梯度约浸泡15 min,然后8000 rpm离心去上清液，最后用乙酸异戊酯置换乙醇2次，每次20 min，方法同上述乙醇脱水过程。经过CO2干燥后制片观察。图2可见在扫描电镜下J-1菌体多为球状或近球状，直径0.4~1 μπι。
[0030]菌株的16S rDNA分子鉴定:提取J-1菌株的总DNA，用细菌16S rDNA通用引物对该菌基因组进行PCR扩增。PCR产物经测序(由上海生工完成测序)后，菌株的16S rDNA序列如SEQ ID N0:1所示。将测序结果与GenBank中已报道的16S rDNA序列进行同源性比对，并选取相关菌种做进化树分析。如图3所示，J-1菌株与Mi crobac teri um res is tensstrain N1T-Cu-1l (GenBank access1n:KJ575058) 和 Mi crobacteri um resis tensstrain AGP4-3 (GenBank access1n: AY277553)讲化距离最知.,同源性最高。其培养特征与扫描电镜观察特征与微杆菌sp.)也最为相似，因此本发明筛选获得的降解菌为微杆菌(IicroAacteria? sp.)。
[0031]因此，发明人将微杆菌iMicrobeicteriuwsi!.')菌株J_1保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏日期是2015年I月22日，保藏编号是CCTCC NO: M 2015055 ;所述菌株命名为Microbactoriu_.J-1。保藏地址为:中国武汉武汉大学。
[0032]实施例2菌株J-1对多种PAEs的降解效果实验
S1.菌悬液的制备:将纯化后的菌株J-1接入含有10 mL的LB液体培养基过夜活化培养至对数期，经5000 rpm离心10 min收集菌体，用PBS洗菌3次后重悬，调节OD6tltl M =1.0作为菌种悬液。
[0033]S2.向含有 200 mg/L 浓度 PAEs (分别含 200 mg/L 的 DMP、DEP、DBP、DOP 和 DEHP )的100 mL MSM培养液中接种上述菌悬液I mL，以不接菌作为对照，并调节pH为7.0，每组三个重复。在30°C，150 rpm恒温摇床培养7天，分别于0，I，3，5，7天取样并抽提样品，经GC/MS测定样品中DMP、DEP、DBP、DOP和DEHP的降解情况。
[0034]S3.样品处理:将在摇瓶中培养后的样品100 mL转移入分液漏斗，加入20 mL 二氯甲烷振荡萃取10 min，用150 mL三角瓶收集有机相(下相)，分液漏斗中的水相再加入20mL的二氯甲烷相同方法振荡萃取3次，合并有机相，然后过含有18 cm已烘干的无水Na2SO4玻璃柱(1.5 cmX35 cm)进行干燥，用鸡心瓶收集滤液，经旋转蒸干后定容10 mL待测。
[0035]色谱条件:采用岛津公司QP2010 Plus型GC/MS串联质谱仪。色谱柱为安捷伦HP-5柱子(0.25 μπι X 0.25 mm X 30 m)，进样温度为250°C，离子源(EI)温度为220°C，采用不分流进样I UL，载气为高纯氦气。升温程序为:初始温度为100°C，保持2 min，15°C/min梯度上升至129°C，然后以40 °C /min升温至280 °C，保持5min。
[0036]质量控制:采用外标法和六点校正标准物质制作标准曲线。6种PAEs混标的基质加标平均回收率为90.5-107.6%，相对偏差低于10.7%，仪器检测限为0.62-1.22 ug/mL。
[0037]由附图4可知，随着培养时间的延长，五种PAEs的降解率显著上升。特别是对短链PAEs，如DMP和DEP，3天的降解率均分别达到78.92%和71.57%，5天的降解率则达到93.42%和87.02%，7天几乎全部降解(降解率彡98%)。而针对长链PAEs，虽然相比短链PAEs降解速度较慢，但随着培养时间的延长，仍能达到较好的降解效果。7天DBP、D0P和DEHP的降解率分别达到95.07%,91.11%和84.61%。同时也说明，J-1菌更易于利用短链和长直链PAEs，对于带有长支链的DEHP降解效果相对较差，但7天的降解率也超过80%，说明该菌能够高效的利用各种PAEs，可以作为PAEs污染环境生物处理的理想微生物。
[0038]实施例3菌株J-1对多种PAEs污染土壤的修复效果
S1.供试土壤制备:土壤为华南农业大学农场水稻土，风干后过60目筛，pH为6.7，向其中添加五种PAEs (包括DMP、DEP、DBP、DOP和DEHP)，使土壤中各PAE含量分别达到100mg/kg，并加双蒸水调至田间持水量(约30%)，避光老化15天。
[0039]S2.实验处理:分别称取上述含100 mg kg4 DBP的土壤200 g于三角瓶中，向土壤中添加菌悬液50 mL，充分混匀，另外不接菌的处理为对照组。将土壤调至田间持水量(约30%的含水量)，在30°C恒温箱中避光培养，分别于0，2，4，6，8，10天定期取样抽提，然后经GC/MS测定土壤中各PAEs残留量。
