专利名称：从牛初乳中分离乳腺上皮细胞的体外培养方法
技术领域：
本项发明涉及从牛初乳中分离乳腺上皮细胞的体外培养技术。
背景技术：
乳腺细胞的培养，对于研究奶牛泌乳的生理、营养和内分泌调控，揭示影 响奶产量和质量的遗传因素及其分子机制，探讨通过基因选择、内分泌和营养 调控来提高奶产量具有重要的理论意义和应用前景。另外，利用体外培养的乳 腺细胞系，通过转基因手段将高附加值的药用蛋白基因导入乳腺细胞，获得转 基因乳腺细胞系，再通过转基因体细胞克隆技术，获得以奶牛乳腺作为生物反 应器的专基因奶牛，是今后重组药用蛋白生产的一个具有广阔应用前景的领域。
目前，由于乳腺上皮细胞增殖分化过程受多种细胞因子和激素等复杂的时 空调控，牛乳腺上皮细胞的培养、尤其是能够长时间稳定传代的原代乳腺细胞 的分离培养仍然是具有很大难度和挑战性的一项技术，罕见成功的报道。
牛乳腺上皮细胞原代培养方法常规的有乳腺组织块种植法和乳腺组织胶原 酶消化法，从牛初乳中分离培养乳腺细胞尚未见成功的报道。组织块种植法操 作简便，细胞不易丢失，适用于小组织量培养。但是从种植的组织块长出细胞 需要的时间较长，成纤维等结缔组织细胞最先长出，含上皮细胞丰富的细胞单 层随后出现。胶原酶消化法，可获得更具组织代表性的细胞群，但工作量相对 大，费用高(胶原酶价格高)。直接用这种消化物的滤过液培养，长出的往往是 上皮和成纤维混杂的细胞单层，在酶消化过程中还存在丢失和损伤细胞的危险 性。有文献报道，用胶原酶消化水牛、奶牛乳腺组织进行细胞培养，均未获得正常生长的乳腺细胞。故有人选择机械破碎法，这种方法操作较简便，比酶消 化法快，但可对细胞产生机械损伤。此外，上述三种方法还由于组织取材不太 容易，有一定局限性。为了解决这些问题，我们实验室采用从牛初乳中分离培 养乳腺上皮细胞，获得了较好的效果。该方法样品材料来源广泛，取材方便， 操作简单，避免了酶消化破碎法对细胞造成的伤害。从乳汁中分离得到的乳腺 细胞纯度高，杂细胞少，体外培养细胞生长旺盛，形态规整，可用于各种体外 研究。
发明内容
方法
1、 制备培养液 RPMI-1640 、用前添加FBS 20%、胰岛素lug/ml、醋酸 钠5mM、转铁蛋白10 ug/ml 、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml;
2、 包被培养瓶用胶原蛋白包被培养瓶。取少量的胶原蛋白加入培养瓶， 用自制的弯头玻璃管，将其推开，使之均匀的铺满底壁，以倾斜瓶时不流动为 益，将培养瓶盖拧松，放置于超净工作台内5—6小时，用于接种细胞。
3、 细胞来源细胞来自泌乳一周内的荷斯坦奶牛乳汁中。用新洁尔灭水清 洗乳房，再用75%酒精擦抹消毒乳头，用干燥、灭菌的容器采集50—100ml乳汁， 以1000-1500rpm离心20min，仔细去除上清，用含青霉素100U/ml、链霉素 100ug/ml的D-hanks液清洗沉淀的细胞团块3—4次直到上清液不浑浊为止。
4、 细胞原代培养及传代将离心所得细胞混悬在含20% FBS、 lug/ml胰岛 素、5mM醋酸钠、10ug/ml转铁蛋白、100U/ml青霉素、100ug/ml链霉素的 RPMI-1640培养液中，接种于培养瓶内，置C02培养箱，在37。C、 5%(:02饱和湿 度下培养，3天后每天观察1次，从第5天开始每3天更换 一次培养液，当细胞汇合度达到80—90%时，用Trypsin/EDTA消化，收集细胞，用培养液稀释制成 细胞悬液态观察初培接入培养瓶中继代培养。
