专利名称：一株高效代谢木糖的重组酵母菌株及用途的制作方法
技术领域：
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一株能够发酵木糖产乙醇的重组酵母菌株。
背景技术：
利用木质纤维素生产燃料乙醇，不仅能够降低燃料乙醇的生产成本，而且在改善环境及废物处理等方面均有很重要的作用。我国作为一个农业大国，秸杆等农作物废弃物资源相当丰富，这为发展燃料乙醇产业提供了得天独厚的条件。一般用作工业生产乙醇的菌株为酿酒酵母，虽然天然的酿酒酵母能够很好的利用木质纤维素水解物中的己糖产生乙醇，但是却缺乏对含量丰富的戊糖，例如木糖的代谢能力。因此构建能够高效利用木糖的工程菌株对降低燃料乙醇的生产成本具有关键意义。目前我国在利用代谢工程方法构建能够利用木糖产生乙醇的酿酒酵母工程菌株方面已经取得了一定的进展，但是仍不能满足生产的要求，主要表现在木糖利用缓慢、副产物木糖醇积累过多以及乙醇得率低等方面。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一株高效代谢木糖的重组酵母菌株。本发明的第二个目的是提供上述一株高效代谢木糖的重组酵母菌株的用途。本发明的技术方案概述如下
—株高效代谢木糖的重组酵母菌株，分类命名酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)命名为SyBE005,已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6634，其具有高效代谢木糖产乙醇的能力。上述菌株代谢木糖产乙醇的用途。本发明的优点本发明的重组酵母菌株SyBE005能够有效的利用木糖发酵产生乙醇。乙醇产率达到理论得率的64%，副产物木糖醇的产率在12%以下，能够高效地转化木糖为乙醇，是优良的利用纤维素水解液的菌株。本发明的高效代谢木糖的重组酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)命名为SyBE005,已于2012年9月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No. 6634。地址在北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。
图1为含有木糖还原酶基因编码框、木糖醇脱氢酶基因编码框及木酮糖激酶基因编码框的质粒图谱。图2为含有木糖醇脱氢酶基因编码框的质粒PRS305-XDH图谱。
图3是含有核糖磷酸异构酶基因编码框、转酮酶基因编码框的质粒pRS-RKI1-TKLl 图谱。图4是含有戊糖磷酸差向异构酶基因编码框、转醛酶基因编码框的质粒pAUR-RPEl-TALl 图谱。图5为菌株L2612PR、L2612PR-DPPP、SyBE005在含有20g/L木糖的发酵培养基中发酵时木糖利用情况。图6为菌株L2612PR、L2612PR-DPPP、SyBE005在含有20g/L木糖的发酵培养基中发酵时乙醇产生情况。图1为菌株L2612PR、L2612PR-DPPP、SyBE005在含有20g/L木糖的发酵培养基中发酵时木糖醇产生情况。
具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，本发明的实施例是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但不对本发明做任何限制。实施例1重组酵母菌株SyBE005的构建与筛选出发菌株出发菌株L2612,是美国威斯康星大学麦迪逊分校的Thomas Jeffries教授赠予，基因型是MAT alp ha, leu2, ura3, trpl。是亮氨酸、尿喃唳和色氨酸缺陷。培养基筛选培养基A :合成氮源YNB 6. 7g/L,混合氨基酸粉末2g/L (具体配方参考[美]D. C.安伯格等酵母遗传学方法试验指南),亮氨酸100mg/L,色氨酸100mg/L,葡萄糖20g/L。筛选培养基B :合成氮源YNB 6. 7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，色氨酸100mg/L，葡萄糖20g/L0筛选培养基C :合成氮源YNB 6. 7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，葡萄糖20g/L。筛选培养基D :合成氮源YNB 6. 7g/L,混合氨基酸粉末2g/L,短梗霉素A 0. 5mg/L,葡萄糖20g/L。驯化培养基合成氮源YNB 6. 7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，木糖50g/L。固体培养基中，添加20g/L的琼脂。出发重组菌株L2612PR-DPPP的构建以菌株L2612基因组为模板，克隆出启动子TDHlp、TDH3p、PGKlp，木酮糖激酶基因XKSl (含自身终止子)，戊糖磷酸差向异构酶基因RPE1，核糖磷酸异构酶基因RKI1，转酮酶基因TKLl，转醛酶基因TALl，终止子序列PGKlt。通过融合PCR技术将合成的木糖还原酶基因XR、木糖醇脱氢酶基因XDH分别与启动子PGK1、终止子PGKlt连接，将启动子PGKl与木酮糖激酶基因XKSl连接，然后将三个基因表达框顺次连接到载体Hplac211(购于ATCC)上，形成表达质粒YIplac211-XRXDHXK(图1)。木糖还原酶基因XR序列用SEQ ID NO 1所示。木糖醇脱氢酶基因XDH序列用SEQ ID NO 2所示。将以上构建的木糖醇脱氢酶基因表达框从质粒YIplac211_XRXDHXK上酶切出来，重新克隆到载体PRS305 (购于ATCC)上，形成质粒pRS305_XDH(图2)。利用融合PCR技术构建戊糖磷酸差向异构酶基因表达盒TDHlp-RPEl-PGKlt，转醛酶基因表达盒PGKlp-TALl-PGKlt，核糖磷酸异构酶基因表达盒PGKlp-RKIl-PGKlt，转酮酶基因表达盒 TDH3p-TKLl-PGKlt。