7]图3为乳腺上皮细胞经红色荧光素PE标记的荧光抗体角蛋白或波形蛋白免疫荧光染色结果(其中细胞核经DAPI染料进行染色，以成纤维细胞作为对照组)；A:乳腺上皮细胞角蛋白阳性;B:乳腺上皮细胞波形蛋白阴性;C:成纤维细胞角蛋白阴性;D:成纤维细胞波形蛋白阳性。注:细胞核为蓝色荧光，目的蛋白为红色荧光。
【具体实施方式】
[0028]为了使本发明的目的和技术方案更加完整和清楚，以下结合附图及实施例，对本发明进行详细说明。应当理解，此处所描述的实施例仅用以解释本发明，但不用于限定本发明。
[0029](1.1)组织消化液(胶原酶/透明质酸酶消化液)配制
[0030]按照每毫升DMEM/F12培养液中加入Img胶原酶(0.25?1.0FALGPA Units/mg)，250yg透明质酸酶(400?1000Unit/mg)，100IU青霉素、10yg链霉素和0.25yg两性霉素B进行配制，过滤除菌后于-20°C保存，使用前解冻并在水浴锅预热至37°C。
[0031](1.2)细胞培养液
[0032]含有体积百分比为10%胎牛血清、100IU/mL青霉素、100yg/mL链霉素和0.25yg/mL两性霉素B的DMEM/F12培养液。特别说明:未加入表皮细胞生长因子、氢化可的松、催乳素等文献报道培养奶牛乳腺上皮细胞时在培养液中的额外添加物。
[0033](1.3)胰蛋白酶消化液
[0034]按照100毫升磷酸盐缓冲液(Phosphate Buffer solut1n，PBS，下文除特别限定说明，均与此处含义相同)中加入0.25g胰蛋白酶配制而成，过滤除菌，置于4°C备用。
[0035](2)乳腺组织取材及预处理
[0036]2.1由屠宰场无菌采集因骨折而淘汰的泌乳期奶牛乳腺组织(以获取活性高的乳腺上皮细胞)，置于所述细胞培养液中，4°C低温保存，迅速带回实验室。
[0037]2.2为避免组织可能的污染，在无菌工作台中，用75%酒精冲洗乳腺组织30?40秒，然后用含有100IU/mL青霉素、100yg/mL链霉素和0.25yg/mL两性霉素B的I3BS冲洗组织3?5次，选取不含脂肪组织、结缔组织少且富含乳腺小叶的部位切取一部分乳腺组织，用眼科剪刀剪切为大约Imm3的组织碎块，并且在剪切过程中，尽量剔除结缔组织。最后I3BS冲洗组织碎块，直至PBS清亮无乳汁为止。
[0038](3)原代培养
[0039]将共计约I克组织块悬浮于含有2毫升组织消化液的60mm培养皿中，在含5%的CO2细胞培养箱中37°C消化30分钟，消化结束后，离心弃掉消化液，收集经粗略消化后的乳糜状组织块，用PBS洗涤后将组织块以Icm横向纵向间隔依次接种于60mm培养皿(图1)中，倒置于含5^^02的细胞培养箱中，于37°C略干燥2?3分钟，待组织块贴壁后翻转培养皿并缓慢加入3毫升所述细胞培养液后继续置于含5 % 0)2的细胞培养箱中，于37°C进行培养。
[0040](4)成纤维细胞去除
[0041]培养I?2天后显微镜下即可观察到有细胞(乳腺上皮细胞远多于成纤维细胞)从组织块周围迀出并贴壁生长(图2中A)，之后培养期间每隔I天更换细胞培养液I次，待迀出的细胞生长至成簇时，根据形态学判定，随时采用机械刮除法刮除呈梭形样的成纤维细胞，保留呈铺路石样生长的乳腺上皮细胞(图2中B)，培养至5?7天(即培养I?2天后继续培养4?5天)，此时大量铺路石样乳腺上皮细胞成片生长并开始相互融合(图2中C)，即可进行首次传代。
[0042](5)首次传代
[0043]首次传代前，机械刮除所有残余组织块(包括有细胞迀出和没有细胞迀出的组织块)，只保留贴壁生长的乳腺上皮细胞，弃掉陈旧培养液，PBS冲洗2?3次，利用成纤维细胞比上皮细胞对胰蛋白酶更敏感的特点，加入所述胰蛋白酶消化液I?2毫升并于37°C进行消化，每隔I?2分钟于相差显微镜下观察，直到上皮细胞簇最外层的一至两层上皮细胞呈圆形时(通常小于3分钟)，弃掉消化液，用I3BS冲洗2?3次，以去除可能混有的极少量成纤维细胞。然后再次向培养皿加入所述胰蛋白酶消化液I?2毫升，置于含5%C02的细胞培养箱37°C消化3?5分钟后，加入2毫升所述细胞培养液中止消化，并且用I毫升枪头吹打至细胞从培养皿脱落，最后将细胞悬液离心，用所述细胞培养液重悬细胞，重新种板并培养(含5 %0)2的细胞培养箱，37°C)得到的细胞即为纯度很高的乳腺上皮细胞(图2中D)。
[0044](6)传代培养及细胞冻存和复苏
[0045]首次传代培养的细胞，后续按照实验室常规细胞培养方法进行再次传代培养，并按照常规细胞冻存及复苏方法进行细胞的冻存和复苏。
[0046](7)上皮细胞纯度鉴定
[0047]7.1形态学鉴定
[0048]在相差显微镜下，本方法分离的奶牛乳腺上皮细胞在形态上均呈铺路石样生长(图 2)。
[0049]7.2波形蛋白和角蛋白的表达鉴定
[0050]文献报到(HuH,Wang J,Bu D,et al.1n vitro culture and characterizat1nof a mammary epithelial cell line from Chinese Holstein dairy cow[J].PloSone，2009,4(11): e7636.):上皮细胞表达角蛋白，不表达波形蛋白；成纤维细胞表达波形蛋白，不表达角蛋白。
