微杆菌(Microbacterium sp.)J-1在降解多种邻苯二甲酸酯中的应用
【专利说明】微杆菌(M i crobacter i um sp.) J-1在降解多种邻苯二甲酸酯中的应用
技术领域
[0001]本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体地，涉及微杆菌(Mi crobac teri a?sp.) J-1在降解多种邻苯二甲酸醋中的应用。
【背景技术】
[0002]众多研宄表明，邻苯二甲酸醋类化合物(Phthalic acid ester，PAEs)具有高毒性，致畸性、致癌性和致突变性，以及生殖毒性。PAEs主要被用作塑料工业的增塑剂，目前已成为全球最普遍的污染物之一，被美国环境保护局(EPA)和中国环境监测总站列为优先控制污染物(pr1rity pollutant)。根据美国国家癌症研宄所的研宄结果，其中邻苯二甲酸二甲酯(DMP)，邻苯二甲酸二乙酯(DEP)、甲酸二正丁酯(DBP)、邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)、邻苯二甲酸二正辛酯(DOP)和邻苯二甲酸二异辛酯(DEHP)等6种邻苯二甲酸酯被美国EPA列为优先控制污染物。由于塑料制品的大量使用，PAEs广泛存在于大气、水体、土壤以及生物体中。由于PAEs是一类疏水性有机污染物，具有较高的辛醇-水分配系数(Kow)，容易吸附于沉积物和土壤颗粒物上。目前我国农业土壤中PAEs化合物的含量一般在几yg/kg至几十mg/kg。已有的调查数据显示，我国农业土壤中PAEs化合物有不同程度的超标，部分土壤的个别PAEs化合物超标严重，因此PAEs污染土壤的修复问题亟待解决。
[0003]环境中的PAEs可通过水解、光解和生物降解而消失，其中生物降解是其消失的主要途径。近年来，PAEs的细菌降解已经得到广泛的研宄，大量高效降解PAEs的菌株已经从各类环境中分离得到，包括红树林、土壤、海洋、河流与废水处理厂的活性污泥等。然而，大多数已报道的降解菌均是仅对一种邻苯二甲酸酯具有高效降解能力，而既能够高效降解简单的短链PAEs又能降解复杂的支链或长链PAEs的降解菌种质资源很少被发现。同时，关于微杆菌对PAEs污染土壤的修复效果尚无报道。
【发明内容】
[0004]本发明的目的之一是针对当前多种PAEs污染修复技术的不足，提供微杆菌(Mi crobac teri a?sp.) J-1在降解多种邻苯二甲酸醋中的应用。
[0005]本发明的技术方案是通过以下技术实现:
提供一种新的可同时高效降解多种PAEs的降解菌，为微杆菌(#icrc^aci6?riwfflsp.)菌株J-1，于2015年I月22日保藏在中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为 CCTCC NO: M 2015055，分类命名为 #icro如Cteri續sp.J-1。
[0006]本发明从污水处理厂的活性污泥中分离出一株对多种PAEs具有高效降解能力的微杆菌，并研宄其在多种PAEs污染土壤中的修复效果，结果表明该菌可有效降低土壤中的PAEs污染，是理想的土壤环境污染修复微生物，具有十分广泛的应用前景。
[0007]所述微杆菌(Microbactoriuim^.)菌株J-1在LB培养基上培养七天的菌落较小，呈黄白色，湿润，凸起，有光泽，边缘整齐。扫描电镜下多为球状或近球状，直径0.4~1 μπι。
[0008]所述微杆菌iMicrobacteriums'^.')菌株 J-1 的 16S rDNA 基因序列如 SEQ ID NO:1所示。通过NCBI官方网站(http://www.ncb1.nlm.nih.gov/)的BLAST程序与其他已登录细菌菌株16S rDNA序列进行比对，结果表明该菌株与#icrc^ac?6?ri?? sp.相似性最高，同源率达99%。
[0009]所述微杆菌(JlicrobacteriumiK )菌株J-1能降解多种PAEs，特别是对短链PAEs，如DMP和DEP，3天的降解率均分别达到78.92%和71.57%，5天的降解率则达到93.42%和87.02%，7天几乎全部降解(降解率多98%)。而针对长链PAEs，虽然相比短链PAEs降解速度较慢，但随着培养时间的延长，仍能达到较好的降解效果。7天DBP、DOP和DEHP的降解率分别达到95.07%,91.11%和84.61%。
[0010]微杆菌QMicrobacteriumv.)菌株 J-1 在降解 DMP、DEP、DBP、DOP 和 / 或 DEHP 中的应用，所述菌株于2015年I月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为 CCTCC NO: M 2015055。
[0011]微杆菌(#icroAaci6?ritt?sp.)菌株J-1在降解DMP和/或DEP中的应用，所述菌株于2015年I月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2015055。
[0012]微杆菌QMicrobacteriumv.)菌株 J-1 在修复 DMP、DEP、DBP、DOP 和 / 或 DEHP 污染介质中的应用，所述菌株于2015年I月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为 CCTCC NO: M 2015055。
[0013]优选地，所述介质为土壤、水或空气。
[0014]微杆菌QMicrobacteriumv.)菌株 J-1 在制备降解 DMP、DEP、DBP、DOP 和 / 或 DEHP的生物制剂中的应用，所述生物制剂包括菌株J-1的菌悬液和其他辅剂。
[0015]优选地，所述菌悬液的OD600 ? = 0.8~1.2?
