X-08菌株制备的ZH-X-08菌株发酵液添加烟草根际中可明显降 低土壤邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的含量，促进烟株生长。
7. 根据权利要求6所述的降解邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯的菌株在烟草种植中的 应用，其特征在于：将发酵液稀释4-8倍后，在烟草移栽时，每株烟草浇灌100ml稀释液。
【文档编号】C12R1/01GK104357367SQ201410677772
【公开日】2015年2月18日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】张仕祥, 奚家勤, 过伟民, 王建伟, 郭建华, 周汉平, 薛超群, 王爱国, 尹启生, 张艳玲, 梁太波 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院