枯草芽孢杆菌CF‑3及其培养方法与流程

本发明涉及一株新筛选的枯草芽孢杆菌CF-3及其培养方法。

背景技术：

果蔬采后因病原菌引起的果蔬腐烂造成了严重的经济损失。长期以来为了控制采后果蔬的病害发生，主要采用化学杀菌剂的方法，但是化学杀菌剂的使用往往容易引起病原菌抗药性的产生，影响食品的安全性，造成环境污染等问题，生物保鲜方法被认为是最具有潜力的方法之一。所以，高效低毒低残留且与环境相容性好的果蔬采后保鲜方法成为了现在研究的热点。

枯草芽孢杆菌是一种对许多植物病原生物具有拮抗作用的非病原微生物，其代谢系统发达，能够产生对高温、干旱和紫外线照射等不良环境具有良好抵御能力的内生芽孢，而且具有广谱抗菌活性和极强的抗逆能力，安全，对人畜无毒无害，不污染环境，能产生多种拮抗物质和一些高分子量的拮抗蛋白质，包括磷脂类、氨基酸类、核酸类、肽类、脂肽类与多烯类等多种化合物，具有潜在的医学应用与病害防治的价值，能够抑制病毒、细菌、真菌和菌原体等，并且在其生长代谢过程中还会产生许多挥发性物质(VOCs)，包括酯类、酮类、酸类、醛类与醇类等，在抑制病原菌生长方面也有不同程度上的功效。因此在生物防治杀菌剂中占主导地位，具有广阔的应用前景。

病原真菌侵染一直是影响果蔬采后品质的主要原因，目前国内和国际上有许多关于利用生防菌防治植物病害的文献报道，对生防菌应用于果蔬采后真菌病害的防治作用研究较少，从整体上来看，抑菌谱窄、效力低是影响生防菌商业化应用的主要问题，因而筛选抑菌谱广、效力高的生防菌应用于果蔬采后生物防治成为一个新的研究热点。

技术实现要素：

本发明的目的之一在于提供了一株新的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)菌株，已于2016年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心,保藏名为Bacillus subtilis CF-3，保藏编号CCTCC No:M 2016125。

本发明的目的之二在于提供了该菌株的分离及培养方法。该枯草芽孢杆菌菌株是从购买的豆腐乳中分离、筛选而得，将每块豆腐乳(10克)放入装有100mL无菌水的锥形烧瓶中震荡10分钟，连续稀释至1～1×10^-6倍，制备稀释液；将1mL不同浓度的悬液与冷却至55～60℃灭菌的NA固体培养基(牛肉浸膏5.0g，酵母浸膏5.0g，鱼粉蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2)混合，待其凝固后在30℃恒温培养箱中培养24小时；待平板上长出菌落后，挑取单个菌落分别接种于NA固体培养基进行平板培养；随后采用划线法对病原真菌进行菌丝抑制实验，选取抑制效果良好的生防菌菌株，于20mL灭菌的NA液体培养基中(牛肉浸膏5.0g，酵母浸膏5.0g，鱼粉蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2)，37℃，150rpm，摇瓶培养24h后，采用平板划线分离纯化，再次进行病原真菌的抑制实验，二次筛选后选取对病原真菌抑制效果最好的菌株，经过形态学以及生理生化与DNA鉴定后，命名为枯草芽孢杆菌CF-3。

在NA固体培养基(牛肉浸膏5.0g，酵母浸膏5.0g，鱼粉蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2)及NA液体培养基中的培养温度为37℃，培养时间为24～48小时，在NA液体培养基摇瓶培养时转速为150rpm。在以上条件下，该菌株鉴定特征如下：为杆状细菌，革兰氏染色阳性，具有周生鞭毛，无荚膜。NA固体培养基：菌落颜色为淡黄色，半透明至不透明，边缘比中心厚。NA液体培养基：接种培养24小时，培养液为不透明的棕黄色液体。该菌生防活性具有紫外光稳定性、酸碱稳定性、热稳定性等优点，以对荔枝炭疽菌的抑制率为指标，CF-3发酵培养基中碳源、复合碳源、氮源、复合氮源、微量元素的最优的种类和浓度为甘露醇34.64g/L，玉米浆粉20.87g/L，果糖10g/L，硝酸钾浓度为1g/L，硫酸亚铁浓度为0.13g/L，氯化钙浓度为0.1g/L，pH为7.2。该菌的16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

