专利名称：一种促进奶牛乳腺上皮细胞发育及泌乳的方法
技术领域：
本发明涉及一种促进乳腺发育及泌乳的方法。
背景技术：
奶牛是畜牧养殖业中重要的经济动物之一，奶牛的产奶量和奶品质是衡量养殖水 平和经济效益的重要标准。我国为奶牛养殖大国，存栏奶牛达1216万头，但奶牛的平均 年单产水平只有3884kg，美国的奶牛单产则可达7767kg，以色列为8615kg，料奶比可达到 1 3。产奶量低、乳脂和乳蛋白含量相对不高、产出投入比较低的是制约我国奶牛养殖业 发展的主要因素。依据《国家中长期科学和技术发展规划纲要》、《国家“十一五”科学技术发展规划》 和《863计划“十一五”发展纲要》，通过运用各种生物信息学手段和基因操作技术，筛选出 影响泌乳性状的重要功能基因，对促进我国奶牛养殖业发展具有重大的理论意义和实际应 用价值。乳腺是重要的泌乳功能器官，乳腺内基因表达水平受遗传和环境因素的双重调控。 泌乳重要功能基因的表达水平变化能够调控乳腺的生长发育、分化和组织重建，以及乳汁 合成、分泌和运输等重要的生理过程。乳腺上皮细胞是泌乳的基本结构和功能单位，通过研 究其内泌乳相关基因的表达，可以为揭示乳腺特异性表达基因如何被激活、泌乳重要功能 基因如何起始和维持泌乳、调控乳汁组分提供理论依据。同时，有助于建立一种调控奶牛泌 乳重要功能基因表达水平并显著提高产奶量的乳腺生物调控技术。目前奶牛功能基因组学研究处于起步阶段，对影响牛健康、疾病、肉奶品质相关基 因的功能研究是未来的研究重点。国内对泌乳相关的奶牛功能基因的研究工作基本处于空 白状态，国外也只有较少的研究报告，获得的泌乳功能基因数量较少。采用现代功能基因组 学研究方法，来研究泌乳这一奶牛重要的生产指标相关的基因，以及奶牛从饲料所获得的 各种营养物质同这些控制泌乳的重要基因之间的相互作用具有重要的意义。可为奶牛产奶 性能的提高以及营养物质的合理供给研究提供重要的技术理论依据和技术手段。
发明内容
本发明提供了一种促进奶牛乳腺上皮细胞发育及泌乳的方法。促进奶牛乳腺上皮细发育及泌乳的方法按以下步骤进行一、取荷斯坦牛泌乳期 组织样并采用胶原酶_胰酶消化法分离上皮细胞，然后置于细胞生长培养液中培养3代，得 体外培养的乳腺上皮细胞；二、根据Kcnmal基因的mRNA序列设计引物，PCR扩增出Kcnmal 基因的全序列，然后与PGEM-T载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5 α，获得克隆载体 质粒；三、pSV-β-Galactosidase Control Vector质粒和克隆载体质粒分别使用AgeI和 XbaI进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建表达载体，再用表达载体转染体外培养的 乳腺上皮细胞，使Kcnmal基因在体外培养的乳腺上皮细胞中过量表达，即完成奶牛乳腺上 皮细发育及泌乳的促进；其中步骤一中细胞生长培养液由90ml的DMEM高糖培养基、IOml 的FBS (胎牛血清)和IOml浓度为50mg/ml的胰岛素、100 μ 1 10万单位/ml的青霉素和100 μ 1 10万单位/ml的链霉素组成；步骤二中PCR扩增所用上游引物为5' -GCACCGGTTG CTAGCTATGGCAAATGGTGGC-3 ‘，下游引物为 5 ‘ -GCTCTAGAGGCAGTGGATACACACATCAGAG-3 ‘， 而且在上下游引物的5'端分别添加了限制性内切酶AgeI和XbaI的酶切位点。钾大电导钙活化通道亚家族Μ，α成员1 (potassium large conductance calcium-activated channel, subfamily M, alpha member 1,Kcnma 1)编石马一禾中 BK 钾离子 通道蛋白；它由两个亚基组成，分别负责通道形成的α亚基和起调节作用的β亚基；细胞 内钙离子调节α和β亚基之间的相互作用；钾通道通过膜的去极化或者提高细胞内Ca2+ 浓度被激活，调节K+的运输；它也可以被细胞内Mg2+激活；它的激活将缓冲细胞内Ca2+浓度 和/或膜电位去极化，因此可以使膜电位复极化。本发明中Kcnmal基因在泌乳期奶牛乳腺中高表达，通过基因过表达实验和RNA干 扰实验在细胞水平验证了 Kcnmal基因确实是能够促进奶牛乳腺上皮细胞发育以及乳产生 的重要功能基因。本发明中Kcnmal基因是奶牛乳腺中影响细胞增殖以及乳蛋白合成的重要功能基 因，在奶牛乳腺发育以及泌乳功能中起着重要的关键性作用；通过对Kcnmal基因的调控， 可以改变奶牛乳腺的泌乳机能，达到改变泌乳性状，增加经济效益的目的；本发明也是首次 证明了 Kcnmal基因在乳腺中具有刺激乳腺发育及泌乳的功能，并可用于基因调控改变动 物生产性能等相关应用。
