一种木聚糖酶生产菌株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种来源于Streptomyces sp. FA1的木聚糖酶基因（xynA)的克隆表 达，以pPICZa或者pPIC9k构建表达载体，转化P.pastoris，实现了木聚糖酶（xynA)在 P.pastoris中的高效表达，并将应用于提高面团发酵性能以改善馒头品质。本发明专利属 于基因工程领域。
【背景技术】
[0002] 木聚糖酶是能将木聚糖大分子聚合物分解成低聚寡糖和木糖单糖的一类酶的 统称。木聚糖酶属于糖苷水解酶（〇-glycoside hydrolases)[EC 3.2.1.x]，根据作用 位点不同，这类酶可分为两种：一是作用于木聚糖的主链骨架，如内切0-1，4-木聚糖酶 (end。- 0 _1，4-xylanase) [EC3. 2.1.8]、0 -木糖苷酶（0 -xylosidase) [EC3. 2. 1. 37]、 外切 0 -1，4-木聚糖酶（extra- 0 _1，4-xylanase) [EC3. 2. 1. 92]等等。在这些酶当 中，起主要作用的是内切0-l，4-D-木聚糖酶（end〇-|3-l，4-xylanase)和0-木糖苷 酶（0-xylosidase)。通常情况下，狭义上所指的木聚糖就是End〇-|3-l，4-xylanase， 它从木聚糖的主链内部随机地切割0-1，4-糖苷键，将其分解成低聚木糖和少量的木 糖单糖小分子。另一种是作用于木聚糖支链的酶，它们可以作用于支链取代基，包括 乙酰木聚糖醋酶（acetylxylan esterases) [EC 3. 2. 1. 72]、a -L-呋喃阿拉伯糖苷 酶（a -L-arabinofuranosidases) [EC3. 2. 1. 55]、p-香豆酸醋酶（p-couma ric acid esterases) [EC 3. 1. 1. _]等等。
[0003] 木聚糖酶具有巨大的商业应用价值，可应用于造纸、食品、饲料和能源工业中。木 聚糖酶在食品中主要应用于面粉中。小麦面粉中含有1.5%~3%阿拉伯木聚糖，其中水溶 性阿拉伯木聚糖占〇. 5%~0. 8%，其余为水不溶性阿拉伯木聚糖。因阿拉伯木聚糖的强吸 水性对面团的流变学性质及其制品的品质有重要的影响。一般认为水溶性阿拉伯木聚糖对 面制品的品质有改善作用，而水不溶性阿拉伯木聚糖对面制品的品质往往产生副作用。木 聚糖酶能使不可溶的阿拉伯木聚糖水解为可溶性的阿拉伯木聚糖，提高面团的持水性和机 械强度，使面团内部气孔更加均匀细密，具有更好的持气能力和操作耐力内部，在馒头生 产中木聚糖酶能够增大馒头体积，增加馒头比容，使馒头内部气孔更加均匀，从而提高馒头 的品质。目前还没有来源于Streptomyces sp. FA1的木聚糖酶应用于慢头品质改善的报道。
[0004] P. pastoris作为一种利用甲醇作为唯一碳源的真核表达系统，目前已有五百多种 外源蛋白得到表达。P. pastoris不仅克服了传统原核表达系统如E. coli等在表达外源蛋 白的过程中容易形成不溶性包涵体的缺陷，同时又弥补了其余真核表达系统如哺乳动物细 胞、昆虫细胞等环境操作要求严格、产业化成本高等不足。目前链霉菌来源的木聚糖酶因 其良好的理化性质和工业应用前景已经越来越受人们的关注，如Streptomyces sp. SWU10， Streptomyces megasporus DSM，Streptomyces sp.S27 等等。为了满足市场需求需要规模 化生产木聚糖酶，已有链霉菌来源的木聚糖酶在大肠杆菌、酵母及链霉菌中表达。其中，木 聚糖酶在大肠杆菌中的表达水平普遍很低，而木聚糖酶在酵母中的表达水平普遍较高。因 此利用P.pastoris表达木聚糖酶是一条可行的途径。
【发明内容】
[0005] 本发明所解决的技术问题是提供一株高效表达XynA的P. pastoris基因工程菌， 并将该木聚糖酶应用于慢头品质改善。将来源于Streptomyces sp. FA1的木聚糖酶基因 (xynA)与pPICZ a或者pPIC9k系列连接构建表达载体，重组质粒经限制性内切酶线性化后 电转至P. pastoris GS115/KM71中，首次实现了 Streptomyces sp.FAl来源的木聚糖酶在 P. pastoris中的高效表达，在3L发酵罐高密度发酵140h发酵上清总蛋白含量达到6. 5g/ mL，为来源于Streptomyces sp第10家族的木聚糖酶在毕赤酵母中的最高表达水平，并成 功将该重组酶应用在馒头制造中，在最佳添加量下其应用效果优于商品酶尤特尔NCB-77。
【附图说明】
[0006] 图1 pPIC9k-xynA单酶切和双酶切电泳图
[0007] M, DL10, 000DNA Marker ;1 :单酶切 2 :双酶切
[0008] 图2重组菌P. pastoris/pPIC9K_xynA3L罐高密度发酵胞外上清液SDS-PAGE图
[0009] M，分子量标准蛋白；1211、2411、3611、4811、6011、7211、8411、9611、10411为重组菌 P. pastoris在3L罐里不同诱导时间的发酵上清液
[0010] 图3木聚糖酶发酵液-馒头实验
[0011] 图4重组酶XynA和商品酶NCB-77最佳添加量下馒头比容增量比较
【具体实施方式】
[0012] 实施例1 :基因工程菌的构建。
