一种重组耶氏解脂酵母菌株及其构建方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，更具体的说是涉及一种重组耶氏解脂酵母菌株及 其构建方法和应用。
【背景技术】
[0002] 人类健康、能源、环境等领域的重大需求牵引着合成生物学的迅猛发展。合成生物 技术在合成重要产品、生产清洁能源、维护人类健康等方面均取得了令人瞩目的成果。利用 合成生物技术构建菜油留醇人工细胞可以弥补化学法和酶促法的不足，且生产过程绿色清 洁，有很大的优势。将基因原件（启动子、转录调控区域、核糖体结合位点、开放阅读框、终 止子等）依据工程化目标需要，有机重构和连接起来，便形成了功能基因模块。通过对已有 生物网络加以利用，同时引入新的功能基因模块，表达出天然细胞不能合成或含量极低的 产物。
[0003] 菜油留醇作为留体类药物的关键前体，它的合成具有重要意义。菜油留醇作为一 般的植物留醇是在植物中提取的，但植物提取周期长，副产物和污染较大。微生物中目前尚 无菜油留醇作为产物的合成报道，但有以此为中间产物最终合成黄体酮和氢化可的松的研 宄。
[0004] 目前人们对解脂酵母的研宄愈来愈多，解脂酵母作为一种非常规的安全酵母被更 多的拿来生产。解脂酵母在生产柠檬酸，脂肪酸以及番茄红素上都有巨大的优势。由于解 脂酵母中的油滴比酿酒酵母大，所以可以更好的容纳一些疏水产品，这些疏水产品储存在 油滴中减轻对细胞的毒害作用。解脂酵母可以将很多物质作为自己的碳源，并且在各种碳 源中都能获得较大的生物量。
【发明内容】
[0005] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种重组耶氏解脂酵母菌株，使得所述菌株能 够应用于菜油留醇的生物合成中，并保持较高产量，同时提供所述菌株的构建方法。
[0006] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
[0007] -种重组耶氏解脂酵母菌株，基因组包含SEQ ID NO: 1-3任意一项所示的核苷酸 序列。
[0008] 本发明将包含蟾蜍、水稻或褐家鼠来源的基因 dhcr7基因的核苷酸序列利用耶氏 解脂酵母自身的同源重组，整合到耶式解脂酵母基因组erg5位点上，获得所述重组耶氏解 脂酵母菌株，具体的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1-3,三者区别在仅于dhcr7基因来源不同，依 次为褐家鼠来源、水稻来源和蟾蜍来源。
[0009] 同时，本发明还提供了所述重组耶氏解脂酵母菌株的构建方法，包括
[0010] 步骤1、将SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO: 5所示或SEQ ID NO:6所示的核苷酸序 列连接到由启动子和终止子组成的表达盒中，获得单基因表达盒；
[0011] 步骤2、将SEQ ID NO:7所示、SEQ ID NO:8所示和SEQ ID NO:9的核苷酸序列通 过OE-PCR连接，获得片段1，SEQ ID N0:8所示和SEQ ID N0:9的核苷酸序列均位于SEQ ID N0:7所示核苷酸序列下游，SEQ ID N0:9所示核苷酸序列位于SEQ ID N0:8所示核苷酸序 列下游；
[0012] 步骤3、将SEQ ID NO: 10所示和SEQ ID NO: 11所示的核苷酸序列通过OE-PCR连 接，获得片段2, SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列位于SEQ ID NO: 10所示核苷酸序列下游；
[0013] 步骤4、将单基因表达盒、片段1以及片段2采用醋酸锂法进行耶式解脂酵母转化， 然后采用SC-drop培养基进行筛选，获得所述重组耶氏解脂酵母菌株；
[0014] 其中，步骤1、步骤2和步骤3不分先后顺序。
[0015] 步骤1中，SEQ ID NO:4所示、SEQ ID NO:5所示以及SEQ ID NO:6所示的核苷酸 序列即为经过优化后的褐家鼠来源、水稻来源和蟾蜍来源的dhcr7基因。作为优选，步骤1 包括：
[0016] 步骤1. 1、在SEQ ID N0:4所示、SEQ ID N0:5所示或SEQ ID N0:6所示的核苷酸 序列两端加上BsaI酶切位点，获得外源靶基因，并连接到载体上；
[0017] 选用耶式解脂酵母内源启动子EXP1和终止子XPR2，在两者之间构建一对反向 BsaI酶切位点组成表达盒，同时在表达盒两端加上NotI酶切位点，并连接到载体上；
[0018] 步骤1. 2、对连接有外源靶基因的载体和连接有表达盒的载体进行BsaI酶切， 将外源靶基因连接到表达盒上，而后进行NotI酶切，获得单基因表达盒，序列如SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13或SEQ ID NO: 14所示。单基因表达盒具体的合成示意图见图1，所述 载体优选为pUC57-simple质粒，该质粒可通过金斯瑞公司购买获得。
[0019] 上述序列片段的合成、酶切位点的加入等操作均可以通过人工合成手段完成，本 发明后续的技术方案中涉及的相关序列也可以通过人工合成完成，但不排除本领域其他常 规手段。
