专利名称：酶消化法联合egf培养人羊膜间充质干细胞的方法
技术领域：
本发明涉及生物技术领域的一种培养人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的方法，特别涉及一种采用酶消化法联合表皮生长因子(EGF)来培养人羊膜间充质干细胞的方法。
背景技术：
正常人羊膜组织结构分为上皮细胞层、基底膜、致密层、纤维细胞层及海绵层，其中人羊膜间充质干细胞(human amnion membranemesenchymal stem cells, hAMSCs)位于羊膜的最内层，是在受精后第8天从外胚叶发育而来，使其可能维持原肠胚形成前期胚胎干细胞的可塑性，拥有更大的多向分化潜能，hAMSCs理论上可以分化成各种组织细胞，同时因羊膜获得方便且回避了伦理学争议，有潜力成为未来临床应用的干细胞来源之一。hAMSCs原代培养分为组织块培养和酶消化法培养，组织块培养由于不是每个组织块都能培 养成功，且容易混杂有成纤维细胞污染，培养形成单层的时间较长，不利于快速大量获取细胞，难以满足干细胞研究的需要；酶消化法鉴于羊膜组织结构致密，结构致密，用酶一次消化时间过长对细胞损伤较大，时间太短得到的细胞数量太少。因此有必要建立一种在体外分离、纯化并大量扩增和诱导分化hAMSCs的方法。
发明内容
为建立一种在体外分离、纯化并大量扩增和诱导分化hAMSCs的方法，本发明提供一种采用酶消化法联合表皮生长因子(EGF)培养人羊膜间充质干细胞的方法，通过采用胰蛋白酶和胶原酶分步多次消化来收集羊膜细胞，此时的羊膜细胞是上皮细胞、间质干细胞、成纤维细胞等多种细胞的混合物，加入表皮生长因子(EGF)，将贴壁培养和消化时间控制相结合，可获得纯度和活性较高人羊膜间充质干细胞。具体的，本发明的酶消化法联合EGF培养人羊膜间充质干细胞的方法包括如下步骤hAMSCs的分离，hAMSCs的原代培养，hAMSCs的传代培养与扩增，hAMSCs的冻存和复苏，以及hAMSCs细胞免疫表型的检测。其中，所述hAMSCs的分离步骤包括无菌条件下取产后弃置的新鲜胎盘，采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-Hanks液冲洗数次以清除残留血迹，将漂洗后的羊膜用眼科剪剪成约Imm3碎块，加入胰蛋白酶37°C消化10分钟；加入含小牛血清的DMEM终止消化，并轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤；过滤后的羊膜组织中加入II型胶原酶消化液，37°C消化30分钟；加入含小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，收集细胞；1000转/分钟离心5分钟；台盼兰染色计数活细胞，调整细胞密度为IX 106/ml，接种至培养瓶，加入含bFGF和FBS的DMEM培养基；置37°C、饱和湿度、体积分数5%的CO2培养箱内培养，倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，隔天换液I次，并摄片记录；待细胞汇合度达80%后，用O. 25%胰蛋白酶-O. 02% EDTA溶液于37°C消化2-3分钟，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1000转/分钟离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，以IXlOVml的细胞密度传代；传代过程中，隔日换液I次，待细胞长满70%瓶底重复以上步骤。所述hAMSCs的原代培养步骤包括将羊膜细胞悬液移入离心管，配平，2000rpm离心15分钟，弃上清，收集细胞；将收集的细胞用PBS吹打成均匀悬液，1500转/分钟进行15分钟洗涤，收集细胞；接种细胞前吸取FBS加入细胞培养瓶，置37°C，5% CO2，饱和湿度培养箱孵育30分钟，对培养瓶进行包被；弃包被液，用含20% FBS,4ng/ml表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1. OXlO6细胞/ml，接种于包被后的细胞培养瓶中，置于37°C，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动态观察；培养4-5天后全量换液,弃去未贴壁细胞，以后每3-4天半量换液一次。