一种改进的动物组织基因组dna提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种改进的动物组织基因组DNA提取方法，改进之处是在苯酚提取前，先用蛋白酶K对细胞提取物进行处理，将肽段降解成更小的单元以便于进行苯酚提取。提纯过程中的DNA酶活性经低温操作并用SDS解聚或柠檬酸三钠和EDTA.Na2等螯合剂抑制。逐渐纯化的DNA经乙醇或异丙醇沉淀而收集，最终实现DNA分离纯化之目的。
【专利说明】一种改进的动物组织基因组DNA提取方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种改进的动物组织基因组DNA提取方法，属分子遗传育种领域。
【背景技术】
[0002]提取DNA的基本程序包括细胞破碎一解聚核蛋白并去除蛋白质一沉淀核酸并去除其它杂质三步。破碎细胞的方法很多，高等动植物材料常用液氮研磨。除去细胞提取物中蛋白质的标准方法是，加入苯酚或1:1的苯酚与氯仿的混合物。这些有机溶剂能够沉淀出蛋白质但仍保留核酸在溶液中。对于某些细胞提取物来说，其中的蛋白质成分含量如此之多，以至于单使用苯酚提取并不足以彻底纯化核酸。正确的处理方法是在苯酚提取前，先用蛋白酶K对细胞提取物进行处理，将肽段降解成更小的单元以便于进行苯酚提取。提纯过程中的DNA酶活性经低温操作并用SDS解聚或柠檬酸三钠和EDTA.Na2等螯合剂抑制。逐渐纯化的DNA经乙醇或异丙醇沉淀而收集，最终实现DNA分离纯化之目的。
【发明内容】
[0003]本发明的目的在于提供一种改进的动物组织基因组DNA提取方法，为实现上述目的，本发明采用如下技术方案:
一种改进的动物组织基因组DNA提取方法，其特征在于它的溶液有以下组分:
氯仿、无水乙醇、Tr i s饱和酚、异戊醇、醋酸钠、饱和氯化钠、7 5%冰乙醇、裂解液、Tris-HCl、EDTA、SDS 和双蒸水。
[0004]一种改进的动物组织基因组DNA提取方法，其特征在它包括以下步骤:
1、将组织样剪碎保存；
2、向组织块的离心管中加入预冷TE；
3、离心后弃上清液；
4、加入饱和Nacl、裂解液,混勻后至室温5min；
5、加入等体积的酚:氯仿:异戊醇抽提一次，离心后吸出上层水相，移至另一干净离心管中。再用等体积的氯仿:异戊醇抽提一次，离心后用抽提至无蛋白沉淀产生；
6、吸上清，加入NaAc，混匀后，再加入预冷的无水乙醇，冰浴、离心，弃上清液；
7、用冰乙醇漂洗I次，离心后弃上清液，将离心管倒置于灭菌的滤纸上使乙醇挥发，风干至无酒精味；
8、加入TE，琼脂糖凝胶电泳检测，保存。
【具体实施方式】
[0005]一、试剂配制
氯仿、无水乙醇、Tr i s饱和酚、异戊醇、醋酸钠、饱和氯化钠、7 5%冰乙醇、裂解液、Tris-HCl.EDTA, SDS 和双蒸水。
[0006]1、配置 10mlTE 溶液
Tris-HCl (lmol/L, pH8.0),Iml ；
EDTA (0.5 mol/1, pH8.0) ,200ul ；
双蒸水98.8ml ；
2、配置100ml裂解液(注意会腐蚀手)
Tris-HCl (lmol/L, pH8.0),Iml
SDS (10% )，1ml 或 I 克
EDTA (0.5mol/l，ρΗ8.0)，20ml
灭菌双蒸水定容至于100ml。
[0007] 二、操作步骤
1、将组织样剪碎-70°C保存，(称取0.03g-0.05g加入1.5ml离心管中)；
2、向组织块的离心管中加入900ul预冷TE，要防止组织块聚成团，尽可能制成细胞悬液；
3>3000r/min离心五分钟后弃上清液；