一株枯草芽孢杆菌CF-3，该菌株的保藏编号CCTCC No:M 2016125。

一种制备上述的一株枯草芽孢杆菌CF-3的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：将每10克豆腐乳放入装有100mL无菌水的锥形烧瓶中震荡10分钟，连续稀释至1～1×10^-6倍，制备稀释液；将1mL不同浓度的稀释液与冷却至55～60℃灭菌的NA固体培养基混合，待其凝固后在30℃恒温培养箱中培养24小时；待平板上长出菌落后，挑取单个菌落分别接种于NA固体培养基进行平板培养；随后采用划线法对病原真菌进行菌丝抑制实验，选取抑制效果良好的生防菌菌株，于20mL灭菌的NA液体培养基中，37℃，150rpm，摇瓶培养24h后，采用平板划线分离纯化，再次进行病原真菌的抑制实验，二次筛选后选取菌株，经过形态学以及生理生化与DNA鉴定后，命名为枯草芽孢杆菌CF-3。

上述的NA固体培养基为：牛肉浸膏5.0g，酵母浸膏5.0g，鱼粉蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，琼脂18.0g，蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2。

上述的NA液体培养基为：牛肉浸膏5.0g，酵母浸膏5.0g，鱼粉蛋白胨10.0g，氯化钠5.0g，蒸馏水1000mL，pH值7.0～7.2。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：该菌株对多达8种导致采后水果腐烂的常见病原真菌生长具有明显的抑制作用，抑菌谱广、效力高，并且其发酵条件简单，制备容易，可应用于果蔬采后保鲜。

附图说明

附图1为实施例2中枯草芽孢杆菌CF-3的显微镜照片。

附图2为实施例3中枯草芽孢杆菌CF-3的系统发育树。

附图3为实施例4中枯草芽孢杆菌CF-3的发酵培养液对于番茄灰葡萄孢霉菌(Botrytis Cinerea，A组。A1为空白对照组，A2为处理组，后面以此类推)、草莓灰葡萄孢霉菌(Botrytis Cinerea，B组)与3株荔枝炭疽菌(Colletotrictum gloeos，C、D、E组)的抑制作用。

附图4为实施例4中枯草芽孢杆菌CF-3的发酵培养液对于苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali Miyabe et Yamada，F组。F1为空白对照组，F2为处理组，后面以此类推)、扩展青霉菌(Penicillium expansum，G组)、桃褐腐菌(Monilinia fructicola，H组)、仁果茎点霉菌(Phoma pomirum Thum，I组)与链格孢霉(Alternaria alternata(Fr.)Keissler，J组)的抑制作用。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例进行进一步解释本发明，但不对本发明构成任何限定。以下实施例中除了特殊说明外，均为本领域常规试剂与方法步骤。

实施例1：枯草芽孢杆菌CF-3的分离纯化

该枯草芽孢杆菌菌株是采用稀释平板法从购买的豆腐乳中分离、筛选而得。将每块豆腐乳(10克)放入装有100毫升无菌水的锥形烧瓶中震荡10分钟，之后连续稀释至10^-6倍，制备稀释液；将1毫升不同浓度的悬液与冷却至55～60℃灭菌的NA固体培养基中混合，倒入培养皿中，待其凝固后在30℃恒温培养箱中培养24小时；待平板上长出菌落后，挑取单个菌落分别接种于NA固体培养基进行平板培养；随后采用划线法对病原真菌进行菌丝抑制实验，选取抑制效果良好的生防菌菌株，于20mL灭菌的NA液体培养基中，37℃，150rpm，摇瓶培养24h后，采用平板划线分离纯化，再次进行病原真菌的抑制实验，二次筛选后选取对病原真菌抑制效果最好的菌株，经过形态学以及生理生化与DNA鉴定后，命名为枯草芽孢杆菌CF-3。

该菌株CF-3的保存方法：短期保存采用NA斜面培养基4℃保存。长期保存采用甘油保存法，在甘油管中加入1mL 50％的甘油，再加入1mL菌液，使甘油最终浓度为25％，-80℃保存。

其制备方法为：

1.培养方法：将菌种接种于NA固体培养基的培养皿中，置于37℃的培养箱内培养24～48小时。

2.发酵方法：NA种子培养基中最佳培养时间24h，再按照接种量1：20接种于发酵培养基，发酵液pH为7.0～7.2，温度控制在37℃，转速为150rpm，发酵时间为24小时。NA培养基的灭菌方式为：121℃高压蒸汽灭菌20分钟。