观察细胞贴壁生长至80-90%汇合时，以O. 25%胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化，所得细胞为原代细胞。所述hAMSCs的传代培养与扩增步骤包括观察原代hAMSCs细胞贴壁生长至80-90%汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入O. 25%胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化液浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察，见细胞 间隙增大，胞质回缩，摇动吹打后见细胞呈圆形漂起时加入FBS中止胰酶消化；加入PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分钟离心10分钟；弃去上清液，加入DMEM/F12重悬细胞，按1: 2-1 : 3比例传代培养；培养体系为20% FBS,4ng/ml EGF的DMEM/F12完全培养液15ml/瓶；置37°C，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，计为第I代hAMSCs，待细胞生长至80-90%汇合时，重复上述操作进行多代细胞培养扩增。所述hAMSCs细胞免疫表型的检测步骤包括取培养第2或第3代细胞，首先用胰蛋白酶消化后，然后用含小牛血清白蛋白的PBS调整细胞浓度至IXlOVml ;分别加入鼠抗人单克隆抗体，置4°C孵育半小时，PBS洗I次，进行流式细胞仪检测分析。优选的，所述的hAMSCs的冻存和复苏步骤中，所述的hAMSCs的冻存操作如下取出所需试剂，配制冻存液，每个冻存管中加入人AB血清350ul和DMS0150ul，置于冰上预冷；取出需要冻存的细胞，吸弃培养瓶中原有的培养基，用PBS缓冲液轻轻清洗后，吸弃洗液；每瓶中加入胰酶-EDTA工作液，浸漫覆盖瓶底，放入37°C孵箱中2-3分钟；在倒置显微镜下观察见细胞呈圆形飘起时，加入胎牛血清中止胰蛋白酶消化；每瓶中加入完全培养液，反复吹打，用微量加样枪吸出少许用做细胞计数；将细胞悬液移入离心管中，1000转/分钟离心5分钟，离心结束，吸弃上清；向离心管中加入人AB血清，充分混匀，待用；将上述脐带源间充质干细胞悬液加入到冻存管中，封盖，震荡，充分混匀，放置在4°C冰箱30分钟后迅速移入到-80°C，24小时后，移入液氮中，进行长期保存。再优选的，所述的hAMSCs的冻存和复苏步骤中，所述hAMSCs的复苏的操作包括取出所需试剂，平衡至室温，准备370C水浴备用；从液氮中迅速取出需要复苏的冻存管，立即于37°C水浴中迅速融化；用酒精棉球擦拭冻存管盖周围，旋开管盖；在超净台内将冻存管内的细胞移入到无菌离心管内，缓慢逐滴加入DMEM/F12培养液，轻轻混匀；1000转/分钟离心5分钟，弃上清；加入DMEM/F12完全培养液重悬细胞后接种，每个培养瓶中补加新的完全培养液；置5% C02，饱和湿度，37°C培养箱重新培养。本发明的酶消化法联合联合EGF，将贴壁培养和消化时间控制相结合，具有操作简单快速，实用稳定等优点，不失为一种较为有效的分离纯化方法。
通过下面结合附图的详细描述，本发明前述的和其他的目的、特征和优点将变得显而易见。其中图1所示为本发明的酶消化法联合表皮生长因子(EGF)培养人羊膜间充质干细胞的方法的步骤流程图。
