一种am真菌菌剂的生产方法
【专利摘要】本发明涉及一种真菌菌剂的生产方法，尤其是涉及一种AM真菌菌剂的生产方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：玉米催芽、接种、苗期管理、菌剂质量分析：接种4月后，采集宿主植物的根系，采用Phillips和Hayman染色方法进行AM真菌侵染状况和侵染率调查，进行菌剂的质量评价；本发明方法独特、菌剂质量高、侵染率高。
【专利说明】-种AM真菌菌剂的生产方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种真菌菌剂的生产方法，尤其是涉及一种AM真菌菌剂的生产方法。
【背景技术】
[0002] 菌根（Mycorrhiza)是菌根真菌与植物根系形成的共生体。自然界中93%以上的 植物都能形成菌根。AM真菌又称丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhiza Fungi,简称AMF)。 前人研究认为，AM真菌能够促进植物对矿质养分尤其是磷和微量元素的吸收，增强植物抵 抗养分胁迫的能力，减少氮、磷肥的使用量和流失，从而避免水体富营养化。同时，其菌丝可 以形成菌丝桥，在不同植株间传递养分，成为生态系统养分循环的重要通道。AM真菌能够 提高植物的抗逆性：能改善植物的水分状况，提高植物的抗旱能力；能提高植物抗盐胁迫 的能力；能够提1?植物抗有机污染能力；能提1?植物的抗病能力；能提1?植物对重金属污 染的抵御能力。
[0003] AM真菌在林木育苗方面应用较广，且效应显著。林先贵等（2002)对16种不同 种类植物对菌根的依赖性进行测定，除菊花外，其余植物都有较高的依赖性，但依赖强度存 在差异。同时，接种菌根后，株高、地上部分、地下部分鲜重和侵染率都大于对照。黄春梅 等（2005)对孟加拉粉大蕉试管苗接种光壁无梗囊霉（Acaulospota Iaevis)、苏格兰球囊 霉（Glomus caledonium)和摩西球囊霉（Glomus mosseae)，认为菌根的形成对其苗高生 长有促进作用。张林平等（2002)用摩西球囊霉（Glomus mosseae)、根内球囊霉（Glomus intraradices)和地表球囊霉（Glomus versiforme)接种温室营养钵银杏幼苗后，均能显 著提高苗高、叶数、叶面穗和叶片干重。刘建福等（2005)研究表明AM真菌能够促进澳洲 坚果幼苗的生长，增强根系活力，促进根系对矿质养分的吸收和累积，并促进植株的光合作 用。苹果是典型的AM真菌的宿主植物，对菌根真菌的依赖性较强。AM真菌能促进苹果树对 矿质营养和水分的吸收和利用，显著影响苹果树生长和内源激素含量，提高苹果树的抗病 性。宋富强等（2004)研究认为AM真菌接种大青杨苗木，能显著促进苗木苗高、地径、总干 生物量的增加，同时增加苗木对难溶性P肥的吸收和利用。AM真菌的宿主范围相当广泛，除 了在树木上外，对蔬菜、粮食作物也有很好的接种效果。利用AM真菌接种青椒、西瓜、草莓、 香蕉、玉米和沼泽稻（Waterland rice)等均取得很好的接种效果。
[0004] 以上AM真菌对植物的有益作用仅限于小规模的科学实验，在生产上的大面积的 应用还未见报道，其主要原因是AM真菌的菌剂生产技术不够成熟，生产的菌剂质量不高， 侵染率低。
[0005] 目前还没有克服上述缺陷的方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是克服现有技术的缺陷，提供一种方法独特、菌剂质量高、侵染率高 的一种AM真菌菌剂的生产方法。
[0007] 本发明通过如下方式实现：
