专利名称：一种冬虫夏草原草粉的高纯基因组dna提取方法
技术领域：
:本发明涉及一种基因组DNA提取方法，具体为一种冬虫夏草原草粉的高纯基因组DNA提取方法。
背景技术：
:冬虫夏草是一种名贵中药材，有软黄金之称，资源有待深加工开发。目前，已有大量冬虫夏草粉碎加工的产品问世，但尚没有专门针对冬虫夏草原草粉进行DNA提取的方法，给多重PCR和荧光定量PCR等分子分析鉴定研究带来困难。冬虫夏草子座，虫体质地韧性存在差异，DNA提取过程中如果研磨过度易引起虫体部位DNA断裂损失，研磨不彻底又会导致子座DNA难以溶出，目前，针对冬虫夏草原草以及发酵菌丝体基因组DNA的提取，报道的主要有氯化苄法和CTAB法等化学方法以及蛋白酶K法。化学方法由于未添加蛋白酶K处理，往往纯度不够，含有较多杂蛋白；而蛋白酶K法提取过程温和，DNA浓度难以保证。以上方法均难以满足提取高纯度的冬虫夏草原草粉基因组DNA的要求。因此，建立一种冬虫夏草原草粉的高纯基因组DNA提取方法已成为目前亟需解决的问题
发明内容
: 本发明的目的是提供一种能够专门从冬虫夏草原草粉中提取高质量高纯度基因组DNA的方法，为之后的分子生物学分析提供优质的模板。为达到上述目的，本发明根据冬虫夏草原草粉的特点，摸索出了一套保护各组织基因组DNA完整性的重复过筛-研磨的处理方法。并组合了 DNA纯化试剂盒进行提取，达到高纯的要求。具体操作步骤如下:(I)取冬虫夏草原草粉0.25g,置于无菌的研钵中；(2)加入液氮在IOs以内迅速研磨至粉末；(3)将研磨后的粉末过120目筛；(4)将过筛后的粉末转移到1.5ml的离心管中，加入裂解液700 yl，并置于水浴锅中65 °C恒温处理30min ；裂解液组成为:2% CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、IOOmM Tris-HCl (三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)pH 8.0、1.4M NaCl (氯化钠)、20mM EDTA (乙二胺四乙酸二钠)、1.5%polyvinyl-pyrrolidone, PVP(聚乙烯卩比咯烧酮)、0.5 2-mercaptoethanol ( ^ 疏基乙醇)；(5)在裂解处理后的样品中加入等体积的氯仿异戊醇(24: l)，13000rpm，离心IOmin ；(6)取上清液，加入RNA酶至终浓度为60 u g/ml，37°C保温30min ；(7)加入蛋白酶K至终浓度为1201^/1111，371:保温301^11;(8)重复步骤⑶；
(9)取上清液，加入0.8倍体积的异丙醇；(10)4°C放置 15min 后，13000rpm 离心 2min ；(11)去上清液，加入70%预冷乙醇500iil洗涤脱盐，13000rpm，离心2min，重复2次；(12)采用OMEGA公司生产的DNA纯化试剂盒进行DNA纯化。本发明采用液氮快速研磨的方法，减少了 DNA碎片的产生，同时研磨后得到的粉末经120目筛过滤，避免了研磨过度易引起虫体部位DNA断裂损失，研磨不彻底又会导致子座DNA难以溶出的问题，提取过程中加入RNA酶，以消除RNA对提取产物的干扰。本发明不需要进行繁琐的化学提取前处理操作。获得的基因组片段大约为21kb ；浓度可达 450 800ng/ u L, A260/A280 为 1.833 1.898，A260/A230 为 2.043 2.126。可满足多重PCR，RT-PCR等分子分析鉴定研究的需要。
:附图是利用I %浓度的琼脂糖凝胶电泳检测本发明方法提取得到的冬虫夏草原草粉基因组DNA样品。M-入DNA/HindIII Marker，1/2/3为3个重复。
具体实施方式
:下面的实施方式是为了进一步阐述本发明，从而使本领域技术人员更全面地理解本发明，而不会给本发明造成任何限制。冬虫夏草原草粉取自 青海三江源药业有限公司。实施例1取冬虫夏草原草粉0.25g,置于无菌的研钵中；加入液氮在IOs以内迅速研磨至粉末；将研磨后的粉末过120目筛；将过筛后的粉末转移到1.5ml的离心管中，加入裂解液700 yl，并置于水浴锅中65°C恒温处理30min(裂解液组成为:2% CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、100mM Tris-HCl (三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)pH 8.0、1.4MNaCl (氯化钠)、2OmM EDTA(乙二胺四乙酸二钠)、1.5% polyvinyl-pyrrolidone,PVP(聚乙烯卩比咯烧酮)、