具体实施例方式如图1所示，本发明的一实施例的酶消化法联合表皮生长因子(EGF)培养人羊膜间充质干细胞的方法包括如下步骤S1、人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的分离无菌条件下取产后弃置的新鲜胎盘(经家属同意)，采用机械法将羊膜从胎盘组 织上剥离，用D-Hank’s液冲洗数次以清除残留血迹，将漂洗后的羊膜用眼科剪剪成约lmm3碎块，加入2. 5g/L胰蛋白酶370C消化IOmin ;加入含5 %小牛血清的DMEM终止消化，并轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤；过滤后的羊膜组织中加入1.0g/L II型胶原酶消化液，370C消化O. 5h ;加入含5%小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，收集细胞；1000r/min,离心5min ;台盼兰染色计数活细胞，调整细胞密度为I X 106/ml，接种至25cm2培养瓶，加入含10ng/ml bFGF和10% FBS的DMEM培养基；置370C、饱和湿度、体积分数5%的C02培养箱内培养，倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，隔天换液I次，并摄片记录；待细胞汇合度达80%后，用O. 25%胰蛋白酶-O. 02%EDTA溶液于37°C消化2-3min，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1000r/min，离心5min，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，以I X IOVml的细胞密度传代。传代过程中，隔日换液I次，待细胞长满70%瓶底重复以上步骤。S2、hAMSCs 的原代培养将羊膜细胞悬液移入离心管，配平，2000rpmX15分钟离心，弃上清，收集细胞；将收集的细胞用O. OlM PBS 30mL吹打成均匀悬液，1500rpmX 15分钟洗涤2次，收集细胞；接种细胞前吸取FBS 3mL加入T75cm2型细胞培养瓶，置37°C，5 % CO2，饱和湿度培养箱孵育30分钟，对培养瓶进行包被；弃包被液，用含20% FBS,4ng/ml表皮生长因子Gpidermalgrowth factor, EGF)的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1. OX IO6细胞/ml，接种于包被后的T75cm2型细胞培养瓶中，置于37°C,5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动态观察；培养4-5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3-4天半量换液一次。观察细胞贴壁生长至80-90%汇合时，以0. 25%胰蛋白酶-0. 01% EDTA消化，所得细胞为原代细胞。首先应用高密度贴壁细胞培养I XlOVml，原代细胞聚集成团块状，团块中可形成少量克隆球，但克隆球生长缓慢。原代培养24-48小时后，可见细胞从组织块中爬出，围绕在组织块周围，呈放射状向外生长。UC-MSC呈贴壁生长，悬浮细胞可经过多次换液去除，细胞逐渐得以纯化。培养5d后后吸出部分细胞改为I X 106/ml培养，克隆球形成和生长明显增快。首次换液发现，每高倍镜视野(倒置显微镜X 100倍)下大约有200个细胞贴壁，其中处于有丝分裂期的极强折光性大细胞平均大约有5个，少数散在的贴壁细胞出现分化现象；培养I周时倒置显微镜可见贴壁细胞呈梭形、多角形，增长速度较快。2周时极强折光性大细胞数量增多，至每高倍视野下大约有20个，成为形态相对均一的梭形细胞，呈放射状排列生长或旋涡状生长，多数贴壁未分裂的原代细胞和分化细胞开始脱落死亡，此时经多次换液去除悬浮细胞，细胞密度由IXlOVml降至IXioVml左右，无细胞聚集现象；第2_3周可形成80%融合的的单层贴壁细胞层，3周时已经有极强折光性大细胞开始形成紧密小克隆球(大约5 20个细胞组成，直径约40 60 μ m) ;4周时已有大量大小不等的克隆球形成，许多大克隆球(直径大于200 μ m)已脱壁悬浮生长。