一种真菌菌株as-3及其在治理重金属污染土壤中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种真菌菌株及其应用，尤其涉及一种高 耐受砷并提高土壤有效态砷含量的真菌菌种AS-3及其在治理重金属污染土壤中的应用。
【背景技术】
[0002] 砷是环境中最重要的污染物之一，具有极强的生物毒性以及致癌致畸危害。世界 卫生组织建议人体对砷的平均摄入量不超过0. 3 μ g · kg4cf1，同时饮用水中砷的最大允许 限量值由原来的50 μ g/L下调至10 μ g/L。砷的来源主要分为自然来源（包括自然界中的 水浸取、植物吸收、火山活动）和人为来源（包括金属生产、采矿、冶金、燃煤、化工等活动）， 而其中人为来源是环境中主要的砷污染源。有报道称砷黄铁矿型难浸金矿的硝酸催化氧化 过程中80%?95%的砷进入溶液，使氧化浸出溶液中的砷高达15?30g/L ;另有报道显示 湖南省石门县雄黄矿附近的农田土壤中砷含量范围为85?814mg/kg，郴州市砷污染区域 的农田土壤中砷含量也高达300mg/kg左右，我国土壤中砷的背景值仅为11. 2mg/kg ;矿区 附近的鹤山村河水含砷量达到0. 5?14. 5mg/L，超出国家标准规定限值上千倍。
[0003] 环境中存在的砷不能像有机污染物那样被微生物降解，但却可以通过微生物对 砷的氧化还原、吸附/解吸附、甲基化/去甲基化、沉淀/溶解等作用改变其生物有效态 (bio-available form)含量，从而达到降低环境中的砷毒害、修复砷污染环境的目的。金属 有效态含量是土壤重金属污染的重要指标，它在土壤环境中的可移动性以及生物有效性最 强。砷的毒性不仅仅与其总量有关，更大程度上由其生物有效态所决定，不同形态的砷产生 不同的环境效应，具有不同的迀移特性，与毒性及其在自然界的循环密切相关。
[0004] 金属有效态含量是土壤重金属污染的重要指标，它在土壤环境中的可移动性以及 生物有效性最强。一般而言，砷的无机化合物形态的毒性要大于有机形态，各形态的毒性大 小依次为：砷化氢（AsH 3) >氧化亚砷（As2O3) >亚砷酸（H3AsO3) >砷酸（H3As04>有机砷。根据砷 连续提取分离法可将土壤中的砷分为五种存在形态：易溶型砷（AE-As)、铝型砷（Al-As)、 铁型砷（Fe-As)、钙型砷（Ca-As)及残渣型砷（O-As)，其中易溶型砷为生物有效态砷。
[0005] 目前，砷活化（AS-mobilization，通过物理、化学手段使As稳定化状态转化为活 动状态，增加质量迀移速率）的研宄主要是通过抗坏血酸钠、有机物等外源物质实现的， 对于砷处理也是以化学稳定法为主。中国专利CN102101123A公开了重金属污染土壤原 位修复方法，其采用亚微米或纳米铁、粉煤灰、含镁制剂和膨润土按照特定比例混合制成 重金属污染土壤修复药剂；中国专利CN103773375A中以硫酸亚铁为原料，通过氧化亚铁 硫杆菌催化氧化，收集沉淀产物并进行改性从而制得固定剂用以处理土壤中砷；中国专利 CN102764759A采用氧化剂、铁基化合物及矿物材料为原料按特定比例混合均匀制成修复药 剂对土壤有效砷砷进行修复处理；中国专利CN103551378A采用微波-氧化复合修复系统对 土壤有机砷污染进行修复处理。
[0006] 近年来，研宄人员逐渐发现土壤中的植物和微生物与土壤中的砷发生复杂的生 物化学反应，是治理土壤砷污染的新思路。中国专利CN101704015A采用丛枝根真菌-蚯 蚓-玉米联合修复砷污染土壤，待玉米生长季结束后连根拔起；中国专利CN101049604A采 用蜈蚣草-富砷特异功能菌联合修复处理砷污染土壤。
[0007] 微生物-植物联合修复砷污染正以其特有的环境友好、清洁高效性逐渐成为砷修 复保领域研宄的热点之一。由于采用微生物来修复污染土壤的技术成本较低，能够循化利 用，不产生二次污染，因而微生物是一种环境友好型的吸附剂，因此，寻找一种具有高耐受 砷并提高有效态砷含量的菌种并将其用于治理重金属污染土壤是目前亟待解决的问题。
【发明内容】
[0008] 本发明的目的在于提供一种真菌菌株及其应用，特别是一种高耐受砷并提高土壤 有效态砷含量的真菌菌种AS-3及其在治理重金属污染土壤中的应用。
[0009] 为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
[0010] 第一方面，本发明提供了一种真菌AS-3,其分类学命名为Chaetomium globosum， 保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC)，保藏地址：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，100101，保藏编号为CGMCC No. 10029,保藏日期为2014年12月02 曰。
[0011] 本发明分离得到的真菌AS-3,经ITS序列鉴定，该真菌属于球毛壳菌（Chaetomium globosum)〇
[0012] 本发明的真菌可以耐受浓度为15mg/L以下的砷离子，例如砷离子浓度可以是 lmg/L、2mg/L、3mg/L、4mg/L、5mg/L、6mg/L、7mg/L、8mg/L、9mg/L、10mg/L、Ilmg/L、12mg/L、 13mg/L、14mg/L、15mg/L，优选砷离子浓度为 5-10mg/L。
[0013] 第二方面，本发明还提供了一种菌剂，所述菌剂包含如第一方面所述的真菌AS-3。