将基因表达盒 PGKlp-RKIl-PGKlt 和 TDH3p_TKLl_PGKlt连接到载体PRS304 (购于ATCC)上，形成载体pRS-RKIl-TKLl (图3)。将基因表达盒TDHlp-RPEl-PGKlt和基因表达盒PGKlp-TALl-PGKlt依次连接到载体pAURlOl (大连宝生物公司购买)，构建载体pAUR-RPEl-TALl (图4)。用限制性内切酶Apa I线性化YIplac211_XRXDHXK，通过醋酸锂法转化菌株L2612，在筛选培养基A上筛选获得重组菌株L2612PR。并在此重组菌株的基础上，用醋酸锂法转化质粒PRS305-XDH，在筛选培养基B上获得重组菌株。用限制性内切酶EcoRI线性化质粒pRS-RKIl-TKLl，用醋酸锂法转化上一步得到的重组菌株，在筛选培养基C上表达获得重组菌株。并在此菌株的基础上，进一步转化用StuI线性化的质粒pAUR-RPEl-TALl，在筛选培养基D上得到出发重组菌株L2612PR-DPPP。突变菌株SyBE005的构建和筛选将菌株L2612PR-DPPP以初始OD6tltl=O. 2接到含50mL驯化培养基的250mL中，30°C、200转/分有氧培养3天。测量培养物的0D_，并以初始0D_=0. 2转接到新鲜驯化培养基中，重复培养10次后菌液的0D_保持不变，继续重复培养10次。取少量的菌液，稀释后在驯化培养基的固体平板上涂布培养，获得单菌落菌株。从其中选取菌落尺寸最大的20个菌落，分别接种到含有2mL液体筛选培养基C的15mL试管中，在30°C、200转/分的条件下培养2天。取IOOii L菌液转接到3mL新鲜发酵培养基A中，在30°C、200转/分的条件下无氧培养。用带有排气针的橡胶塞密封试管口。无氧培养24小时后，测量菌液的OD6tltl、残余木糖含量和代谢产物乙醇、甘油、木糖醇含量。从20株单菌落中获得了一株残余木糖最少的菌株SyBE005。分析方法
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以722型分光光度计在600nm处测定的菌体吸光值(0D_)表征菌体浓度。木糖、乙醇、木糖醇、甘油的浓度用高效液相色谱(Watersl515)测定。色谱柱为AminexHPX-87H，柱温65°C ;检测器=Waters示差检测器2421，检测器温度是40°C。流动相为5mM硫酸溶液，流速0. 6mL/min,进样量为10 u L。实施例2菌株L2612PR、L2612PR-DPPP与SyBE005的木糖发酵比较1.试验材料菌株 L2612PR、L2612PR_DPPP、SyBE0032.试验方法种子培养基1:合成氮源YNB 6. 7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，葡萄糖20g/L，亮氨酸100mg/L,色氨酸 100mg/L。种子培养基2 :合成氮源YNB 6. 7g/L，混合氨基酸粉末2g/L，葡萄糖20g/L。发酵培养基酵母浸粉10g/L，蛋白胨20g/L，木糖20g/L。从新鲜的斜面上接一环L2612PR菌落到50mL种子培养基I中。类似的，从新鲜的斜面上接菌落L2612PR-DPPP与SyBE005到50mL种子培养基2中。在30°C、200转/分的条件下培养24小时。以初始菌体浓度0D_=1. 0接种到IOOmL发酵培养基中，在30°C、150转/分条件下培养，发酵60小时。检测菌体浓度、木糖浓度和产物乙醇、木糖醇、甘油的浓度。3.分析方法
同实施例1。4.试验结果图5所示，在48小时内菌株SyBE005已经完全利用了木糖，而菌株L2612PR、L2612PR-DPPP都只利用了约60%的木糖，SyBE005的最大木糖比消耗速率达到0. 301g/g干重/h ;发酵结束后，L2612PR、L2612PR-DPPP、SyBE005的乙醇产量分别达到了 2. 02g/L、2. 97g/L、6. 85g/L。L2612PR、L2612PR_DPPP 对应的乙醇得率分别为 0. 15g/g 木糖、0. 20g/g木糖，SyBE005的发酵乙醇 得率达到0. 33g/g木糖，相对于L2612PR、L2612PR_DPPP分别提高了 120%和65%，如图6所示；发酵结束后，L2612PR、L2612PR-DPPP、SyBE005的木糖醇含量分别达到了 6. 24g/L、6. 29g/L、2. 43g/L。L2612PR、L2612PR_DPPP 的木糖醇得率达到 0. 48g/g木糖、0. 42g/g木糖，而SyBE005的木糖醇得率降低为0. 12g/g木糖，相对于L2612PR、L2612PR-DPPP降低了 3、2. 5倍，如图7所示。
权利要求
1.一株高效代谢木糖的重组酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)命名为SyBE005，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 6634，其具有1 效代谢木糖广乙醇的能力。
2.权利要求1所述菌株代谢木糖产乙醇的用途。
全文摘要
本发明公开了一株高效代谢木糖的重组酵母菌株(Saccharomyces cerevisiae)命名为SyBE005，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6634，其具有高效代谢木糖产乙醇的能力。本发明的重组酵母菌株SyBE005能够有效的利用木糖发酵产生乙醇。乙醇产率达到理论得率的64%，副产物木糖醇的产率在12%以下，能够高效地转化木糖为乙醇，是优良的利用纤维素水解液的菌株。
文档编号C12N1/19GK103060217SQ20121050711
公开日2013年4月24日 申请日期2012年11月29日 优先权日2012年11月29日
发明者元英进, 査健, 申明华, 胡梦龙 申请人:天津大学