S3、hAMSCs的传代培养与扩增观察原代hAMSCs细胞贴壁生长至80-90%汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取IOml O. OlM PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；加入O. 25%胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化液1. 0ml，浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察，见细胞间隙增大，胞质回缩，摇动吹打后见细胞呈圆形漂起；加入1. Oml FBS中止胰酶消化；加入IOml O. OlMPBS反 复吹打冲洗，在室温下900rpmX 10分钟离心；弃去上清液，加入IOml DMEM/F12重悬细胞，按1: 2-1 : 3比例传代培养；培养体系为20% FBS，4ng/ml EGF的DMEM/F12完全培养液15ml/瓶。置37°C，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，计为第I代(passage 1，Pl)hAMSCs，待细胞生长至80-90%汇合时，重复上述操作进行P2、P3、P4…代细胞培养扩增。当细胞贴壁生长至80-90%融合时，用O. 25%胰蛋白酶-0.01% EDTA消化，按1:2-1: 3的比例传代。传代细胞于接种后3-6小时迅速贴壁，最初为短粗的梭形或卵圆形。在接种的第2天，细胞伸展为长梭形或多角状，体积较大，细胞均匀分布。传代后细胞增殖速度明显加快，在接种后第2-3天增长趋势最为显著，数量明显增多，生长较均匀一致。传代后3-4天时，细胞长满培养瓶底，融合成片状，低倍镜下细胞排列紧密，整齐有序，出现漩涡样结构，杂质细胞已明显少见。S4、hAMSCs的冻存和复苏其中，所述的hAMSCs的冻存操作如下I)取出所需试剂，配制冻存液。每个冻存管中加入人AB血清350ul和DMS0150ul，置于冰上预冷。在冻存管上详细标记细胞情况，如种类、代数以及冻存时间等；2)取出需要冻存的细胞，吸弃培养瓶中原有的培养基。用20ml PBS缓冲液轻轻清洗两次后，吸弃洗液3)每瓶中加入O. 25%胰酶-O. 04% EDTA工作液1ml，浸漫覆盖瓶底，放入37°C孵箱中2-3分钟；4)在倒置显微镜下观察见细胞呈圆形飘起时，加入1. Oml胎牛血清中止胰蛋白酶消化。如果细胞不易飘起，可用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞完全消化下来；5)每瓶中加入完全培养液20ml，反复吹打。用微量加样枪吸出少许用做细胞计数。6)将细胞悬液移入50ml离心管中，离心IOOOrpmX5分钟，离心结束，吸弃上清。7)向离心管中加入1. Oml人AB血清，充分混匀，待用。8)将上述脐带源间充质干细胞悬液加入到冻存管中，封盖，震荡，充分混匀，放置在4°C冰箱30分钟后迅速移入到_80°C。9)24小时后，移入液氮中，进行长期保存。所述hAMSCs的复苏的操作包括
I)取出所需试剂，平衡至室温。准备370C水浴备用；2)从液氮中迅速取出需要复苏的冻存管，确认后立即于37°C水浴中迅速融化；3)用酒精棉球擦拭冻存管盖周围，旋开管盖；4)在超净台内将冻存管内的细胞移入到50ml无菌离心管内。缓慢逐滴加入20mlDMEM/F12培养液，轻轻混匀，尽量不要产生气泡；5)离心，IOOOrpmX 5分钟，弃上清；6)加入IOml DMEM/F12完全培养液重悬细胞后接种，每个培养瓶中补加新的完全培养液至15ml。置5% C02，饱和湿度，37°C培养箱重新培养；7)在培养瓶上标记细胞相关信息，如种类、代数以及复苏时间等。