4、加入10ul饱和Nacl、400ul裂解液，混匀后至室温5min；
5、加入等体积的酹:氯仿:异戍醇(25:24:1体积比)，抽提一次，4°C13000rpm/min离心lOmin，用大口的移液管头(用剪刀将Iml移液管头口剪成大于3mm中的口)小心吸出上层水相(不可碰到蛋白质层)，移至另一干净离心管中，尽量不要吸出两相的交界面。再用等体积的氯仿:异戍醇(24:1),抽提一次，4°C 13000rpm/min离心1min,用大口的移液管头(用剪刀将Iml移液管头口剪成大于3mm中的口)抽提至无蛋白沉淀产生；
6、用剪过头的移液管吸上清，加入1/10体积的3Mol/L的NaAc(PH=5.2)，混匀后，再加入2倍体积的预冷的无水乙醇,冰浴10-20min, 13000rpm离心5分钟，弃上清液；
7、用50ul，70%冰乙醇漂洗I次，13000rpm离心5分钟，弃上清液，将离心管倒置于灭菌的滤纸上10-15min使乙醇挥发，风干至无酒精味；
8、加入50ulTE, 1%琼脂糖凝胶电泳检测(电泳或紫外分光光度法)，-20°C保存。
【权利要求】
1.一种改进的动物组织基因组DNA提取方法，其特征在于它的溶液: 氯仿、无水乙醇、Tr i s饱和酚、异戊醇、醋酸钠、饱和氯化钠、7 5%冰乙醇、裂解液、Tris-HCl、EDTA、SDS 和双蒸水； 上述改进的动物组织基因组DNA提取方法包括以下步骤: (1)将组织样剪碎_70°C保存(称取0.03g-0.05g加入1.5ml离心管中)； (2)向组织块的离心管中加入900ul预冷TE，要防止组织块聚成团，尽可能制成细胞悬液； (3)3000r/min离心五分钟后弃上清液； (4)加入10ul饱和Nacl、400ul裂解液，混匀后至室温5min； (5)加入等体积的酹:氯仿:异戍醇(25:24:1体积比)，抽提一次，4°C13000rpm/min离心lOmin，用大口的移液管头(用剪刀将Iml移液管头口剪成大于3mm中的口)小心吸出上层水相(不可碰到蛋白质层)，移至另一干净离心管中，尽量不要吸出两相的交界面； 再用等体积的氯仿:异戊醇(24:1)，抽提一次，41: 13000rpm/min离心lOmin，用大口的移液管头(用剪刀将Iml移液管头口剪成大于3mm中的口)抽提至无蛋白沉淀产生； (6)用剪过头的移液管吸上清，加入1/10体积的3Mol/L的NaAc(PH=5.2)，混匀后，再加入2倍体积的预冷的无水乙醇,冰浴10-20min, 13000rpm离心5分钟，弃上清液； (7)用50ul，70%冰乙醇漂洗I次，13000rpm离心5分钟，弃上清液，将离心管倒置于灭菌的滤纸上10-15min使乙醇挥发，风干至无酒精味； (8)加入50ulTE, 1%琼脂糖凝胶电泳检测(电泳或紫外分光光度法)，-20°C保存。
2.根据权利要求1所述的溶液，其配制方法为: Cl)配置10mlTE溶液
Tris-HCl (lmol/L, pH8.0),Iml ；
EDTA (0.5 mol/1, pH8.0) ,200ul ； 双蒸水98.8ml ； (2)配置100ml裂解液(注意会腐蚀手)
Tris-HCl (lmol/L, pH8.0),Iml
SDS (10% )，1ml 或 I 克
EDTA (0.5mol/l，ρΗ8.0)，20ml
灭菌双蒸水定容至于100ml。
【文档编号】C12N15/10GK104232623SQ201410561561
【公开日】2014年12月24日 申请日期:2014年10月22日 优先权日:2014年10月22日
【发明者】焦婷, 赵生国, 车拢杰, 权金强, 郭永博, 汪文强, 郑王山 申请人:甘肃农业大学