图1是具体实施方式
一中Kcnmal基因在体外培养的乳腺上皮细胞中过量表达细 胞酪蛋白及PSTAT5检测图；图2是具体实施方式
一中Kcnmal基因在体外培养的乳腺上皮 细胞中过量表达细胞的细胞周期检测图，其中A为Kcnmal基因在体外培养的乳腺上皮细胞 中过量表达曲线，B为对照；图3是具体实施方式
一中PCR扩增出Kcnmal基因的全序列进行 RNA干扰时间梯度曲线图；图4是具体实施方式
一中Kcnmal基因沉默后Weatern Blot检 测图；图5是具体实施方式
一中Kcnmal基因沉默细胞的细胞周期检测图，其中A为Kcnmal 基因沉默细胞的细胞周期检测曲线，B为对照。
具体实施例方式本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式
，还包括各具体实施方式
间的 任意组合。
具体实施方式
一本实施方式促进奶牛乳腺上皮细发育及泌乳的方法按以下步骤 进行一、取荷斯坦牛泌乳期组织样并采用胶原酶-胰酶消化法分离上皮细胞，然后置于细 胞生长培养液中培养3代，得体外培养的乳腺上皮细胞；二、根据Kcnmal基因的mRNA序列 设计引物，PCR扩增出Kcnmal基因的全序列，然后与pGEM_T载体进行连接，连接产物转化 大肠杆菌DH5 α，获得克隆载体质粒；三、pSV- β -Galactosidase Control Vector质粒和 克隆载体质粒分别使用AgeI和XbaI进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建表达载 体，再用表达载体转染体外培养的乳腺上皮细胞，使Kcnmal基因在体外培养的乳腺上皮细 胞中过量表达，即完成奶牛乳腺上皮细发育及泌乳的促进；其中步骤一中细胞生长培养液 由90ml的DMEM高糖培养基、IOml的FBS(胎牛血清)和IOml浓度为50mg/ml的胰岛素、100 μ 1 10万单位/ml的青霉素和100 μ 1 10万单位/ml的链霉素组成；步骤二中PCR扩增 所用上游引物为 5 ‘ -GCACCGGTTGCTAGCTATGGCAAATGGTGGC-3 ‘，下游引物为 5 ‘ -GCTCTAGA GGCAGTGGATACACACATCAGAG-3‘，而且在上下游引物的5‘端分别添加了限制性内切酶AgeI 和XbaI的酶切位点。本实施方式步骤一中细胞生长培养液，经0. 22 μ m的微孔滤膜过滤除菌后，调节 pH值为7. 2。本实施方式步骤二中转化的过程a、冰上融化50 μ 1大肠杆菌DH5 α，加入5 μ 1 连接产物，混勻后于-20°C放置30min，然后置于42°C水浴中45秒，其间保持EP管静止不 动；b、迅速取出放置于冰浴中2min，加入950 μ 1 LB液体培养基，37°C震荡培养1. 5h ；c、 培养后3000r/min离心lOmin，弃去上清液，用200 μ 1 LB液体培养基重悬固体沉淀；d、取 100 μ 1涂布含有青霉素并涂有X-gal和IPTG的LB平板，吹干后，37°C培养12h观察结果； e、培养12h后，在LB平板上挑取白色的菌落，接种于20ml含有青霉素的LB液体培养基中， 37°C震荡培养12h。取阳性重组子20 μ 1，送北京华大基因有限公司测序，所得测序结果同Kcnmal基 因序列进行比对，同源性为100%。本实施方式步骤三中转染过程a、将2 X IO5个体外培养的乳腺上皮细胞加入6孔 细胞培养板，培养24h使细胞贴壁生长；b、灭菌离心管中混合预热37°C的培养基400ul、重 组载体30ul，短暂振荡后，加入脂质体转染试剂16ul，振荡混勻，室温孵育混合物IOminJl 去细胞培养基，将混合物短暂振荡混勻，加入一个细胞培养孔中，37°C培养lh，每孔加入预 热到37°C的无血清和抗生素培养基1. 5ml，置于5% C02、37°C细胞培养箱中培养24h ；c、换 成步骤一中细胞生长培养液，继续培养24h。本实施方式中Kcnmal基因在体外培养的乳腺上皮细胞中过量表达后，检测体 外培养的乳腺上皮细胞中乳蛋白合成能力的变化以及乳腺上皮细胞增殖能力的变化; Weatern Blot检测结果如图1所示，可见Kcnmal基因过表达的细胞酪蛋白表达能力明显增 强，PSTAT5表达量增加；流式细胞仪检测细胞周期结果如图2所示，可见Kcnmal基因过表 达的细胞分裂增殖更加活跃，更多的细胞处于分裂期；实验结果表明，Kcnmal基因过表达 使细胞酪蛋白合成能力增强(P < 0. 