一种产菊粉内切酶的枯草芽孢杆菌JG‑1及其制备方法和应用与流程

本发明涉及基因工程和发酵工程
技术领域：
，具体涉及一种产菊粉内切酶的枯草芽孢杆菌jg-1及其制备方法和应用。
背景技术：
：低聚果糖(fructooligosaccharide)又称果寡糖或蔗果三糖族低聚糖，是一类双歧杆菌增殖因子，具有低热、稳定、安全无毒等特性。它是一种非消化性低聚糖，不能被动物本身分泌的消化酶水解，到达肠道后可选择性地被双歧杆菌、乳酸杆菌利用，产生对动物生长有益的有机酸和必需的维生素等；降低肠内ph值，抑制有害菌(如大肠杆菌、梭菌及腐败菌等)的增殖，减少肠道内腐败性代谢产物的生成，从而提高动物机体免疫力，改善健康状况，达到提高营养物质利用率，增强动物生产性能的目的。它是公认的益生元代表，因而受到广泛关注。糖苷水解酶第32家族包括内切菊粉酶、外切菊粉酶、蔗糖酶及内切β-2,6-果聚糖酶等，主要催化水解含β-2,6果糖苷键、β-2,1果糖苷键或β-d果糖苷键的化合物，在理论研究方面具有一定的意义，在饲料、食品、生物燃料、洗涤、制糖和医药等领域具有潜在的应用前景。因此，以菊粉为底物，在菊粉内切酶的作用下，用微生物法生产果寡糖也备受关注。目前，寡果糖制造用酶生产菌株使用黑曲霉，将该菌在28℃含有5～10％蔗糖的培养基中振荡培养4天，生产具有果糖转移活性的菌体，这些菌体可以直接使用，也可将酶固定化后使用55-60％蔗糖溶液中每克基质添加2-5单位的果糖转移酶，60℃反应24h，反应后的糖组成为：葡萄糖(36-35％)，蔗糖(10-12％)，蔗果三糖(21-28％)，蔗果四糖(21-24％)，蔗果五糖(3-6％)。寡果糖含量在55-60％之间，(所得产品商品名称为明治寡糖g)。另外，还可以从所得转移糖混合物中除去单糖和二糖，得到高纯度的寡果糖。目前国际上关于菊糖酶的分子生物学研究主要集中于菊糖外切酶，对菊糖外切酶的结构以及催化机制了解较深入。而对于菊糖内切酶的研究相对较少，主要局限于酶基因的克隆和异源表达。大部分的微生物中都含有菊粉外切酶的基因，但是只有少数微生物体内含有内切酶的基因，迄今已发现某些微生物能够产菊糖内切酶，如aspergillusficuum，penicilliumsp.，kluyveromy-cesmarxianus，bacillussmithii，pseudomonassp.，xanthomonasoryzae以及arthrobactersp等菌种，不同来源的菊粉内切酶，其酶学性质也不相同。技术实现要素：发明目的：根据现有技术的不足，本发明所要解决的技术问题是提供了能够利用菊粉生产低聚果糖的枯草芽孢杆菌(bacillsusubtilis)重组菌株。本发明还要解决的技术问题是提供了上述重组菌株的制备方法。本发明还要解决的技术问题是提供了上述重组菌株的应用。本发明还要解决的技术问题是提供了一种菊粉内切酶的制备方法。技术方案：为了解决上述问题，本发明的技术方案是提供了一种产菊粉内切酶的枯草芽孢杆菌jg-1，该枯草芽孢杆菌jg-1以pma05大肠-枯草穿梭质粒为骨架构建质粒pma05-inu，然后通过化学转化法转化进bacillsusubtilis168中，通过质粒pma05-inu在枯草芽孢杆菌中的卡那霉素抗性筛选标记筛选出的阳性转化子。该表达菊粉内切酶的重组菌株bacillsusubtilisjg-1的菌学特征如下：枯草芽胞杆菌，是芽胞杆菌属的一种，单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色，在液体培养基中生长时，常形成皱醭，广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖，故命名为枯草芽孢杆菌。本发明的菊粉内切酶基因inu来源于霉味假单胞菌(pseudomonasmucidolens)它的序列在ncbi中可以查到，genebank登记号为af141320.1。序列如下(对应于序列表seqidno：3)：atgcacaacacagaagacacaggtcttatcgcatactggtctttcgacgaagaaagtggtaaaacagctgttgacgtaatcggaaagatgaacgacagcatcgactacgttttcaaccacgcaagattcaaggcaagtagcgatccacaaagaagaaagggaatcagcggtaacgcattgttgttcgacggatacagtacgtggatcaagagaagcgcagatcaaatcggaaagccagaaaacgctttgacactggaagcatgggtagcaccaagaagttacgaatggggagatgaacaaaggcttagtgcaatcgtaaaccaacacgacagggaaaagaaggagggattcatcctgggtatgtacagacacggaacttggtctttgcaacttggacttgaccatgagtggatcgaagtttggagtgaggatcatccacttcctaagaacgagtggtcttacgtggtagctacttacgacaagaagacaagcatgctgaagcttgcatgcccatctatgttgaagctttacctgaacggagtagaggtggcatcaaagcaaacaacggcacattcaacgatcacgccatcaagacaagaccttctgatcggtaaaaacaaccaggcagtagtactcgcaggagtattctcacttaacatgttcaacggcctgatcgacgagatcaagatttacaaccgagccctgtcatcagacgagattgcttcaagcttccacagatacctggtaccttacggaggaaaaataccgtcaattccgtatgaccacctgaaactcgaccgttcactgctggctgatgataggcatcgaccacaatatcatgtatcaccacctgctcattggatgaacgaaccacatgctccaatttatttcaacggccagtatcacctcttttatcagcacaatccgcagggaccttattggcaccaaattcattgggggcattgggtgtctgacgatttggtgcattggcgtgatcttcctgttgctttgtctcctgaaaaaaatgccgttgaccctgacggagattggtcaggatctgctacttatgacgaacatggactgcctgttctgttttttaccgctggagatgattcagctaaacctaatcagcgagtcggtcttgcccgttcaacatttgcccaagatggagataatgacctggttcattgggttaaacatccgacgcctgttgtggtgcaacaacagggagttggaaaatttggcgactttcgtgatccttttgtctggaaagatggcgatacctggtatatgctcgtcggttctggaacggatggtgaaggtggtacagcgttagcctatacatctaaaaatctgacggagtgggagtatcgtggtcctttttatatttcggatcataaaaattatccgtatctggggaaagtctgggagctgccggtcctgctcccgctcggtaaagataaaaaaggccatgataaacatgtctttctcatttccccggtcggggccggtgcggatgttgaagttttttattggattggcacgtttgataaagagcagtttcgctttattccggatcagaatgagccgcagctcattgatgtcggcgattcgcattttacggggccgtctggcatggttgatccgaatactgggcgtaaaatactctttacaatagcgcagggggaacggactccggcgttagattattctgcgggctgggcgcataatgggggcttaccggtgagcctttcgttacgggaagatgggcgcttgggcgtggaaccgattgaagaattgaaatcgcttcgcggcaaaaaacttgtctcctttacaaaaaaatcggcggaagaagcgaatgatttacttacaaatgtgaaaggggatatgttagaaattatacttgaacttgaaccgggcacagccaaacaatttggcataaaagtccggcgctcccctggcggcgaagaggagactttattatattataataccgaagcgtccacattgaatgtgaatcggatgaaaaccaccttggataattttgaacggagcaaaggcattcagggcggcaaattggagttaaatggcgaaaatttaaaattacatatttatttagatcgctccatgattgaagcctatgcgaatgggttaaaaagcttaaccacccgcgcctatccgagccggccggattccttaggcttacagatttggggggatggcagcgtcagcgtcaaatccatggaagtgtgggaaatgaatagcgcgtttggcccgacggtgtcggcgtatattccggaacaacatgccgatggcgtgcagacaaaataa本
发明内容还包括上述的产菊粉内切酶的枯草芽孢杆菌jg-1的制备方法，包括以下步骤：1)菊粉内切酶编码基因的获得：选定霉味假单胞菌中的菊粉内切酶的cds序列，设计引物，调取菊粉内切酶的酶基因inu；所述引物序列如seqidno:1和seqidno:2所示；2)表达载体pma05-inu的构建：以大肠-枯草穿梭质粒pma05为质粒骨架，利用限制性内切酶ndei和bamhi双切质粒pma05，随后采用一步克隆的方法将目的片段和双酶切质粒连接，形成质粒pma05-inu；3)重组菌株的构建：将步骤2)构建验证正确的质粒pma05-inu通过化学转化法，转化进枯草芽孢杆菌中，通过卡那霉素抗性筛选标记筛选出正确的转化子即为重组菌株；4)发酵产酶验证：采用摇瓶培养重组菌株，测定菊粉内切酶的活力，获得高效表达重组菌株的枯草芽孢杆菌jg-1。其中，上述卡那霉素抗生素的筛选浓度为25μg/ml。其中，上述步骤4)的培养温度为32℃，200rpm，发酵时间为24h。其中，上述培养在250ml摇瓶中进行培养，32℃培养24h产酶量达到最大。本
