一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及细胞生物学领域，具体涉及一种快速分离奶牛乳腺上皮细胞的方法。
【背景技术】
[0002]奶牛乳腺炎是对奶牛养殖业危害最大、最常见的疾病之一。奶牛乳腺炎所带来的危害引导着国内外学者对乳腺炎从病因、发病机理、诊断、治疗以及预防等多角度、多方面进行了深入的研究，而对乳腺炎的研究最为常用的就是建立体外乳腺上皮细胞感染的乳腺炎细胞模型。此外，乳腺上皮细胞被公认为是制作乳腺生物反应器的靶细胞，即利用体外培养的乳腺上皮细胞，基于转基因技术平台使外源基因导入动物基因组中并定位表达于动物乳腺，在动物的乳汁中生产一些具有重要价值产品，如小分子多肽或蛋白质。另外，乳腺上皮细胞也是从细胞水平研究乳蛋白表达、奶牛乳腺发育和泌乳机制以及作为抗病转基因奶牛育种供体细胞的有利工具。
[0003]从1957年Lasfargures利用胶原酶消化法第一次实现乳腺上皮细胞的直接培养开始(Lasfargues E Y.Cultivat1n and behav1r in vitro of the normal mammaryepithelium of the adult mouse[J].The Anatomical Record，1957，127(I):117-129.)，对奶牛乳腺上皮分离培养的研究和探索已经有半个多世纪的历史。目前对奶牛乳腺上皮分离的方法有酶消化法、组织块培养法、机械破碎法和乳汁分离法等。酶消化法是通过胶原酶、透明质酸酶或者胰蛋白酶等作用于剪成碎块的组织，获得分散的细胞后经离心、洗涤等步骤接种培养，此方法对于酶的选择及消化时间比较难于掌握，消化不足则不易获得可用于足以扩大再培养的细胞数量，消化过度会导致细胞的损伤。组织块培养法是将乳腺组织剪成Imm3左右小块直接接种于培养皿，加入培养基培养直到乳腺上皮从组织块周围迀出生长，该方法最大的不足是耗时长，一般I周或者是更长时间才有细胞迀出，而且往往是成纤维细胞最先迀出生长，需要传代数代以后才有可能获得相对较纯的乳腺上皮细胞，传代次数的过多极易导致乳腺上皮细胞的老化。机械破碎法就是通过物理学处理手段，将组织块解离成分散的细胞后用滤网过滤，离心弃去上清液，用培养液悬浮后接种培养，单一使用该方法对乳腺上皮细胞这种分化程度较高的细胞易造成伤害，细胞的存活率相对较低。乳汁分离法是采用离心法收集乳汁后从中提取乳腺上皮细胞，经过体外诱导培养获得乳腺上皮细胞，该方法分离的乳腺上皮细胞虽然没有成纤维细胞的污染，但是因为乳汁中乳腺上皮细胞含量少，且为自然脱落的细胞，组胞活性差，很难维持生长。
[0004]除对奶牛乳腺上皮细胞进行原代分离培养外，研究者们还在努力建立永生化的奶牛乳腺上皮细胞系。1991年加拿大的Huynh等利用SV40大T抗原基因转染奶牛原代乳腺上皮细胞，建立了永生化的奶牛乳腺上皮MAC-T细胞系(Huynh H T1Robitaille G1Turner JD.Establishment of bovine mammary epithelial celIs(MAC-T):an in vitro modelfor bovine lactat1n[J].Experimental cell research，1991，197(2):191-199.)。之后，在 1995年Huynh等(Huynh H,Poliak M.HH2A,an immortalized bovine mammaryepithelial cell line, expresses the gene encoding mammary derived growthinhibitor(MDGI)[J].1n Vitro Cellular&Developmental B1logy-Animal,1995,31(1):25-29.)和1996年zaviz1n等(Zaviz1n B, van Duffelen M，Schaeffer ff , etal.Establishment and characterizat1n of a bovine mammary epithelial cellline with unique properties[J].1n Vitro Cellular&Developmental B1logy-Animal ,1996,32(3):138-148.)相继建立了H2A和BME-UV等永化生细胞系。这些永化生的细胞系虽然保持着部分与起源细胞相似的生物学特性和功能，但在使用的过程中出现了形态上的分化或没有腺上皮的典型特点，有的尚未得到其它实验室的检验，而且只是用于实验室之间的交流使用，到目前为止尚没有商品化的奶牛乳腺上皮细胞系可为研究人员使用。
[0005]综上所述，由于无商品化的奶牛永生化细胞系，以及其在使用过程中性状和功能的不确定性，而原代细胞系更能代表体内器官的功能特性，再加上一般体外培养的奶牛乳腺上皮细胞可以稳定培养数月，能满足细胞实验的基本要求。因此，目前大多数实验室首选分离奶牛原代乳腺上皮细胞进行研究，因此，对乳腺上皮分离培养的方法不断完善显得尤其重要。
【发明内容】
[0006]本发明的目的在于克服现有奶牛乳腺上皮细胞分离培养技术的不足，提供一种快速分离高纯度原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法。
[0007]为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案:
[0008]I)将奶牛乳腺组织剪切成0.5?Imm3大小的组织块，将所述组织块用磷酸盐缓冲液清洗后置于胶原酶/透明质酸酶消化液中消化30?40分钟；
[0009]2)经过步骤I)后，通过离心收集消化成乳糜状的组织块，将消化成乳糜状的组织块接种在培养皿中，并向培养皿中加入细胞培养液，然后于37°C进行培养;培养I?2天后，开始每天机械刮除从消化成乳糜状的组织块迀出生长的成纤维细胞，保留同样迀出生长的乳腺上皮细胞，并且每隔I?2天更换细胞培养液I次，直到培养至5?7天时机械刮除所述培养皿中所有残余组织块，然后弃掉细胞培养液，并用磷酸盐缓冲液冲洗；
[0010]3)经过步骤2)后，向所述培养皿中加入胰蛋白酶消化液进行短时消化，短时消化过程中每隔I?2分钟进行观察，待乳腺上皮细胞簇最外层的细胞开始变圆时弃掉胰蛋白酶消化液，并用磷酸盐缓冲液冲洗，然后(短时消化后)向所述培养皿中再次加入胰蛋白酶消化液并进行传代。
[0011]优选地，所述步骤I)中，奶牛乳腺组织的获取方法包括以下步骤:无菌采集泌乳期奶牛乳腺组织，经表面消毒处理后在不含脂肪组织、结缔组织少且富含乳腺小叶的部位切取一部分乳腺组织。
[0012]优选地，所述表面消毒处理包括以下步骤:将奶牛乳腺组织用75%酒精冲洗30?40秒后，再用含抗生素的磷酸盐缓冲液冲洗3?5次。
[0013]优选地，所述胶原酶/透明质酸酶消化液按照每毫升DMEM/F12培养液中加入0.5?