05)，并且Kcnmal基因过表达的细胞增殖活性增加(P < 0. 05)。本实施方式步骤二中PCR扩增出Kcnmal基因的全序列进行RNA干扰实验设计合 成3对干扰小RNA序列，通过脂质体转染乳腺上皮细胞后筛选最佳干扰序列、最佳干扰剂量 和最佳干扰时间；结果如图3所示，使用干扰片作用24小时效果较好，当目的基因被沉默后 检测乳腺上皮细胞的增殖分化、酪蛋白产量和stat5信号通路启动情况；从结果可以看出， Kcnmal基因沉默使细胞酪蛋白合成能力下降(P < 0. 05)，并且Kcnmal基因被干扰的细胞 增殖活性降低(P <0.05) ；Weatern Blot检测结果如图4所示，可见Kcnmal基因沉默的乳 腺上皮细胞酪蛋白合成量下降，PSTAT5表达量降低，这都表明此时乳腺上皮细胞的乳蛋白 合成能力下降；流式细胞仪检测细胞周期结果如图5所示，可见Kcnmal基因沉默的乳腺上 皮细胞分裂增殖变得不活跃，处于分裂期的细胞减少。实验表明=Kcnmal基因是奶牛乳腺中影响细胞增殖以及乳蛋白合成的重要功 能基因，在奶牛乳腺发育以及泌乳功能中起着重要的关键性作用；通过对Kcnmal基因的
7调控，可以改变奶牛乳腺的泌乳机能，达到改变泌乳性状，增加经济效益的目的；证明了 Kcnmal基因在乳腺中具有特定的胜利功能，并可用于基因调控改变动物生产性能等相关应用。
具体实施方式
二 本实施方式与具体实施方式
一不同的是步骤二中PCR扩增的反 应体系为25 μ L反应体系，由下列成分组成
权利要求
一种促进奶牛乳腺上皮细胞发育及泌乳的方法，其特征在于促进奶牛乳腺上皮细发育及泌乳的方法按以下步骤进行一、取荷斯坦牛泌乳期组织样并采用胶原酶 胰酶消化法分离上皮细胞，然后置于细胞生长培养液中培养3代，得体外培养的乳腺上皮细胞；二、根据Kcnma1基因的mRNA序列设计引物，PCR扩增出Kcnma1基因的全序列，然后与pGEM T载体进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，获得克隆载体质粒；三、pSV β GalactosidaseControl Vector质粒和克隆载体质粒分别使用AgeI和XbaI进行双酶切，回收所需目的片段，连接并构建表达载体，再用表达载体转染体外培养的乳腺上皮细胞，使Kcnma1基因在体外培养的乳腺上皮细胞中过量表达，即完成奶牛乳腺上皮细发育及泌乳的促进；其中步骤一中细胞生长培养液由90ml的DMEM高糖培养基、10ml的FBS和10ml浓度为50mg/ml的胰岛素、100μl 10万单位/ml的青霉素和100μl 10万单位/ml的链霉素组成；步骤二中PCR扩增所用上游引物为5′ GCACCGGTTGCTAGCTATGGCAAATGGTGGC 3′，下游引物为5′ GCTCTAGAGGCAGTGGATACACACATCAGAG 3′，而且在上下游引物的5′端分别添加了限制性内切酶AgeI和XbaI的酶切位点。
2.根据权利要求1所述的一种促进奶牛乳腺上皮细胞发育及泌乳的方法，其特征在于 步骤二中PCR扩增的反应体系为25 μ L反应体系，由下列成分组成成分用量TaKaRa Ex Taq (5U/μ 1)0.25 μ 110XPCR Buffer (Mg2+Plus)5 μ 1 dNTP Mixture(各 2. 5mmol/L) 4 μ 1cDNA 模版1 μ 1上游引物(20ymol/L)1μ 1下游引物(20ymol/L)1μ 1灭菌三蒸水12. 75 μ 1PCR扩增条件为94°C变性3min，94°C变性30s，58°C退火30s，72°C延伸5min，共38个 循环，再72°C延伸10min，4°C保温。
3.根据权利要求1或2所述的一种促进奶牛乳腺上皮细胞发育及泌乳的方法，其特征 在于步骤二中连接的体系如下成分用量Kcnmal基因的全序列3. 0 μ LpGEM-T 载体l.OyL2 X Buffer5. 0 μ LT4连接酶l.OyL 。