发明内容还包括上述的产菊粉内切酶的枯草芽孢杆菌jg-1在制备菊粉内切酶和低聚果糖中的应用。一种菊粉内切酶和低聚果糖的制备方法，包括以下步骤：4℃条件下，将所述的枯草芽孢杆菌jg-1发酵培养得到发酵液，9000rpm离心菌体细胞，倒掉上清，再用ph为7.4的磷酸缓冲液洗涤菌体2-3次，最后用相同体积的缓冲悬浮细胞，采用超声破碎仪破碎细胞，4℃条件下，离心破碎液10min，获得破碎后的上清液即为菊粉内切酶。菊粉内切酶的酶活测定：用dns测还原糖法测菊粉内切酶的酶活，由于发生显色反应，通过测定吸光度来表征菊粉内切酶的酶活。本发明所构建的重组菌bacillsusubtilisjg-1的应用是基于食品安全微生物产菊粉内切酶并催化产低聚果糖(fos)。有益效果：本发明相对于现有技术，具有以下优点：1：枯草芽孢杆菌是公认的食品安全微生物，不会存在大肠杆菌产低聚果糖的安全隐患；2：可以获得dp3，dp4，dp5聚合度的低聚果糖；3：枯草芽孢杆菌在产菊粉内切酶方面比其他工程菌有更高的优势。4、菊粉内切酶的酶活最高酶活为20.16u/ml。附图说明图1重组质粒pma05-inu的构建过程；图2重组质粒pma05-inu酶切验证图；图a中泳道1为分子量为7500的dnamaker，泳道2为单酶切图；泳道3为双酶切；图b中泳道1为maker，泳道2为单酶切验证，泳道3为双酶切验证；图3重组菌bacillsusubtilisjg-1的发酵产酶曲线；利用发酵产酶培养基，把重组菌bacillsusubtilisjg-1在32℃发酵，每隔4h取样200μl，12000rpm离心1min，用200μl的0.02mm，ph为7.4的pbs缓冲悬浮细胞，并进行超声破碎后，离心后，200μl酶液和800μl2％的菊粉30min灭活，取25μl加50μldns，在加入550μlro水，用酶标仪测540nm处吸光度，进而计算比酶活u/ml，1u定义为反应生成1μmol/min还原糖所需要的酶量。横坐标为时间(h)，发酵时间，每隔4h取样，右侧纵坐标是比酶活(u/ml)，比酶活越高，说明其200μl全细胞破碎液中产酶越高；左侧纵坐标为菌体浓度，单位是cell/ml。图4三糖、四糖、五糖的标品液相图；图4中三个峰依次是聚合度为dp5，dp4，dp3；图5枯草芽孢杆菌表达的菊粉内切酶催化菊芋菊粉生成果寡糖的转化液的液相图；利用高效液相色谱法检测低聚果糖的聚合度，将菊粉内切酶催化菊粉后的转化液，取24h转化液，稀释，走液相色谱柱，钙柱，横坐标代表出峰时间t(min)，纵坐标代表峰高(μriu)，峰面积代表不同聚合度低聚果糖的含量；根据液相性质，聚合度高的先出峰，图中3，4，5峰分别代表聚合度为5，4，3的低聚果糖；图6酶活标准曲线；横坐标代表果糖浓度，单位为g/l，纵坐标代表吸光度，单位为l/(g.cm)。具体实施方式下面结合附图对本发明作更进一步的说明。本发明实施例所使用的试剂菊粉天根生化科技(北京)有限公司一步克隆酶南京爱必梦生物有限公司ndei,bamhitakara大连宝生物有限公司makerdl15000takara大连宝生物有限公司k2hpo4上海凌峰化学试剂有限公司kh2po4上海凌峰化学试剂有限公司dns上海润成生物有限公司实施例1构建重组质粒载体pma05-inu通过基因挖掘技术，确定目的基因为来自于霉味假单胞菌中的菊粉内切酶，设计一步克隆引物，上游引物：aaaaggagcgatttacatatgatgcacaacacagaagacacagg下游引物：gagctcgactctagaggatccttattttgtctgcacgccatcg；将目的基因pcr调取，用限制性内切酶ndei和bamhi双切质粒载体pma05，回收纯化后计算浓度，确定连接体系，根据同源重组的原理，采用一步克隆的方法30℃冰上连接，将连接好的反应液用热激转化法转化进dh5α中，涂布到含有100μg/ml氨苄抗生素的固体lb平板上，37℃过夜培养12h，筛选转化子(来源于南京工业大学徐虹教授课题组惠赠的质粒pma05是一个大肠-枯草穿梭质粒，在dh5α中显示氨苄的抗性)，挑4-6个菌转接到含有100μg/ml氨苄抗生素的小黑瓶中，37℃摇床200rpm培养8h，保存菌种后剩余的细胞液离心收集细胞，用提质粒试剂盒抽提质粒，将抽提后的质粒用ndei和bamhi双酶切(10μl＝5μl质粒+1μl10*kbuffer+0.5μlndei+0.5μlbamhi+3μlddh2o)和pcr验证，双酶切1h后，通过核酸电泳验证双酶切正确，电泳图如附图2a，pcr验证有目的条带2331bp，构建好的质粒命名为pma05-inu。