实施例2：枯草芽孢杆菌CF-3的生物学性状以及生理生化特性的鉴定

1.形态特征:

枯草芽孢杆菌CF-3在电镜下形态见于图1，该枯草芽孢杆菌在平板上37℃下培养24小时的菌落呈淡黄色，圆形，表面光滑半透明至不透明，边缘整齐且比中心厚；革兰氏染色呈阳性，菌体杆状，具有周身鞭毛，无荚膜。显微镜照片见附图1。

2.生理生化特征：

枯草芽孢杆菌CF-3其生长最适温度为37℃，最适pH为7.0～7.2。其余如表1所示。

表1枯草芽孢杆菌CF-3的生理生化特性

注：“+”表示阳性或生长，“-”表示阴性或不生长

实施例3：枯草芽孢杆菌CF-3的16S rDNA的序列测定与分析

1.PCR模版DNA的提取：

由宝日医(TAKARA)生物技术公司生产的DNA提取试剂盒提取

2.16S rDNA基因PCR扩增：

PCR引物由宝日医(TAKARA)生物技术公司生产

上游引物Primer A：5’-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3’(SEQ ID NO:2)

下游引物Primer B：5’-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’(SEQ ID NO:3)

PCR反应体系如表2所示：

表2PCR反应体系

PCR扩增循环条件：首先94℃5分钟循环1次；接着按照94℃1分钟、50～55℃1分钟、72℃1.5分钟的顺序循环30次；最终72℃5分钟循环1次。

3.序列测定：

PCR产物纯化之后，送生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序，其序列如SEQ ID NO:1所示，该序列在DNA GeneBank中的注册号为KU531732。该序列与NCBI数据库中已知的序列进行BLAST比较分析，并从数据库中获得相关种属的16S rDNA序列，构建系统发育树，见于图2。经比较分析发现，枯草芽孢杆菌CF-3与菌株(Bacillus subtilis PPB11)亲缘关系最近。

综合16S rDNA序列分析以及生理生化等特性分析，标明本发明属于枯草芽孢杆菌，命名为枯草芽孢杆菌CF-3(Bacillus subtilis CF-3)，该菌于2016年3月15日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内(武汉大学第一附小对面)，武汉大学保藏中心,保藏名为Bacillus subtilis CF-3，保藏编号CCTCC No:M 2016125。

实施例4：枯草芽孢杆菌CF-3对病原真菌的抑菌效果

1.枯草芽孢杆菌CF-3发酵培养液的制备：

将枯草芽孢杆菌CF-3放置于NA琼脂培养基上37℃活化培养24h，然后用接种针取一环，置于种子液体培养基(NA液体培养基)中37℃恒温150rpm震荡培养24h，调整菌体浓度约为1×10⁸CFU/mL。培养结束之后，按5％的接种量接种至发酵培养基(NA液体培养基)中进行发酵培养，37℃恒温150rpm震荡培养24h。即得到枯草芽孢杆菌CF-3的发酵培养液。

2.枯草芽孢杆菌CF-3发酵培养液直接接触对真菌的抑制实验：

吸取20μL的枯草芽孢杆菌CF-3培养液用涂布棒均匀涂抹于马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上，然后将直径为7mm的病原真菌直接接种于该培养基的中心。将处理后的培养皿置于培养箱中，28℃培养7d，以无菌水为空白对照，每个样品设三个平行，通过测量病原真菌的生长直径，计算抑制率，观察抑菌效果。

抑制率计算公式：

3.实验结果：

由附图3与附图4可知，枯草芽孢杆菌CF-3的发酵培养液对于番茄灰葡萄孢霉菌(Botrytis Cinerea，A组。A1为空白对照组，A2为处理组，后面以此类推)、草莓灰葡萄孢霉菌(Botrytis Cinerea，B组)、3株荔枝炭疽菌(Colletotrictum gloeos，C、D、E组)、苹果黑腐皮壳菌(Valsa mali Miyabe et Yamada，F组)、扩展青霉菌(Penicillium Expansum，G组)、桃褐腐菌(Monilinia Fructicola，H组)、仁果茎点霉菌(Phoma pomirum Thum，I组)与链格孢霉(Alternaria alternata(Fr.)Keissler，J组)有非常好的抑制效果，几乎完全抑制了病原真菌的生长。