[0008] -种AM真菌菌剂的生产方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
[0009] a、玉米催芽：挑选籽粒饱满、无破损、无虫咬的栽培用玉米种子，先用75%酒精溶 液灭菌30s，再用无菌水冲洗5次，置于培养箱中，温度为28°C，暗催芽；
[0010] b、接种：每个花盆中先填充1/3的培养基质，然后撒0. 5?I. Ocm接菌剂，再铺1/3 的培养基质，每盆撒20?25粒红三叶草种子和3粒已催芽的玉米，盆中用灭菌河沙基质填 充，浇水；
[0011] C、苗期管理：配置Hoagland营养液，使用方法：幼苗期，每周一次浇1/2强度的营 养液，所有营养元素减半，IOOmL/盆；成苗后，每周一次全营养液，也可磷减半；收获期，不 再浇营养液至少4个月以后，以上针对全沙培养基质；
[0012] d、菌剂质量分析：接种4月后，采集宿主植物的根系，采用Phillips和Hayman染 色方法进行AM真菌侵染状况和侵染率调查，进行菌剂的质量评价；
[0013] 所述菌种为摩西球囊霉、缩球囊霉、根内球囊霉和地表球囊霉；所述宿主植物为玉 米、红三叶草；所述培养基质为纯河沙；所述培养容器为18cmX 24cm的塑料花盆；所述容器 的消毒：75%的乙醇溶液擦拭花盆；
[0014] 所述PhiIlips和Hayman的染色方法：挖取容器中正常生长的宿主植物毛细根，清 洗后剪成Icm长根段置于FAA固定液中固定24h后，把固定液彻底冲洗净，加入10% KOH溶 液浸透根样，90°C中加热lh，用清水洗去Κ0Η，加碱性双氧水软化根段，室温下放置20min后 洗去碱性H 2O2，加入5%乳酸溶液或1% HCl酸化3 - 4min后倒去乳酸溶液，加入曲利苯蓝 染色液于90°C中加热30min，使染料很快渗透到根组织和真菌的细胞中，染色后，将根样放 到乳酸甘油中浸泡除去多余的染料，使菌根的菌丝、泡囊和丛枝保持染色状态，然后制片， 在显微镜下观察丛枝、泡囊、菌丝的结构特征。统计根段中菌根真菌侵染的根段数，根据以 下公式，计算侵染率及侵染等级：
[0015] 菌根侵染率=有菌根感染的根段长度/检查根段总长度X 100%
[0016] 侵染等级：1级一受感染的营养根占观察总根数的0?5%
[0017] 2级--受感染的营养根占观察总根数的6?25%
[0018] 3级--受感染的营养根占观察总根数的26?50%
[0019] 4级--受感染的营养根占观察总根数的51?75%
[0020] 5级--受感染的营养根占观察总根数的76?100% ;
[0021] 所述FAA固定液为甲醛6ml、冰醋酸1ml、酒精20ml、蒸馏水40ml比例配置，所述碱 性双氧水为3mlNH 40H加到30ml 10 % H2O2中，加水60ml混匀即可；
[0022] 所述纯河沙是河沙过2mm筛，沙粒的粒径< 2mm，水冲洗3遍，先用0. 5 %的高猛酸 钾溶液喷洒，再用薄膜覆盖，太阳下暴晒3天，掀膜后晾晒3天所得。
[0023] 本发明有如下效果：
[0024] 1)方法独特：本发明提供的AM真菌菌剂的生产方法，其包括玉米催芽、接种、苗期 管理、菌剂质量分析；本发明通过对摩西球囊霉（Glomus mosseae(Nicolson&Gerdemann) Gerdemann&Trappe)、缩球囊霉（GlomusconstrictumTrappe)、根内球囊霉（Glomus intraradices Schenck&Smith)和地表球囊霉（Glomus versiforme (Kaisten) Berch)四种 AM真菌的扩繁，生产出高质量的AM真菌菌剂，并利用自繁的菌剂进行了接种实验，实现了 枸杞的菌根化育苗，马铃薯和芹菜的大田接种，取得了很好的接种效果。