单酶切的体系为(10μl＝5μl质粒+1μl10*kbuffer+1μlbamhi+3μlddh2o)实施例2：重组载体转化枯草芽孢杆菌(bacillsusubtilis)由于枯草表达质粒转化方法用的都是化学转化法，枯草芽孢杆菌的转化效率高一些，首先制作枯草芽孢杆菌感受态，最后分装成200μl/管，将验证正确的质粒取5μl直接加入到200μl枯草芽孢杆菌感受态中，37℃，200rpm摇菌90min，最后涂平板，卡那霉素抗生素的浓度为20μg/ml，37℃过夜培养，挑转化子，并接种到含有卡纳抗生素的液体培养基中，37℃，200rpm摇菌12h，后续按照实施例1中步骤进行酶切验证，电泳图如附图2b：泳道1为maker，泳道2为单酶切验证，泳道3为双酶切验证。实施例3：jg-1发酵产酶优化将筛选得到的阳性克隆子bacillsusubtilisjg-1，接种到500ml产酶发酵培养基中发酵产菊粉内切酶，初始最高比酶活约为1.2u/ml。对b.subtilisjg-1产菊粉内切酶条件进行优化，将jg-1接种到500ml摇瓶中，在32℃的条件下发酵，每隔4h取样，取200μl发酵液和800μl2％的菊粉反应30min，测菊粉内切酶酶活力，随着发酵的进行，重组菌jg-1的菌体浓度(od600nm)达到最大值，为2.5，在4℃条件下，离心，9000rpm，离心10min，获得菌体细胞，用200μl0.02mm的磷酸盐缓冲液pbs(ph为7.4)洗涤菌体两次，最后用相同体积(200μl)的pbs重悬菌体，采用超声破碎仪破碎细胞，4℃，离心10min，获得含有菊粉内切酶的上清液，随着发酵的进行，当发酵至24h时，优化后重组菌bacillsusubtilisjg-1的比酶活最高为20.16u/ml。实验结果参见图3。最终确定bacillsusubtilisjg-1的产酶发酵条件为：1％的接种量，发酵温度为32℃，200rpm，发酵时间为24h。实施例4：菊粉内切酶的酶活的检测将200μl菊粉内切酶的上清液和800μl2％的菊粉反应30min后的反应液，放在100℃沸水中煮沸10min灭活，12000rpm离心1min，取25μl反应上清液与50μldns沸水中煮沸10min，发生显色反应，再加550μlro水(优普纯水仪)稀释，用酶标仪，测540nm下的吸光值，根据标曲计算酶活，酶活定义为1u等于1min生成1μmol还原糖所需的酶量。优化后菊粉内切酶最高比酶活为20.16u/ml。标准曲线如图6。实施例5：菊粉内切酶催化菊粉水解产低聚果糖取细胞破碎液上清2ml加入到8ml100g/l的用pbs配制的菊粉溶液中，55℃，200rpm，水浴摇床中反应，每隔4h取样200μl，稀释10倍后，样品过0.22μm滤膜处理，利用ca柱，走高效液相色谱，条件为：两根ca柱串联，柱温为80℃，流动相为纯水，流速为0.4ml/min，检测器为示差检测器ri。取催化20h的样品处理后走液相，确定产物主要为dp3，dp4，dp5聚合度的低聚果糖。结果如图5。以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出：对于本
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的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。sequencelisting<110>盐城工学院<120>一种产菊粉内切酶的枯草芽孢杆菌ng-1及其制备方法和应用<130>sg20170524001<160>3<170>patentinversion3.3<210>1<211>44<212>dna<213>上游引物<400>1aaaaggagcgatttacatatgatgcacaacacagaagacacagg44<210>2<211>43<212>dna<213>下游引物<400>2gagctcgactctagaggatccttattttgtctgcacgccatcg43<210>3<211>2331<212>dna<213>于霉味假单胞菌<400>3atgcacaacacagaagacacaggtcttatcgcatactggtctttcgacgaagaaagtggt60aaaacagctgttgacgtaatcggaaagatgaacgacagcatcgactacgttttcaaccac120gcaagattcaaggcaagtagcgatccacaaagaagaaagggaatcagcggtaacgcattg180ttgttcgacggatacagtacgtggatcaagagaagcgcagatcaaatcggaaagccagaa240aacgctttgacactggaagcatgggtagcaccaagaagttacgaatggggagatgaacaa300aggcttagtgcaatcgtaaaccaacacgacagggaaaagaaggagggattcatcctgggt360atgtacagacacggaacttggtctttgcaacttggacttgaccatgagtggatcgaagtt420tggagtgaggatcatccacttcctaagaacgagtggtcttacgtggtagctacttacgac480aagaagacaagcatgctgaagcttgcatgcccatctatgttgaagctttacctgaacgga540gtagaggtggcatcaaagcaaacaacggcacattcaacgatcacgccatcaagacaagac600cttctgatcggtaaaaacaaccaggcagtagtactcgcaggagtattctcacttaacatg660ttcaacggcctgatcgacgagatcaagatttacaaccgagccctgtcatcagacgagatt720gcttcaagcttccacagatacctggtaccttacggaggaaaaataccgtcaattccgtat780gaccacctgaaactcgaccgttcactgctggctgatgataggcatcgaccacaatatcat840gtatcaccacctgctcattggatgaacgaaccacatgctccaatttatttcaacggccag900tatcacctcttttatcagcacaatccgcagggaccttattggcaccaaattcattggggg960cattgggtgtctgacgatttggtgcattggcgtgatcttcctgttgctttgtctcctgaa1020aaaaatgccgttgaccctgacggagattggtcaggatctgctacttatgacgaacatgga1080ctgcctgttctgttttttaccgctggagatgattcagctaaacctaatcagcgagtcggt1140cttgcccgttcaacatttgcccaagatggagataatgacctggttcattgggttaaacat1200ccgacgcctgttgtggtgcaacaacagggagttggaaaatttggcgactttcgtgatcct1260tttgtctggaaagatggcgatacctggtatatgctcgtcggttctggaacggatggtgaa1320ggtggtacagcgttagcctatacatctaaaaatctgacggagtgggagtatcgtggtcct1380ttttatatttcggatcataaaaattatccgtatctggggaaagtctgggagctgccggtc1440ctgctcccgctcggtaaagataaaaaaggccatgataaacatgtctttctcatttccccg1500gtcggggccggtgcggatgttgaagttttttattggattggcacgtttgataaagagcag1560tttcgctttattccggatcagaatgagccgcagctcattgatgtcggcgattcgcatttt1620acggggccgtctggcatggttgatccgaatactgggcgtaaaatactctttacaatagcg1680cagggggaacggactccggcgttagattattctgcgggctgggcgcataatgggggctta1740ccggtgagcctttcgttacgggaagatgggcgcttgggcgtggaaccgattgaagaattg1800aaatcgcttcgcggcaaaaaacttgtctcctttacaaaaaaatcggcggaagaagcgaat1860gatttacttacaaatgtgaaaggggatatgttagaaattatacttgaacttgaaccgggc1920acagccaaacaatttggcataaaagtccggcgctcccctggcggcgaagaggagacttta1980ttatattataataccgaagcgtccacattgaatgtgaatcggatgaaaaccaccttggat2040aattttgaacggagcaaaggcattcagggcggcaaattggagttaaatggcgaaaattta2100aaattacatatttatttagatcgctccatgattgaagcctatgcgaatgggttaaaaagc2160ttaaccacccgcgcctatccgagccggccggattccttaggcttacagatttggggggat2220ggcagcgtcagcgtcaaatccatggaagtgtgggaaatgaatagcgcgtttggcccgacg2280gtgtcggcgtatattccggaacaacatgccgatggcgtgcagacaaaataa2331当前第1页12