S5、hAMSCs细胞免疫表型的检测取培养第2或第3代细胞，首先用O. 25%的胰蛋白酶消化后，然后用含1%小牛血清白蛋白的PBS调整细胞浓度至I X 107/ml。分别加入下列鼠抗人单克隆抗体⑶34-FITC、CD45-PE、CD19-FITC、CD29-FITC、CD44-PE、CD105-FITC、CD106-FITC、HLA-DR-FITC，置 4°C孵育半小时，PBS洗I次，进行流式细胞仪检测分析。流式细胞仪检测显示，hAMSCs表达CD29、CD44 和 CD105,不表达 CD34、CD45、CD19、HLA-DR 和 CD106。。本实施例采用采用胰蛋白酶和胶原酶分步多次消化来收集羊膜细胞，此时的羊膜细胞是上皮细胞、间质干细胞、成纤维细胞等多种细胞的混合物，但在加入4ng/ml表皮生长因子(EGF)，将贴壁培养和消化时间控制相结合，获得纯度和活性较高人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)。根据hAMSCs贴壁生长的特点，培养2_3天后可见hAMSCs基本贴壁，因此在原代培养末期即可以获得均一性较好的hAMSCs。同时发现，尽管使用了贴壁密度梯度法，在原代培养体系中仍然存在一些造血系细胞，这些细胞在加入4ng/ml EGF后大部分不能贴壁，随换液而被去除，hAMSCs具有成纤维细胞生长的特点，体积小，呈梭形，核浆比大，体外增殖迅速，生长状态稳定，而且随着换液次数和传代次数的不断增加，细胞纯度不断增加，均质性不断提高，细胞呈均匀有序的成纤维细胞样，随着传代次数的增加，细胞的增殖速度未见明显下降，细胞的均一性经过传代培养明显提高。酶消化法联合联合EGF，将贴壁培养和消化时间控制相结合，具有操作简单快速，实用稳定等优点，不失为一种较为有效的分离纯化方法。本发明并不局限于所述的实施例，本领域的技术人员在不脱离本发明的精神即公开范围内，仍可作一些修正或改变，故本发明的权利保护范围以权利要求书限定的范围为准。
权利要求
1.一种酶消化法联合EGF培养人羊膜间充质干细胞的方法，采用胰蛋白酶和胶原酶分步多次消化来收集羊膜细胞，通过加入EGF，将贴壁培养和消化时间控制相结合，获得纯度和活性较高人羊膜间充质干细胞，所述方法包括如下步骤hAMSCs的分离，hAMSCs的原代培养，hAMSCs的传代培养与扩增，hAMSCs的冻存和复苏，以及hAMSCs细胞免疫表型的检测；其中， 所述hAMSCs的分离步骤包括无菌条件下取产后弃置的新鲜胎盘，采用机械法将羊膜从胎盘组织上剥离，用D-Hanks液冲洗数次以清除残留血迹，将漂洗后的羊膜用眼科剪剪成约Imm3碎块，加入胰蛋白酶37°C消化10分钟；加入含小牛血清的DMEM终止消化，并轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤；过滤后的羊膜组织中加入II型胶原酶消化液，37°C消化30分钟；加入含小牛血清的DMEM终止消化，轻柔吹打混匀后200目细胞筛过滤，收集细胞；1000转/分钟离心5分钟；台盼兰染色计数活细胞，调整细胞密度为I X 106/ml，接种至培养瓶，加入含bFGF和FBS的DMEM培养基；置37°C、饱和湿度、体积分数5%的CO2培养箱内培养，倒置相差显微镜下每日观察原代和传代细胞的生长情况和形态特征，隔天换液I次，并摄片记录；待细胞汇合度达80%后，用O. 25%胰蛋白酶-O. 02% EDTA溶液于37°C消化2_3分钟，加入培养基终止胰蛋白酶作用，1000转/分钟离心5分钟，弃上清，细胞沉淀用培养基重新悬浮后，以I X IOVml的细胞密度传代；传代过程中，隔日换液I次，待细胞长满70 %瓶底重复以上步骤； 所述hAMSCs的原代培养步骤包括将羊膜细胞悬液移入离心管，配平，2000rpm离心15分钟，弃上清，收集细胞；将收集的细胞用PBS吹打成均匀悬液，1500转/分钟进行15分钟洗涤，收集细胞；接种细胞前吸取FBS加入细胞培养瓶，置37°C，5% CO2，饱和湿度培养箱孵育30分钟，对培养瓶进行包被；弃包被液，用含20% FBS,4ng/ml表皮生长因子(EGF)的DMEM/F12完全培养液重悬消化分离所得细胞，吹打均匀，计数细胞；调整细胞浓度为1.O X IO6细胞/ml，接种于包被后的细胞培养瓶中，置于37°C，5 % CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，相差显微镜动态观察；培养4-5天后全量换液，弃去未贴壁细胞，以后每3-4天半量换液一次。