[0016]更优选地，所述菌悬液的OD6qq M = 1.0o
[0017]优选地，所述菌悬液的制备方法为将纯化后的菌株J-1接入常规微生物液体培养基培养至对数期，离心收集菌体，用PBS洗菌后重悬调节0D_ ? = 0.8-1.2作为菌悬液。
[0018]与现有技术相比，本发明具有以下有益效果:
本发明从污水处理厂的活性污泥中首次分离出一株对多种PAEs具有高效降解能力的微杆菌，该菌株能降解多种PAEs，特别是对短链PAEs。本发明提供的降解菌弥补了菌种资源库中一菌多效菌种资源的不足；而且该菌在自然界中分布广泛，适应能力强。同时本发明提供了该菌株在修复污染土壤中的应用研宄，为PAEs 土壤污染的生物处理提供了技术保障。
【附图说明】
[0019]图1为J-1菌株在LB培养基上培养7天的生长形态特征。
[0020]图2为J-1菌株的扫描电镜照片。
[0021]图3为J-1菌株的16S rDNA的系统发育树。
[0022]图4为J-1菌株对五种混合PAEs的降解效果。
[0023]图5为未接菌的污染土壤处理中各PAEs的降解效果。
[0024]图6为J-1菌株对污染土壤处理中各PAEs的降解效果。
【具体实施方式】
[0025]下面结合说明书附图和具体实施例来进一步详细阐述本发明。本发明以下实施例为本发明较佳的实施方式，本发明主要阐述所述菌株以及基于所述菌株的应用思想，实施方式中简单参数的替换不能一一在实施例中赘述，但并不因此限制本发明的保护范围，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，应被视为等效的置换方式，包含在本发明的保护范围之内。
[0026]实施例中所述培养基配方如下:
无机盐培养液(MSM，g/L):K2HP04:5.8，KH 2P04:4.5，(NH 4)2S04:2.0，MgCl 2:0.16，CaCl 2:0.02，Na2MoO4.2H20:0.0024，FeCl3:0.0018，MnCl 2.2H20:0.0015。最终 pH 为 7.5。
[0027]牛肉膏蛋白胨培养基(LB):酵母粉5.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠10.0 g，加超纯水至1L，调节pH= 7.0 ;121°C灭菌20min。固体平板则添加1.5% (w/v)琼脂粉。
[0028]实施例1菌株的分离与鉴定
采集污水处理厂的活性污泥，称取5 g活性污泥样品于含有50 mL无菌水的150 mL三角瓶中，在30°C，140 rpm培养3天后，取5 mL污泥悬液加入含有100 mL PAEs (分别含50mg/L DMP、DEP、DBP、DOP和DEHP )的上述MSM培养基中。经30 °C，140 rpm培养7天后，每次按取I mL的接种量连续富集、转接10次，并相应提高培养基中PAEs含量至800 mg/L。然后将驯化10次的培养液稀释103~105涂布于LB固体平板上，30°C倒置培养1~3天。待平板上长出单菌落后，挑取单菌落多次划线纯化，分离获得一株细菌，编号J-1。然后将菌株接种于LB固体平板上30°C倒置培养7天，观察其菌落形态(见图1)。由图1可知，J-1菌株在LB培养基上培养七天的菌落较小，呈黄白色，湿润，凸起，有光泽，边缘整齐。
[0029]扫描电镜观察鉴定:将纯化后的J-1菌株接入含有10 mL的LB液体培养基过夜活化。吸取800 μ L菌液经8000 rpm离心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。在收获的菌体沉淀中加入I mL 2.5%戊二醛充分混匀，4°C静置过夜。然后再次经8000 rpm离心3~5 min，去上清液，加入500 μ L PBS洗菌3次。随后将菌体分别在30%，50%，70%，85%，90%和100%的梯度乙醇中脱水2次，每个