邻苯二甲酸二(α-乙基己)酯半抗原、人工抗原及其抗体制备方法及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品安全领域，更具体的说，本发明涉及邻苯二甲酸二（α-乙基己） 酯半抗原合成、人工抗原和抗体制备，还涉及上述邻苯二甲酸二（α-乙基己）酯半抗原及 其相应的人工抗原和抗体的制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 邻苯二甲酸二（α -乙基己）酯（Di (2-ethylhexyl) phthalate)，英文缩写 DEHP, 又名邻苯二甲酸二辛酯，分子量为390. 5, 25°C时该品在水中溶解度〈0.01%，溶于大多数 有机溶剂和烃类，其结构式为：
[0003]
【主权项】
1. 一种DEHP半抗原，其特征在于，分子结构式为：
η为4或5〇
2. -种DEHP人工抗原，是由权利要求1所述的DEHP半抗原与载体蛋白结合而成，其特 征在于：所述DEHP人工抗原分子结构式为：
η为4或5 ;所述的载体蛋白为牛血清白蛋白（BSA)或卵清蛋白（OVA)。
3. -种DEHP抗体，是能与权利要求2所述的DEHP人工抗原发生特异性免疫反应的免 疫球蛋白。
4. 如权利要求1所述DEHP半抗原的合成方法，其特征在于包括以下步骤： (1)按投料比为2:1~3:1将浓硝酸与DEHP置于圆底烧瓶中，冰浴条件下滴加到2倍 于浓硝酸量的浓硫酸中，磁力搅拌，反应至室温，再60°C回流反应5h，期间用TLC监控。用 lm〇L/L的氢氧化钠溶液中和反应液至弱碱性，乙酸乙酯萃取3次，有机相于旋转蒸发仪上 减压蒸干得到粗的硝化产物DEHP-NO 2，过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为2:1~3:1的氯仿/ 环己烷洗脱相，洗脱液浓缩至干，得到纯化的硝化产物DEHP-NO 2 ; ⑵按投料比为1:3:3将DEHP-N02、NH4CU铁粉置于圆底烧瓶中，添加到适量的70% 乙醇溶液中，磁力搅拌，50°C回流反应5h，期间用TLC监控；反应结束后，向反应液中加入 IOOmL无水乙醇，滤去铁粉，收集滤液，于旋转蒸发仪浓缩近干；向浓缩液中加30mL水，用乙 酸乙酯萃取3次，收集有机相，蒸干，得到粗产物DEHP-NH 2 ;过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为 5:1~4:1的氯仿/甲醇洗脱相，洗脱液浓缩至干，得到纯化的还原产物DEHP-NH 2 ; (3)将0.1 mmoL纯化的DEHP-NH2与0. 15mmoL酸酐于无水吡啶中40°C搅拌反应过夜， 反应液旋转蒸发仪浓缩得到黏稠液体，过硅胶柱，收集洗脱液为V/V为6:1~4:1的氯仿/ 甲醇洗脱相，洗脱液浓缩至干，得到产物即为DEHP半抗原。
5. 如权利要求4所述DEHP半抗原的合成方法，其特征在于：浓硝酸为65 %的硝酸，酸 酐为丁二酸酐或戊二酸酐。
6. 权利要求2所述DEHP人工抗原的制备方法为活泼脂法与混合酸酐法，其特征在于： 所述活泼酯方法为： (1) 将0.1 mmol的DEHP半抗原溶解于ImL的DMF中，然后在该溶液里加入等摩尔的DCC 和NHS，室温避光反应过夜； (2) 4°C离心去除沉淀，取上清液，并将其缓慢加入到5mL pH9. 5的碳酸缓冲液中，其缓 冲液含有载体蛋白BSA或OVA，其中载体蛋白的浓度为10~15mg/mL，在4°C下反应过夜； (3)将步骤（2)中的反应液装入透析袋，用0.9%的生理盐水透析3d，得到人工抗原； 所述混合酸酐法为： (1) 将0.1 mmol DEHP半抗原溶于ImL DMF中，加入80 μ L正三丁胺，冰浴下缓慢滴加 0. 15mmol氯甲酸异丁酯，4°C搅拌反应Ih,此为甲液； (2) 将60mg载体蛋白BSA或OVA溶于5mLlmol/L pH9. 6的碳酸氢钠缓冲液中，此为乙 液； (3) 将甲液缓慢滴加到乙液中，4°C磁力搅拌反应过夜，待反应完成后，装入透析袋，然 后用0. 9 %的生理盐水透析3d，得到人工抗原。
7. 如权利要求3所述DEHP抗体的制备方法，其特征在于： (1) 实验选用2个月左右的健康雌性的Balb/c小鼠或新西兰兔作为实验对象，免疫剂 量基础免疫为0. 25~lmg/Kg，加强免疫的剂量为0. 5~lmg/Kg。采用背部皮下多点注射， 每隔15d加强免疫一次，第4次免疫后8~10天内，静脉采血，测定效价和特异性，待其血清 效价和特异性合格后，兔子采用心脏采血，分离出抗血清；或用小鼠脾细胞进行细胞融合， 获得杂交瘤细胞，进而获得单克隆抗体； (2) 采用辛酸-硫酸铵法或Protein G/A亲和层析纯化，得到兔抗血清或小鼠腹水中的 免疫球蛋白，即使DEHP抗体。
8. 如权利要求3所述的DEHP抗体用于制备检测邻苯二甲酸二（α-乙基己）酯在食品 中的残留量的免疫检测剂的应用。
【专利摘要】本发明公开邻苯二甲酸二(α-乙基己)酯(英文缩写DEHP)半抗原、人工抗原和抗体制备及应用，属于食品安全领域。本发明中以DEHP为原料，经硝化反应和还原反应，制得带氨基基团的中间产物，再与丁二酸酐、戊二酸酐等试剂反应生成带羧基基团的半抗原；然后通过活泼脂法或者混合酸酐法与蛋白质偶联制备人工抗原。将人工抗原免疫动物后产生对DEHP的特异性抗体。用该抗体建立免疫检测可用于DEHP的现场快速检测，对实现食品安全的快速检测具有重要现实意义。
【IPC分类】G01N33-53, C07C239-20, C07K16-44, C07K14-77, C07K14-765, C07C233-54, C07C231-02
【公开号】CN104744294
【申请号】CN201410336370
【发明人】张挺, 谭龙飞, 江津津, 彭述辉, 黎海彬
【申请人】广州城市职业学院
【公开日】2015年7月1日
【申请日】2014年7月15日