[0013] 1、定点突变去除目的基因xynA中Notl位点，测序正确后将其作为模板。将EcoRI 和Notl作为双酶切位点设计引物进行PCR获得目的基因xynA。将pPIC9k/pPICZa质粒进 行EcoRI和Notl双酶切，酶切产物胶回收后，再用T4连接酶16°C连接过夜，连接产物转化 E.coliJM109感受态细胞，经过培养然后提取质粒，得到重组质粒pPIC9k/pPICZa-XynA。
[0014] 2、重组表达载体pPIC9k/pPICZ a -xynA经过SacI单酶切线性化后电转至 P.pastoris KM71/GS115中，将重组菌涂布于MD平板。两天后挑取MD平板上的单菌落至 含有 0mg/mL、0. 5mg/mL、lmg/mL、l. 5mg/mL、2mg/mL、2. 5mg/ml 的浓度梯度 YPD/G418 平板上， 30°C培养2-3天，挑取20株左右的单菌落，初步确定多拷贝克隆子。
[0015] 随后在摇瓶水平上进一步考察20株重组菌的产酶情况。将G418平板上长出的 单菌落接种至Yro培养基中30°C培养24h，转接至BMGY培养基，30°C培养24h，离心去上清 以清除残留的甘油防止甘油阻遏A0X1的转录，用BMMY培养基重悬菌液，并加入终浓度为 0. 5%的甲醇，诱导产酶。随后每隔24h补加甲醇，并取样测00_及木聚糖酶酶活，诱导表 达120h后，停止培养，测定最终0D_及酶活。根据《GB/T 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶 活力的检测分光光度法》测木聚糖酶酶活，筛选到一个重组转化子终酶活达到100U ? mLJ， SDS-PAGE结果显示，在43kDa处出现特征条带。空白对照空载体转化子KM71/pPIC9K经相 同条件培养诱导，发酵上清液未检测出木聚糖酶酶活，SDS-PAGE也未见特征性条带。
[0016] 实施例2 :重组菌P. pastoris KM71/pPIC9KxynA的3L罐高密度发酵。
[0017] 在摇瓶发酵产酶的基础上，进一步考察了重组菌在3L发酵罐的高密度发酵产 酶情况。发酵工艺为初始装液量1L，调控诱导温度温度为：28°C，pH 5.0,溶氧30%，当 诱导〇D_为100时，开始用浓度1%的甲醇诱导产酶，诱导140h后结束发酵，根据《GB/T 23874-2009饲料添加剂木聚糖酶活力的检测分光光度法》测试，酶活为1243U ? mL1。由于 通风条件的改善和营养物质及诱导剂的持续补充，发酵罐中的酶活为摇瓶发酵的12倍左 右。
[0018] 实施例3 :木聚糖酶应用于馒头实验。
[0019] 称取100g小麦粉，加入含有0. 6g干酵母的温水（36°C )约60mL，加入不同量的木 聚糖酶0-135U/kg面粉用玻璃或筷子混合成面团之后，手工揉3min成面团，压面6-8次，于 36°C恒温箱（湿度80%)中醒发60min，取出再揉3min成型。在室温放置15min放入已煮 沸并垫有纱布的错蒸锅屉上沸水蒸17min，虚蒸3min。取出，冷却测试其重量及体积，计算 比容。添加本专利重组木聚糖酶，从60U/kg面粉开始，馒头内部结构略有改善，在105U/kg 面粉时，馒头内部结构有明显改善，获得了最佳应用效果，馒头比容较空白组增加近6. 9%。 添加最佳量的湖南尤特尔生化有限公司生产的商品化木聚糖酶尤特尔NCB-77 (120U/kg面 粉）时的比容较空白组增加3. 9%左右。本专利重组酶应用于馒头中增加馒头比容效果相 对于商品化木聚糖酶尤特尔NCB-77提高了近75%。在馒头中的应用效果上本专利酶的前 景明显优于对照的商品酶。
【主权项】
1. 一种木聚糖酶生产菌株，木聚糖酶氨基酸序列如SEQIDNo1所示，基因NCBI登陆 号为GenBankaccessionno.JX560161〇
2. 根据权利要求1所述重组基因工程菌，其特征在于，所用于表达的载体为PPIC9K或 pPICZa，所用的菌株为毕赤酵母（Pichiapastoris)。构建重组菌步骤如下： 1) 从实验室保藏菌株中提质粒，通过PCR得到xynA基因； 2) 构建含xynA基因的重组质粒，转化至E.coliJM109中扩增； 3) 将重组质粒经酶切线性化后电转至P.pastoris中，于MD平板及G418抗性平板上挑 选转化子； 4) 摇瓶筛选高拷贝高产酶转化子用于高密度发酵。
3. 根据权利1、2所述的重组木聚糖酶可应用于提高面团发酵性能从而改善馒头品质。
【专利摘要】一种木聚糖酶生产菌株及其应用，属于基因工程技术领域。本发明通过克隆链霉菌Streptomyces sp.FA1的木聚糖酶基因(xynA)并在P.pastoris中表达获得木聚糖酶。本发明以pPICZα或者pPIC9k构建表达载体，转化P.pastoris，首次实现了Streptomyces sp.FA1来源的木聚糖酶在P.pastoris中的高效表达，在3L发酵罐高密度发酵140h发酵上清总蛋白含量达到6.5g/mL，为来源于Streptomyces sp第10家族的木聚糖酶在毕赤酵母中的最高表达水平。将重组的木聚糖酶应用于改善馒头品质取得良好的效果。
【IPC分类】A21D8-04, C12N15-81, C12N1-19, C12R1-84
【公开号】CN104789486
【申请号】CN201510131708
【发明人】吴敬, 吴丹, 徐洋
【申请人】江南大学
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2015年3月24日