观察细胞贴壁生长至80-90%汇合时，以O. 25%胰蛋白酶-O. 01% EDTA消化，得到原代细胞； 所述hAMSCs的传代培养与扩增步骤包括观察原代hAMSCs细胞贴壁生长至80-90%汇合时，吸弃培养瓶内原有培养液，吸取PBS缓冲液轻轻加入培养瓶内洗涤，弃去洗液；力口入O. 25%胰蛋白酶-O. 01 % EDTA消化液浸漫覆盖瓶底，倒置显微镜下观察，见细胞间隙增大，胞质回缩，摇动吹打后见细胞呈圆形漂起时加入FBS中止胰酶消化；加入PBS反复吹打冲洗，在室温下900转/分钟离心10分钟；弃去上清液，加入DMEM/F12重悬细胞，按1:2-1: 3比例传代培养；培养体系为20% FBS，4ng/ml EGF的DMEM/F12完全培养液15ml/瓶；置37°C，5% CO2，饱和湿度的细胞培养箱中培养，计为第I代hAMSCs，待细胞生长至80-90%汇合时，重复上述操作进行多代细胞培养扩增； 所述hAMSCs细胞免疫表型的检测步骤包括取培养第2或第3代细胞，首先用胰蛋白酶消化后，然后用含小牛血清白蛋白的PBS调整细胞浓度至IXlOVml ;分别加入鼠抗人单克隆抗体，置4°C孵育半小时，PBS洗I次，进行流式细胞仪检测分析。
2.如权利要求1所述的酶消化法联合EGF培养人羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的hAMSCs的冻存和复苏步骤中，所述的hAMSCs的冻存操作如下取出所需试剂，配制冻存液，每个冻存管中加入人AB血清350ul和DMS0150ul，置于冰上预冷；取出需要冻存的细胞，吸弃培养瓶中原有的培养基，用PBS缓冲液轻轻清洗后，吸弃洗液；每瓶中加入胰酶-EDTA工作液，浸漫覆盖瓶底，放入37°C孵箱中2-3分钟；在倒置显微镜下观察见细胞呈圆形飘起时，加入胎牛血清中止胰蛋白酶消化；每瓶中加入完全培养液，反复吹打，用微量加样枪吸出少许用做细胞计数；将细胞悬液移入离心管中，1000转/分钟离心5分钟，离心结束，吸弃上清；向离心管中加入人AB血清，充分混匀，待用；将上述脐带源间充质干细胞悬液加入到冻存管中，封盖，震荡，充分混匀，放置在4°C冰箱30分钟后迅速移入到_80°C，24小时后，移入液氮中，进行长期保存。
3.如权利要求1所述的酶消化法联合EGF培养人羊膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的hAMSCs的冻存和复苏步骤中，所述hAMSCs的复苏的操作包括取出所需试剂，平衡至室温，准备370C水浴备用；从液氮中迅速取出需要复苏的冻存管，立即于37°C水浴中迅速融化；用酒精棉球擦拭冻存管盖周围，旋开管盖；在超净台内将冻存管内的细胞移入到无菌离心管内，缓慢逐滴加入DMEM/F12培养液，轻轻混匀；1000转/分钟离心5分钟，弃上清；加入DMEM/F12完全培养液重悬细胞后接种，每个培养瓶中补加新的完全培养液；置5% C02，饱和湿度，37°C培养箱重新培养。
全文摘要
本发明提供一种酶消化法联合表皮生长因子(EGF)培养人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)的方法，其包括如下步骤hAMSCs的分离，hAMSCs的原代培养，hAMSCs的传代培养与扩增，hAMSCs的冻存和复苏，以及hAMSCs细胞免疫表型的检测。本发明采用胰蛋白酶和胶原酶分步多次消化来收集羊膜细胞，通过加入4ng/mlEGF，将贴壁培养和消化时间控制相结合，获得纯度和活性较高人羊膜间充质干细胞(hAMSCs)。本发明的酶消化法联合联合EGF具有操作简单，快速实用等优点，是一种较为有效的分离纯化hAMSCs的方法。
文档编号C12N5/0775GK103013913SQ20121050548
公开日2013年4月3日 申请日期2012年11月30日 优先权日2012年11月30日
发明者陆华 申请人:陆华