表3枯草芽孢杆菌CF-3对病原菌的抑制效果

A-番茄灰葡萄孢霉菌 B-草莓灰葡萄孢霉菌 C-荔枝炭疽菌09619-1-1

D-荔枝炭疽菌09626 E-荔枝炭疽菌09627 F-苹果黑腐皮壳菌

G-扩展青霉菌 H-桃褐腐菌 I-仁果茎点霉菌 J-链格孢霉

抑制率如表3所示。

<110> 上海大学

<120> 枯草芽孢杆菌CF-3及其培养方法

<160> 3

<210> 1

<211> 1278

<212> DNA

<213> 菌株

<400> 1

GATTT GATCT TGGCT ATGAC GACGC TGGCG GCGTG CCTAA TACAT GCAAG TCGAG CGGAC 60

AGATG GGAGC TTGCT CCCTG ATGTT AGCGG CGGAC GGGTG AGTAA CACGT GGGTA ACCTG 120

CCTGT AAGAC TGGGA TAACT CCGGG AAACC GGGGC TAATA CCGGA TGGTT GTTTG AACCG 180

CATGG TTCAG ACATA AAAGG TGGCT TCGGC TACCA CTTAC AGATG GACCC GCGGC GCATT 240

AGCAA GTTGG TGAGG TAACG GCTCA CCAAG GCGAC GATGC GTAGC CGACC TGAGA GGGTG 300

ATCGG CCACA CTGGG ACTGA GACAC GGCCC AGACT CCTAC GGGAG GCAGC AGTAG GGAAT 360

CAACC GCAAT GGACG AAAGT CTGAC GGAGC AACGC CGCGT GAGTG ATGAA GGTTT TCGGA 420

TCGTA AAGCT CTGTT GTTAG GGAAG AACAA GTGCC GTTCA AATAG GGCGG CACCT TGACG 480

GTACC TAACC AGAAA GCCAC GGCTA ACTAC GTGCC AGCAG CCGCG GTAAT ACGTA GGTGG 540

CAAGC GTTGT CCGGA ATTAT TGGGC GTAAA GGGCT CGCAG GCGGT TTCTT AAGTC TGATG 600

TGAAA GCCCC CGGCT CAACC GGGGA GGGTC ATTGG AAACT GGGGA ACTTG AGTGC AGAAG 660

AGGAG AGTGG AATTC CACGT GTAGC GGTGA AATGC GTAGA GATGT GGAGG AACAC CAGTG 720

GCGAA GGCGA CTCTC TGGTC TGTAA CTGAC GCTGA GGAGC GAAAG CGTGG GGAGC GAACA 780

GGATT AGATA CCCTG GTAGT CCACG CCGTA AACGA TGAGT GCTAA GTGTT AGGGG GTTTC 840

CGCCC CTTAG TGCTG CAGCT AACGC ATTAA GCACT CCGCC TGGGG AGTAC GGTCG CAAGA 900

CTGAA ACTCA AAGGA ATTGA CGGGG GCCCG CACAA GCGGT GGAGC ATGTG GTTTA ATTCG 960

AAGCA ACGCG AAGAA CCTTA CCAGG TCTTG ACATC CTCTG ACAAT CCTAG AGATA GGACG 1020

TCCCC TTCGG GGGCA GAGTG ACAGG TGGTG CATGG TTGTC GTCAG CTCGT GTCGT GAGAT 1080

GTTGG GTTAA GTCCC GCAAC GAGCG CAACC CTTGA TCTTA GTTGC CAGCA TTCAG TTGGG 1140

CACTC TAAGG AGACT GCCGG TGACA AACCG GAGGA AGGTG GGGAT GACGT CAAAT CATCA 1200

TGCCC CTTAT GACCT GGGCT ACACA CGTGC TACAA TGGAC AGAAC AAAGG GCAGC GAAAC 1260

CGCGA GGTTA AGCCA ATCCC ACAAA TCTGT TCTCA GTTCG GATCG CAGTC TGCAA CTCGA 1320

CTGCG TGAAG CTGGA ATCGC TAGTA ATCGC GGATC AGCAT GCCGC GGTGA ATACG TTCCC 1380

GGGCC TTGTA CACAC CGCCC GTCAC ACCAC GAGAG TTTGT AACAC CCGAA GTCGG TGAGG 1440

TAACC TTTAT GGAGC CAGCC GCCGA AGGTG GGACA GATGA TGGGG GAAGT CGTAA CAAGT 1500

TCC 1503

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

GAGCG GATAA CAATT TCACA CAGG 24

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工引物

<400> 1

CGCCA GGGTT TTCCC AGTCA CGAC 24