[0014] 第三方面，本发明还提供了如第二方面所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：
[0015] a)培养皿培养：将如第一方面所述真菌AS-3的菌种在无菌条件下接种于固体培 养基上，于20-30 °C，优选28 °C下培养4-6天，优选5天；所述固体培养基由以下组分组成： 酵母提取物1-0. 2g/L ;无水醋酸钠0· 2-0. 3g/L ;琼脂12-18g/L ;链霉素20-28mg/L ;
[0016] b) -级种子培养：将步骤a)培养的菌种在无菌条件下接种于液体培养基，于 20-30°C，优选28°C下培养3-7天，优选5天，制得一级种子；所述液体培养基由以下组分组 成：蛋白胨8-12g/L，优选10g/L ;葡萄糖15-25g/L，优选20g/L ;氯霉素0· 25mg/L ;
[0017] c)二级种子培养：按液体培养基的体积比为5-15%，优选8-12%的接种量，将所 述一级种子接种到5L发酵罐中，曝气，培养5-7天，优选5. 5-6. 5天，制得二级种子；
[0018] d)混合发酵培养：按液体培养基的体积比为10-20%，优选12-18%的接种量，将 二级种子接种到发酵罐中，进行高密度发酵培养，获得菌剂。
[0019] 本发明的培养皿培养中，培养温度可以为20 °C、21 °C、22 °C、23 °C、24 °C、25 °C、 26°C、27°C、28°C、29°C或30°C ;培养时间可以为4天、4. 5天、5天、5. 5天、6天。
[0020] 本发明的一级种子培养中，培养温度可以为20°C、21°C、22°C、23°C、24°C、25°C、 26°C、27°C、28°C、29°C或30°C;培养时间可以为3天、3. 5天、4天、4. 5天、5天、5. 5天、6天、 6. 5天或7天；所用的液体培养基中蛋白胨可以为8g/L、8. 2g/L、8. 5g/L、8. 7g/L、8. 9g/L、 9g/L、9. 3g/L、9. 5g/L、9. 7g/L、10g/L、10. 2g/L、10. 5g/L、10. 7g/L、llg/L、ll. 2g/L、ll. 5g/ L、ll. 7g/L 或 12g/L，葡萄糖可以为 15g/L、16g/L、17g/L、18g/L、19g/L、20g/L、21g/L、22g/ L、23g/L、24g/L 或 25g/L。
[0021] 本发明的二级种子培养中，接种量按液体培养基的体积比可以为5%、6%、7%、 8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%或15% ;发酵罐容积可以为比、1.51^、21^、2.51^、31^、 3. 5L、4L、4. 5L或5L ;培养时间可以为5天、5. 5天、6天、6. 5天或7天。
[0022] 本发明的混合发酵培养中，接种量按液体培养基的体积比可以为10%、11%、 12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%或 20%。
[0023] 第四方面，本发明还提供了一种砷离子处理剂，所述砷离子处理剂包含如第一方 面所述的真菌AS-3。
[0024] 第五方面，本发明还提供了一种治理重金属污染土壤的方法，所述方法包括：
[0025] 将如第一方面所述的真菌AS-3、如第二方面所述的菌剂或如第四方面所述的砷离 子处理剂与重金属污染土壤接触。
[0026] 本发明中，所述的重金属污染土壤为砷污染土壤。
[0027] 本发明中，所述真菌AS-3的用量为0. 2-0. 8g菌体/g 土样，例如可以是0. 2g菌体 /g 土样、0. 3g 菌体 /g 土样、0. 4g 菌体 /g 土样、0. 5g 菌体 /g 土样、0. 6g 菌体 /g 土样、0. 7g 菌体/g 土样、0. 8g菌体/g 土样，优选为0. 8g菌体/g 土样。
[0028] 本发明中，所述真菌AS-3的处理时间为15天以上，例如可以是15天、16天、17天、 18天、19天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天、30天、31天、 32天，优选为15-30天，进一步优选为30天。
[0029] 在本发明中，其中的"有效态金属"是指重金属离子进入土壤后，大部分与其中的 无机、有机组分发生吸附、络合、沉淀等作用，形成碳酸盐、磷酸盐、铁锰氧化物结合态、有机 质硫化物结合态等形式，只有少部分以水溶态和离子交换态存在，后者可有效地影响土壤 微生物的代谢活性而被称为有效态金属。
[0030] 与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
[0031] a)本发明提供的真菌菌株AS-3可以耐受高浓度的砷离子，最高可耐受浓度为 15mg/L的砷离子；并且该菌株可对土壤砷进行活化，提高有效砷含量，进而通过种植砷超 积累植物对有效砷进行吸收修复，可以从根本上降低土壤砷含量；
[0032] b)本发明筛选该真菌菌株AS-3所用培养基容易得到，而且吸附剂能够循环使用， 和传统方法相比，大大降低了成本；
[0033] c)本发明处理含砷污染土壤的方法比较环保，不会产生二次污染，是一种环境友 好型的处理方法。
【附图说明】
[0034] 图1是AS-3系统发育树；
[0035] 图2是AS-3在不同浓度As5+条件下的生长速率；
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