4.根据权利要求3所述的一种促进奶牛乳腺上皮细胞发育及泌乳的方法，其特征在于 步骤二中PCR扩增出Kcnmal基因的全序列为gttgctagct atggcaaatg gtggcggcgg cggcggcggcggcggcggaggcagcagtct60tagaatgagc agcaatatcc acgcgaacca tctcagcctagacgcgtcctcctcctcctc120ttcttcctcc tcctcctctt cctcgtcgtc ctcggtccacgagcccaagatggatgcgct180catcatcccg gtgaccatgg aggtgccgtg cgacagccggggccaacggatgtggtgggc240tttcctggcc tcctccatgg tgactttctt cggcggcctcttcatcatcttgctctggag300gacgctcaagtacctgtggaCCgtttgCtgccactgcgggggcaaaacgaaggaggccca360gaagattaacaatggctcaagccaggcagatggcactctcaagccagtggatgaaaaaga420ggagacggtggcagccgaggtcggctggatgacctccgtgaaagactgggcgggggtgat480gatatctgcccagacgctgactggcagagtcctggttgtcttagtctttgctctcagcat540tggtgcacttgtaatatacttcatagattcgtcaaacccaatagaatcctgccagaattt600ctacaaagatttcacattacagatcgacatggcgttcaacgtattcttccttctctactt660tggcttgcggtttattgcagccaacgataagctatggttctggcttgaagtgaactctgt720ggtagatttcttcacggtccCCCCtgtgtttgtgtccgtgtacttaaacagaagttggct780tggtttgagatttttaagagctctcagactgatccagttttcagaaattttacagtttct840gaatatcctgaaaacaagtaattccatcaagctggtgaatctgctctccatttttatcag900cacgtggctcacagcagccgggttcatccatttggtggagaattcaggggacccatggga960aaatttccaaaacaaccaggctcttacctactgggaatgtgtctatctgctcatggtgac1020catgtccactgttggttacggggatgtttatgcaaaaaccacgctcgggcgtctcttcat1080ggtcttcttcatcctcgggggactggccatgtttgccagctacgtccctgaaatcataga1140gttaataggaaaccgcaagaaatacgggggctcctatagtgcggttagtggaagaaagca1200catagtggtctgtggacacatcacactggagagcgtttccaacttcctgaaggactttct1260gcacaaggaccgggacgatgtcaatgtggagatcgtctttcttcacaacatctcccctaa1320cctggagctggaagccttgttcaaacgacattttactcaggtggagttttatcagggttc1380agtcctcaatccacatgatcttgcaagagtcaagatagagtcagcagatgcgtgcctgat1440ccttgccaataagtactgcgcagaccccgatgctgaagatgcctccaacatcatgagagt1500catctccataaagaactaccacccgaagataagaatcatcactcagatgctgcagtatca1560caataaggcccatctgctaaacatcccgagctggaattggaaagagggggatgatgcaat1620ctgcctcgcagaactgaagctggggttcatcgcccagagctgcctggctcaagggctctc1680caccatgctcgccaacctcttctccatgaggtcattcataaagattgaggaagacacgtg1740gcagaaatactacttggaaggagtctcaaatgaaatgtacacagaatatctctccagtgc1800CttCgtgggtctgtccttcccgactgtttgtgagctgtgttttgtgaagctcaagcttct1860catgatagccattgagtacaagtccgccaatcgagagagccgtatattaattaatcctgg1920aaaccatcttaagatccaagaaggtactttaggatttttcatcgcaagtgatgccaaaga1980agttaaaagggcatttttttactgcaaggcctgtcatgatgacatcacggatcccaaaag2040gataaaaaaatgcggctgcaaacggcttgaagatgaacagccgtcgacactgtcacccaa2100aaaaaagcagcgcaacggaggcatgcggaactcacccagctcgtcgcccaagctgatgag2160gcatgaccccttgttaattcctggcaatgatcagattgacaacatggactccaatgtgaa2220gaaatatgactctactgggatgtttcactggtgtgcgcccaaggagatagagaaagtcat2280cctgacccgaagtgaagctgccatgaccgtcctgagcggccacgtggtggtctgcatctt2340tggcgacgtcagctctgccctgattggccttcggaacctggtgatgccgctccgtgccag2400caactttcactaccacgagctcaagcacatCgtgtttgtgggctccatcgagtacctcaa2460gcgggaatgggagacactgcataacttccccaaggtttccatcttgcctggtacgccatt2520aagtcgggctgatttaagggccgtcaacatcaacctctgtgacatgtgcgttatcctgtc2580agccaatcagaataatattgatgatacttcgctgcaggacaaggaatgcatcttggcgtc2640actcaacatcaaatctatgcagtttgatgacagcatcggggtcttgcaggctaattccca2700agggttcacacctccaggaatggaccgatcctcaccagataacagcccggtacatgggat2760gttacgccagccctccatcactactggggtcaacatccccatcatcactgaactagtgaa2820cgatactaatgttcagtttttggaccaagacgatgacgatgaccccgacacagaactgta2880cctcacgcagccgtttgcatgtgggacagcgttcgccgtcagtgtcctggattcactcat2940gagcgcaacatacttcaatgacaacatccttaccctgatacggaccctggtgactggagg3000agccacaccagagctggaggctttgatcgctgaggagaatgcactccgcgggggctacag3060caccccccagacgctggccaacagggaccgCtgCCgtgtggcccagttagcgctgctgga3120CgggCCCtttgcggacctgggggatggtggttgttatggtgatctgttctgcaaagctct3180gaaaacatacaatatgctttgttttggaatttatcggctgagagatgctcacctcagcac3240ccccagccagtgcacgaagaggtatgtcatcaccaaccccccgtacgagtttgagctcgt3300gccgacggacctgatcttctgcttaatgcagtttgaccacaacgccggccagtcccgggc3360cagcctctcccattcctcccactcgtcccagtcctctagcaagaagagctcctccgtcca3420ctccatcccatccacggcaaaccgacagaaccggcccaagtcccgggagtcccgagacaa3480acagaagtacgtgcaggaagagcggctctgatgtgtgtatccactgcctc3530。全文摘要
一种促进奶牛乳腺上皮细胞发育及泌乳的方法，它涉及一种促进乳腺发育及泌乳的方法。方法一、体外培养的乳腺上皮细胞；二、设计引物，PCR扩增出Kcnma1基因的全序列，然后与pGEM-T载体进行连接，再转化大肠杆菌DH5α，得克隆载体质粒；三、pSV-β-Galactosidase Control Vector质粒和克隆载体质粒进行双酶切，连接并构建表达载体，再转染体外培养的乳腺上皮细胞，使Kcnma1基因在体外培养的乳腺上皮细胞中过量表达，即完成。本发明中Kcnma1基因在泌乳期奶牛乳腺中高表达，通过实验验证了Kcnma1基因确实是能够促进奶牛乳腺上皮细胞发育以及乳产生的重要功能基因。
文档编号C12N5/10GK101962645SQ201010263328
公开日2011年2月2日 申请日期2010年8月26日 优先权日2010年8月26日
发明者侯晓明, 李庆章, 林叶, 高学军 申请人:东北农业大学