[0051 ]在荧光显微镜下，本方法分离培养的乳腺上皮细胞经红色荧光素PE标记的抗体进行免疫荧光染色后，所有细胞均呈角蛋白阳性(图3中A有红色荧光)，波形蛋白阴性(图3中B无红色荧光)，蓝色荧光为细胞核经DAPI染料标记后显示的荧光，表明本方法可分离到高纯度的奶牛乳腺上皮细胞。图3中C和D为成纤维细胞对照组，分别为角蛋白阴性，波形蛋白阳性，蓝色荧光为细胞核经DAPI染料标记后显示的荧光。
[0052]本发明分离的奶牛乳腺上皮细胞可以用于细胞水平的生物学研究、制作乳腺生物反应器的靶细胞，以及作为抗病转基因牛核移植的供体细胞。
【主权项】
1.一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于:包括以下步骤: 1)将奶牛乳腺组织剪切成0.5?Imm3大小的组织块，将所述组织块用磷酸盐缓冲液清洗后置于胶原酶/透明质酸酶消化液中消化30?40分钟； 2)经过步骤I)后，通过离心收集消化成乳糜状的组织块，将消化成乳糜状的组织块接种在培养皿中，并向培养皿中加入细胞培养液，然后于37°C进行培养;培养I?2天后，开始每天机械刮除从消化成乳糜状的组织块迀出生长的成纤维细胞，保留同样迀出生长的乳腺上皮细胞，并且每隔I?2天更换细胞培养液I次，直到培养至5?7天时机械刮除所述培养皿中所有残余组织块，然后弃掉细胞培养液，并用磷酸盐缓冲液冲洗； 3)经过步骤2)后，向所述培养皿中加入胰蛋白酶消化液进行短时消化，短时消化过程中每隔I?2分钟进行观察，待乳腺上皮细胞簇最外层的细胞开始变圆时弃掉胰蛋白酶消化液，并用磷酸盐缓冲液冲洗，短时消化后向所述培养皿中再次加入胰蛋白酶消化液并进行传代。2.根据权利要求1所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于:所述步骤I)中，奶牛乳腺组织的获取方法包括以下步骤:无菌采集泌乳期奶牛乳腺组织，经表面消毒处理后，在不含脂肪组织、结缔组织少且富含乳腺小叶的部位切取一部分乳腺组织。3.根据权利要求2所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于:所述表面消毒处理包括以下步骤:将奶牛乳腺组织用75%酒精冲洗30?40秒后，再用含抗生素的磷酸盐缓冲液冲洗3?5次。4.根据权利要求1所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于:所述胶原酶/透明质酸酶消化液按照每毫升DMEM/F12培养液中加入0.5?1.5mg胶原酶、200?300yg透明质酸酶、100IU青霉素、I OOyg链霉素和0.2?0.5yg两性霉素B进行配制。5.根据权利要求1或4所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于:所述步骤I)中，胶原酶/透明质酸酶消化液的用量为每I克剪切成0.5?Imm3大小的组织块使用2?4晕升。6.根据权利要求1所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于:所述细胞培养液为含有体积分数为10?20%胎牛血清、100IU/mL青霉素、100yg/mL链霉素和0.2?0.5yg/mL两性霉素B的DMEM/F12培养液。7.根据权利要求1或6所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于:所述步骤2)中，细胞培养液的用量为每I克剪切成0.5?Imm3大小的组织块对应使用2?3毫升。8.根据权利要求1所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于:所述胰蛋白酶消化液按照每100毫升磷酸盐缓冲液中加入0.2?0.5g胰蛋白酶进行配制。9.根据权利要求1或8所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于:所述步骤3)中，培养皿中胰蛋白酶消化液的加入量均为每I克剪切成0.5?Imm3大小的组织块对应加入I?2晕升。10.根据权利要求1所述一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法，其特征在于:所述短时消化的时间为小于3分钟。
【专利摘要】本发明公开了一种原代奶牛乳腺上皮细胞的分离培养方法：将泌乳期奶牛的乳腺组织剪切成组织块后用胶原酶/透明质酸酶消化液消化，将消化后呈乳糜状的组织块接种在培养皿进行培养，1～2天后组织块周围即有细胞游离出组织并贴壁生长，之后培养期间，每天采用机械刮除法去除梭形样成纤维细胞，直至大约4～5天后大量铺路石样乳腺上皮细胞成簇成片生长并互相融合时进行首次传代。首次传代时利用差速消化法使用胰蛋白酶消除可能混杂的极少量成纤细胞，即得到纯度很高的奶牛乳腺上皮细胞。本方法中乳腺上皮细胞可以在短时间从乳糜状组织中迁出；并且主要采用机械刮除法去除少量混杂的成纤维细胞污染，因此获得的乳腺上皮细胞损伤小、纯度高。
【IPC分类】C12N5/071
【公开号】CN105543164
【申请号】CN201610112297
【发明人】高明清, 张涌, 张文耀, 和桂良, 陈青, 徐彤
【申请人】西北农林科技大学
【公开日】2016年5月4日
【申请日】2016年2月29日