[0040]S3.样品抽提:称取I g风干磨碎的土壤样品于35 mL玻璃离心管中，加入20 mL的二氯甲烷并超声萃取10 min，然后经3500 rpm离心收集上清液。土样沉淀中再加入20mL的二氯甲烷相同方法超声萃取3次，合并上清液。然后经旋转蒸发浓缩上清液，用二氯甲烧超声清洗后过柱子(1.0 cm X 35 cm，填料自上而下为无水Na2SO4，娃胶和氧化销)，用鸡心瓶收集滤液经N2吹干后，用色谱纯二氯甲烷重新溶解并定容至I mL，待GC/MS测定。
[0041 ] GC/MS色谱条件同上所述。
[0042]质量控制:采用外标法和六点校正标准物质制作标准曲线。6种PAEs混标的基质加标平均回收率为92.5-110.2%，相对偏差低于10.5%，仪器检测限为0.12-0.45 ug g'该方法满足痕量有机物定量分析要求。
[0043]如图6所示，与未接菌的污染土壤中PAEs降解效果(图5)相比，Microbacteriumsp.J-1菌显著增强了土壤中各PAEs的降解效果。与纯培养结果一致，J-1菌对短链PAEs(如DMP、DEP)的降解效率较高，10天的降解率均超过了 95%。对长直链的DBP和DOP的降解效果也较好，10天的降解率分别为91.51%和79.98%ο对长支链的DEHP的10天降解率为69.71%。而10天的未接菌的土壤中DMP、DEP、DBP、DOP、DEHP降解率分别为21.37%,17.83%, 11.84%, 9.62%, 6.88%。可见，Microbacterium J-1 菌能够显著提高污染土壤中PAEs的消除，在PAEs污染土壤修复中具有良好的应用潜力。
【主权项】
1.微杆菌(Microbacteriunisp.)菌株 J-1 在降解 DMP、DEP、DBP、DOP 和 / 或 DEHP 中的应用，所述菌株于2015年I月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为 CCTCC NO:M 2015055。
2.微杆菌(Microbacteriumsp.)菌株J-1在降解DMP和/或DEP中的应用，所述菌株于2015年I月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2015055。
3.微杆菌(Microbacterimisp.)菌株 J-1 在修复 DMP、DEP、DBP、DOP 和 / 或 DEHP 污染介质中的应用，所述菌株于2015年I月22日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为 CCTCC NO:M 2015055。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述介质为土壤、水或空气。
5.微杆菌(Microbacteriutnsp.)菌株 J-1 在制备降解 DMP、DEP、DBP、DOP 和 / 或 DEHP的生物制剂中的应用，所述生物制剂包括菌株J-1的菌悬液和其他辅剂。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述菌悬液的OD_ M = 0.8~1.2。
7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述菌悬液的OD6tltlnm= 1.0。
8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述菌悬液的制备方法为将纯化后的菌株J-1接入常规微生物液体培养基培养至对数期，离心收集菌体，用PBS洗菌后重悬调节OD600 ? = 0.8-1.2作为菌悬液。
【专利摘要】本发明属于环境污染物生物处理技术领域，具体公开了微杆菌（Microbacteriumsp.）J-1在降解多种邻苯二甲酸酯中的应用。所述菌株是发明人从污水处理厂的活性污泥中首次分离获得的，该菌株能够同时高效降解污染环境中多种PAEs，特别是对短链PAEs。因此将该菌株用于修复多种PAEs污染介质尤其是土壤具有良好的应用前景。CCTCC NO：M 201505520150122
【IPC分类】B09C1-10, B01D53-84, C12R1-01, C02F3-34, C12N1-20, C02F101-34, B01D53-72
【公开号】CN104805036
【申请号】CN201510066133
【发明人】赵海明, 莫测辉, 蔡全英, 李彦文, 李慧, 冯乃宪, 杜欢, 陈学斌
【申请人】暨南大学
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年2月9日