1.5mg胶原酶、200?300yg透明质酸酶、100IU青霉素、10yg链霉素和0.2?0.5yg两性霉素B进行配制。
[0014]优选地，所述步骤I)中，胶原酶/透明质酸酶消化液的用量为每I克剪切成0.5?Imm3大小的组织块使用2?4毫升。
[0015]优选地，所述细胞培养液为含有体积分数为10?20%胎牛血清、100IU/mL青霉素、100yg/mL链霉素和0.2?0.5yg/mL两性霉素B的DMEM/F12培养液。
[0016]优选地，所述步骤2)中，细胞培养液的用量为每I克剪切成0.5?Imm3大小的组织块对应使用2?3晕升。
[0017]优选地，所述胰蛋白酶消化液按照每100毫升磷酸盐缓冲液中加入0.2?0.5g胰蛋白酶进行配制。
[0018]优选地，所述步骤3)中，培养皿中胰蛋白酶消化液的加入量均为每I克剪切成0.5?I謹3大小的组织块对应加入I?2毫升。
[0019]优选地，所述短时消化的时间为小于3分钟。
[0020]本发明的有益效果是:
[0021](I)本发明将乳腺组织块经酶消化液预处理消化成乳糜状小块。这种处理可以初步消化乳腺小叶间的结缔组织以及细胞间连接蛋白，松散组织，以利于乳腺上皮细胞从组织块迀出生长(消化时间过长会使组织块过度消化，时间过短则不利于组织块贴壁后细胞的快速迀出)，与传统的组织块培养法相比，大大缩短了细胞从组织块迀出的时间，本发明一般在接种I?2天后上皮细胞即可迀出生长，而传统的组织块培养法往往需要I周或者更长的时间，而且往往成纤维细胞先迀出，上皮细胞则需要更长的时间，这样就容易导致分离得到的乳腺上皮细胞活性低，后续培养容易发生老化。
[0022](2)本发明未采用胶原酶或透明质酸酶消化后的单个细胞进行培养，而是采用初步消化后的乳糜状组织块贴壁法进行分离乳腺上皮细胞，发现本发明方法从组织块迀出的细胞绝大多数为乳腺上皮细胞，而且成簇成片生长，与少数的成纤维细胞生长区域存在明显的界限，采用机械刮除法很容易去除成纤维细胞，而现有胶原酶或透明质酸酶消化法收集单个分散的细胞进行培养时，成纤维细胞和乳腺上皮细胞混杂生长，不易去除成纤维细胞。
[0023](3)本发明在首次传代前采用多次机械刮除法去除少量成纤维细胞污染，仅在首次传代时利用I次差速胰蛋白酶消化法去除可能混有的极少量成纤维细胞，期间减少了因胰蛋白酶多次处理而可能导致的乳腺上皮细胞老化，因此本发明采用多次机械刮除法结合I次胰酶差速消化法分离到乳腺上皮细胞比传统的多次利用差速消化法，可分离到纯度更高、活性更好的乳腺上皮细胞。
[0024](4)采用本发明方法获得的乳腺上皮细胞具有旺盛的增殖能力，可用于研究乳蛋白表达、奶牛乳腺发育及奶牛泌乳机制细胞水平的研究，也可作为制作乳腺生物反应器的靶细胞和抗病转基因奶牛育种核移植的供体细胞。
【附图说明】
[0025]图1为乳糜状组织块接种到直径为60_培养皿后的示意图。
[0026]图2相差显微镜下观察结果;A:组织块接种培养皿培养1-2天后细胞从组织迀出的代表性图片;B:在上皮细胞簇(团)周围可见少数成纤维细胞，利用机械刮除法可去除;C:首次传代以前，上皮细胞不断增殖，上皮细胞团不断扩大过程中的代表性图;D:首次传代后培养I至2天，上皮细胞生长状态良好，呈铺路石样生长，图示为代表性图片。
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