[0025] 2)侵染率高：本发明采用了红三叶草和玉米两种植物作为宿主植物，对缩球囊 霉、摩西球囊霉、根内球囊霉和地表球囊霉四种AM真菌进行菌种扩繁。如表1所示：四种AM 真菌对三叶草和玉米的侵染率均在90%以上，
[0026] 表1扩繁的AM真菌菌剂的侵染率
[0027]
【权利要求】
1. 一种AM真菌菌剂的生产方法，其特征在于：该方法包括如下步骤： a、 玉米催芽：挑选籽粒饱满、无破损、无虫咬的栽培用玉米种子，先用75%酒精溶液灭 菌30s，再用无菌水冲洗5次，置于培养箱中，温度为28°C，暗催芽； b、 接种：每个花盆中先填充1/3的培养基质，然后撒0. 5?1. 0cm接菌剂，再铺1/3的 培养基质，每盆撒20?25粒红三叶草种子和3粒已催芽的玉米，盆中用灭菌河沙基质填 充，浇水； c、 苗期管理：配置Hoagland营养液，使用方法：幼苗期，每周一次烧1/2强度的营养 液，所有营养元素减半，l〇〇mL/盆；成苗后，每周一次全营养液，也可磷减半；收获期，不再 浇营养液至少4个月以后，以上针对全沙培养基质； d、 菌剂质量分析：接种4月后，采集宿主植物的根系，采用Phillips和Hayman染色方 法进行AM真菌侵染状况和侵染率调查，进行菌剂的质量评价。
2. 如权利要求1所述的一种AM真菌菌剂的生产方法，其特征在于：所述菌种为摩西球 囊霉、缩球囊霉、根内球囊霉和地表球囊霉；所述宿主植物为玉米、红三叶草；所述培养基 质为纯河沙；所述培养容器为18cmX24cm的塑料花盆；所述容器的消毒：75%的乙醇溶液 擦拭花盆。
3. 如权利要求1所述的一种AM真菌菌剂的生产方法，其特征在于：所述Phillips和 Hayman的染色方法：挖取容器中正常生长的宿主植物毛细根，清洗后剪成lcm长根段置于 FAA固定液中固定24h后，把固定液彻底冲洗净，加入10% K0H溶液浸透根样，90°C中加热 lh，用清水洗去K0H，加碱性双氧水软化根段，室温下放置20min后洗去碱性H202，加入5% 乳酸溶液或1% HC1酸化3 - 4min后倒去乳酸溶液，加入曲利苯蓝染色液于90°C中加热 30min，使染料很快渗透到根组织和真菌的细胞中，染色后，将根样放到乳酸甘油中浸泡除 去多余的染料，使菌根的菌丝、泡囊和丛枝保持染色状态，然后制片，在显微镜下观察丛枝、 泡囊、菌丝的结构特征。统计根段中菌根真菌侵染的根段数，根据以下公式，计算侵染率及 侵染等级： 菌根侵染率=有菌根感染的根段长度/检查根段总长度X 100% 侵染等级：1级--受感染的营养根占观察总根数的〇?5% 2级--受感染的营养根占观察总根数的6?25% 3级--受感染的营养根占观察总根数的26?50% 4级--受感染的营养根占观察总根数的51?75% 5级--受感染的营养根占观察总根数的76?100%。
4. 如权利要求3所述的一种AM真菌菌剂的生产方法，其特征在于：所述FAA固定液为 甲醛6ml、冰醋酸lml、酒精20ml、蒸馏水40ml比例配置，所述碱性双氧水为3mlNH40H加到 30ml 10% H202中，加水60ml混匀即可。
5. 如权利要求2所述的一种AM真菌菌剂的生产方法，其特征在于：所述纯河沙是河沙 过2mm筛，沙粒的粒径< 2mm，水冲洗3遍，先用0. 5%的高锰酸钾溶液喷洒，再用薄膜覆盖， 太阳下暴晒3天，掀膜后晾晒3天所得。
【文档编号】C12N1/14GK104371932SQ201410561531
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月21日 优先权日:2014年10月21日
【发明者】王亚军, 安巍, 罗青, 唐明, 曹有龙, 石志刚, 赵建华, 张海涵, 刘洪光, 张曦燕, 尹跃 申请人:宁夏农林科学院