[0020] 为了顺利通过同源重组整合到erg5位点，本发明在外源dhcr7基因两端引入erg5 位点上、下游基因片段，同时附加筛选标记基因。erg5位点上、下游基因片段具体构建的方 法采用0E-PCR，即步骤2和步骤3。其中，SEQ ID N0:7所示核苷酸序列为耶氏解脂酵母 内源erg5基因上游700bp序列，SEQ ID N0:8所示核苷酸序列为筛选标记ura3，SEQ ID N0:9所示核苷酸序列为来源酿酒酵母基因组且与单基因表达盒同源的200bp序列，SEQ ID NO: 10所示的核苷酸序列为来源酿酒酵母基因组且与单基因表达盒同源的208bp序列，SEQ ID NO: 11所示核苷酸序列为耶氏解脂酵母内源erg5基因下游670bp序列。
[0021] 作为优选，步骤2包括：
[0022] 采用SEQ ID NO: 15-20所示核苷酸序列为引物，通过OE-PCR将SEQ ID NO: 7-9所 示核苷酸序列连接起来，得到两端包含NotI酶切位点的片段，连入载体，进行NotI酶切，获 得片段1，如SEQ ID N0:21所示。更优选地，所述载体为pEASY-Blunt质粒，该质粒可用过 全式金公司购买获得。
[0023] 作为优选，步骤3包括：
[0024] 采用SEQ ID N0:22-25所示核苷酸序列为引物，通过OE-PCR将SEQ ID NO: 10-11 所示核苷酸序列连接起来，得到两端包含NotI酶切位点的片段，连入载体，进行NotI酶切， 获得片段2,如SEQ ID NO: 26所示。
[0025] 步骤4中，本发明利用耶式解脂酵母自身的同源重组原理将各片段通过片段间的 同源序列连接起来获得两端包含NotI酶切位点的SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO:2或SEQ ID N0:3所示的核苷酸序列，然后通过与耶式解脂酵母基因组上erg5位点的同源序列发生重 组而将SEQ ID NO: 1、SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3所示的核苷酸序列整合到耶式解脂酵母 基因组上，同源重组示意图见图4。
[0026] 此外，本发明还提供由本发明任意一项技术方案构建的重组耶氏解脂酵母菌株。 采用本发明构建的重组耶氏解脂酵母菌株应用于菜油留醇的发酵生产中时，根据采用的发 酵培养基碳源的不同可达到55-325mg/L的产量水平。基于此技术效果，本发明提供了所述 重组耶氏解脂酵母菌株在生产菜油留醇中的应用。
[0027] 根据提供的应用，本发明提供一种生产菜油留醇的方法，将本发明所述重组耶氏 解脂酵母菌株经种子培养基活化后接种于发酵培养基中培养，培养后收集菌体细胞提取菜 油甾醇。
[0028] 作为优选，所述提取菜油甾醇为：
[0029] 将收集的菌体细胞水洗两次，收集在IOml离心管中，并采用液氮研磨进行破壁， 破壁完成后，加入过量甲醇配置的I. 5M Κ0Η，在60°C水浴锅中皂化4小时以上，皂化结束后 加入2ml正己烷，在涡旋振荡器上震荡lOmin，将产物完全萃取在正己烷中，最后冻干获得 产物菜油甾醇。
[0030] 作为优选，所述种子培养基为：
[0031] 合成酵母氮源YNB6. 7g/L，葡萄糖20g/L，混合氨基酸粉末2g/L(具体配方参考 [美]D. C.安伯格等酵母遗传学方法试验指南），组氨酸38mg/L，色氨酸38mg/L，亮氨酸 190mg/L〇
[0032] 作为优选，所述发酵培养基选自以下之一：
[0033] (1)葡萄糖50g/L，酵母粉15g/L，蛋白胨30g/L ;
[0034] ⑵葡萄糖 50g/L，酵母粉 15g/L，蛋白胨 30g/L，KH2P048g/L，MgS046g/L ;
[0035] (3)与50g/L葡萄糖等碳摩尔数的甘油，酵母粉15g/L，蛋白胨30g/L，KH2P0 48g/L， MgS046g/L ；
[0036] (4)葵花籽油20% (占发酵培养基体积的20% )，酵母粉15g/L，蛋白胨30g/L， KH2P048g/L，MgS046g/L ;
[0037] (5)葵花籽油150mL，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。
[0038] 作为优选，所述培养为在28°C、220-400rpm条件下培养120-150h。
[0039] 由以上技术方案可知，本发明通过OE-PCR方法构建单基因表达盒表达的菜油甾 醇生物合成途径中关键基因 dhcr7,用限制性内切酶将单基因表达盒切下并一次性转入酵 母进行片段间的同源重组和基因组特定erg5位点的整合，通过营养缺陷型培养基和基因 组PCR筛选完整组装的转化子，获得一种新颖的重组耶氏解脂酵母菌株，能够应用于菜油 甾醇的生物合成中，并保持较高产量。
【附图说明】
[0040] 图1所不为单基因表达盒构建不意图；
[0041] 图2所示为单基因表达载体质粒图谱；
[0042] 图3所示为单基因表达盒的酶切验证凝胶图；其中，泳道1-3分别表示蟾蜍来源 dhcr7单基因表达盒、水稻来源dhcr7单基因表达盒、褐家鼠来源dhcr