0.5% 2-mercaptoethanol 巯基乙醇))；在裂解处理后的样品中加入等体积的氯仿异戍醇(24: 1)，13000印111，离心101^11;取上清液，加入1 應酶至终浓度为601^/1111，371:保温30min ;加入蛋白酶K至终浓度为120 y g/ml，37°C保温30min ;重复步骤￠);取上清液，加入0.8倍体积的异丙醇沉淀DNA，13000rpm,离心2min ;加入70%预冷乙醇500 U I洗涤脱盐，13000rpm,离心2min，重复2次；采用OMEGA公司生产的DNA纯化试剂盒进行DNA纯化。50 u I无菌双蒸水或TE洗脱得到高纯度高质量原草粉基因组DNA(大约为20Kb)，置于-20°C冰箱中保存。利用1%浓度的琼脂糖凝胶电泳检测本发明方法提取得到的冬虫夏草原草粉基因组DNA(详见说明书附图)，采用DU-800分光光度计进行检测，三个平行平均浓度为 652ng/u L, A260/A280 = 1.854，A260/A 230 = 2.014。
权利要求
1.一种冬虫夏草原草粉的高纯基因组DNA提取方法，依次包括如下步骤: (1)取冬虫夏草原草粉，置于无菌的研钵中； (2)加入液氮迅速研磨至粉末； (3)将研磨后的粉末过筛； (4)将过筛后的粉末转移到1.5ml的离心管中，加入裂解液进行裂解处理； (5)在裂解处理后的样品中加入等体积的氯仿异戊醇(24: I)，离心抽提； (6)取上清液，加入RNA酶处理； (7)加入蛋白酶K处理； (8)重复步骤(6)； (9)取上清液，异丙醇沉淀DNA； (10)70%预冷乙醇洗涤脱盐2次； (11)纯化DNA。
2.如权利要求1的方法，其中步骤(I)取0.25g原草粉。
3.如权利要 求1的方法，其中步骤⑵液氮研磨的时间控制在IOs以内。
4.如权利要求1的方法，其中步骤(3)将研磨后的粉末过120目筛。
5.如权利要求1的方法，其中步骤(4)加入裂解液组成为:2%CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)、100mM Tris-HCl(三(羟甲基)氨基甲烷盐酸盐)pH8.0、1.4M NaCl (氯化钠)、2OmM EDTA(乙二胺四乙酸二钠)、1.5% polyvinyl-pyrrolidone,PVP(聚乙烯卩比咯烧酮)、0.5% 2-mercaptoethanol (P 疏基乙醇)。
6.如权利要求1的方法，其中步骤(4)加入裂解液700yl，并置于水浴锅中65°C恒温处理30min。
7.如权利要求1的方法，其中步骤(5)离心转速为13000rpm,离心时间为lOmin。
8.如权利要求1的方法，其中步骤(6)加入的RNA酶终浓度为60ii g/ml，处理条件为37°C，30min。
9.如权利要求1的方法，其中步骤(7)加入的蛋白酶K终浓度为120ii g/ml。处理条件为 37°C，30min。
10.如权利要求1的方法，其中步骤(9)中加入的异丙醇体积为上清液体积的0.8倍，4°C 沉淀 15min 后，13000rpm 离心 2min。
11.如权利要求1的方法,其中步骤(10)中加入的70%预冷乙醇体积为500ii I。
12.如权利要求1的方法，其中步骤(11)中采用OMEGA公司生产的DNA纯化试剂盒进行纯化。
全文摘要
本发明公开了一种冬虫夏草原草粉的高纯基因组DNA提取方法。将冬虫夏草原草粉用液氮迅速研磨后，过120目筛，采用CTAB抽提，RNA酶和蛋白酶K处理后，结合纯化试剂盒成功提取到高纯的基因组DNA。所提DNA经DU-800分光光度计检测浓度可达450～800ng/μL，A260/A280为1.833～1.898，A260/A230为2.043～2.126，适用于后期的多重PCR，RT-PCR的研究。
文档编号C12R1/645GK103232995SQ20121050667
公开日2013年8月7日 申请日期2012年12月3日 优先权日2012年12月3日
发明者程池, 扎西才吉, 李辉, 姚粟, 刘洋, 张欣, 白飞荣 申请人:中国食品发酵工业研究院, 玉树藏族自治州三江源药业有限公司