5、 细胞形养细胞为圆形，经2—3天，细胞开始伸伪足生长。此时细胞呈 短梭形、三角形或不规则多角形，第5—6天可见克隆形成。细胞逐渐向周围扩 展铺开，成片生长。此时可观察到两种形态的上皮细胞，一种为多角形，细胞间 联系紧密，呈大理石状； 一种为短梭形，细胞互相衔接，呈鹅卵石状。随着细 胞进一步汇合，培养瓶中形成以上皮细胞为主的不规则生长区域。第9—10天 细胞基本连接成片，达底面积的80%—90%，有些上皮细胞区域的边缘出现细胞 堆积现象。继代培养后，乳腺上皮细胞出现水泡样或圆形中空的腺腔样结构。
6、 乳腺上皮细胞的免疫组化鉴定运用乳腺细胞的特异性标记物抗体可以 对培养的细胞类型进行鉴定。乳腺上皮细胞中的骨架蛋白主要以角蛋白7、 8和 18为主，是其重要的标志蛋白。实验中，我们选择角蛋白一18抗体对所建立的 乳腺上皮细胞系进行免疫组化鉴定。经FITC标记的二抗孵育，在荧光显微镜下 观察，乳腺上皮细胞的细胞质呈绿色荧光信号，而细胞核中无荧光信号。说明 细胞中存在乳腺上皮细胞的标志性骨架蛋白pr-角蛋白18，进而确定该细胞系 的乳腺上皮特性。
7、 体外培养的牛乳腺上皮细胞中P酪蛋白的检测
对体外原代培养的牛乳腺上皮细胞中P -酪蛋白的检测用双抗夹心ELISA方 法和RT-PCR两种方法从蛋白水平和转录水平对原代培养的牛乳腺上皮细胞进行 检测，均检测到了3-酪蛋白。证明所培养的乳腺上皮细胞具有泌乳功能。
通过对所培养的细胞形态学观察、免疫组化鉴定、P酪蛋白的检测等方面 的研究和细胞来源，证明我们从牛初乳中分离、培养的细胞确为牛乳腺上皮细胞。
具体实施例方式
采集泌乳一周内的荷斯坦奶牛乳汁，经反复离心沉淀，收集细胞将其混悬
在含20。/。FBS 、 lug/ml胰岛素、5mM醋酸钠、10ug/ml转铁蛋白、100U/ml青霉 素、100ug/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，接种于用胶原蛋白包被的培养瓶 内，置37°C 、5% C02培养箱中培养。当细胞长满底壁达80-90%时，用Trypsin/EDTA 消化，收集细胞，继续传代培养。
权利要求
1、一种从牛初乳中分离和培养乳腺上皮细胞的培养液，包括各种培养成份含量是RPMI-164075-80％、胎牛血清20％、胰岛素1ug/ml、醋酸钠5mM、转铁蛋白10ug/ml、青霉素100U/ml、链霉素100ug/ml。
2、 培养瓶包被方法用胶原蛋白包被培养瓶。取少量的胶原蛋白加 入培养瓶，用自制的弯头玻璃管，将其推开，使之均匀的铺满底壁，以倾 斜瓶时不流动为益，将培养瓶盖拧松，放置于超净工作台内5—6小时，用 于接种细胞。
3、 细胞来源细胞来自泌乳一周内的荷斯坦奶牛乳汁。
全文摘要
本发明公开了一种从牛初乳中分离乳腺上皮细胞的体外培养方法。针对目前乳腺上皮细胞体外培养方法中存在的组织取材不易、培养成功率低等问题，我们采用从泌乳2-7天的牛初乳中分离培养乳腺上皮细胞，进行原代培养。培养液为RPMI-1640，添加胎牛血清20％、胰岛素1μg/ml、醋酸钠5mM、转铁蛋白10μg/ml、青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml等，培养条件为37℃，5％CO<sub>2</sub>。细胞接种在胶原包被的培养瓶内，经过15-18天培养，细胞可铺满瓶子底壁，并可传代。用角蛋白-18抗体对所培养细胞进行免疫组化鉴定，结果呈阳性，证明所培养细胞系确为乳腺上皮细胞。用ELLISA和RT-PCR方法从原代培养的牛乳腺上皮细胞中均检测到了β-酪蛋白，表明所培养的乳腺上皮细胞具有泌乳功能，可用于多种体外研究。
文档编号C12N5/06GK101591636SQ20081007288
公开日2009年12月2日 申请日期2008年5月26日 优先权日2008年5月26日
发明者李文蓉, 牛志刚, 谭立新 申请人:新疆维吾尔自治区畜牧科学院中国-澳大利亚绵羊育种研究中心