本发明涉一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）Y1活菌制剂的制备方法，适用于家禽畜牧业中饲用功能性活菌制剂的生产。
背景技术：
：本发明涉及的解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）是从传统发酵豆酱中分离纯化出来的一种具有抑制大肠杆菌的芽孢杆菌。随着养殖业集约化的发展，畜禽饲料中抗生素的用量也逐渐增加，随之而来的是抗生素的药物残留和抗药性问题越来越突出。欧盟成员国从2006年起全面停止使用所有抗生素生长促进剂。美国食品与药物管理局计划从2014年起，用3年时间禁止在牲畜饲料中使用预防性抗生素，最大限度地减少食用牲畜带给消费者抗生素耐药性问题。饲用益生菌是一种通过改善肠道菌群平衡而对动物施加有利影响的活的微生物饲料添加剂．其主要通过调节动物体内消化道pH值和肠道菌群平衡．以及增强非特异性免疫功能来预防疾病，促进动物生长。芽孢杆菌是应用最广泛的一类饲用益生菌，因为芽孢杆菌以孢子形式存在，具有耐热、耐酸、耐胆盐的特性，在饲料制粒过程中损失较少，进入肠道后可以萌发为具有新陈代谢作用的益生菌群。目前，国内申请各种活菌制剂制备方法的专利较多，如张琴等人申请的“一种复合微生物活菌制剂及其制备方法和应用”(ZL200810034746)是利用片球菌、酵母菌和芽孢杆菌分别液体扩大培养，然后按所需比例混合，经固态发酵、干燥、粉碎制得的一种复合微生物活菌制剂；再如刘慧等人申请的“一种产胆盐水解酶干酪乳杆菌KL1活菌制剂的制备方法”（ZL201310068240.0）是利用产胆盐水解酶的干酪乳杆菌KL1菌株，经过活化、扩大培养、高密度发酵、离心浓缩、加入冻干保护剂、预冻和冷冻干燥等工序制备活菌制剂。而具有抑制大肠杆菌作用的益生菌活菌制剂的制备方法尚未见国内外相关文献报道和专利报道。技术实现要素：本发明的目的在于提供一种解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）Y1活菌制剂的制备方法。本发明是通过以下技术方案实现的：本发明的技术方案是通过以下步骤来实现的：所述方法中，解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）Y1分离筛选自吉林延边传统发酵豆酱，并已于2015年11月16日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏号为：CGMCCNo.11583(菌株Y1)。在营养琼脂培养基上，解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）Y1菌落中等偏小，边缘不整齐，扁平，不规则状，颜色为白色，不透明，中间有一点皱褶，无光泽，菌体长杆状，G+产芽孢。所述方法中，将甘油试管保种的解淀粉芽孢杆菌Y1菌株以营养肉汤培养基35℃、150r/min培养12h，如此活化2代后，冷藏备用。所述方法中，在上述试验的基础上，将活化好的菌液以2%(V/V，体积分数)的接种量移种至Y1最佳发酵培养基中，于35℃、150r/min培养18h，得到扩大培养液。上述方法中，Y1最佳培养基成分：蔗糖10g，酵母浸出物：胰蛋白胨：氯化铵2:2:1=20g，硫酸镁4g；蒸馏水1000mL，调节pH为7.3。所述方法中，在上述试验结果基础上，采用三因素四水平正交试验优化发酵条件。得出优化后的发酵参数为：发酵温度35℃，发酵时间40h，pH7.3。所述方法中，在上述试验结果基础上，将2LY1最佳发酵培养基加入到5L全自动发酵罐中，利用发酵罐灭菌系统于115℃灭菌15min，利用冷水机将发酵罐中的培养基冷却至发酵温度。将Y1菌株的扩大培养液按2%(V/V，体积分数)的接种量移种至发酵罐中，利用发酵罐自动控温系统维持发酵温度为35℃，发酵液pH7.3，搅拌转速为150r/min，发酵36h，得到发酵液。4℃条件下，4000r/min离心20min，弃上清液，收集得到菌泥。所述方法中，在上述试验结果基础上，将收集的菌泥加入冻干瓶中，加入2.0%脱脂奶粉和3%甘油作为冻干保护剂，混合均匀后，得到浓缩活菌制剂。所述方法中，将浓缩活菌制剂于-30℃预冻15h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂。所述方法中，在上述试验结果基础上，利用6L真空冷冻干燥机将预冻活菌制剂于冻干温度-55℃、真空度0.16mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到冻干活菌制剂。所述方法中，所得解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）Y1活菌制剂的活菌数量高于1.0×1010CFU/g。此种活菌制剂产品价格低廉，活菌含量存活率可达85%以上，可作为饲料添加剂，可改善禽畜的肠道菌群，促进其生长。上述方法得到的解淀粉芽孢杆菌（Bacillusamyloliquefaciens）Y1活菌制剂及其制备方法与专用生产菌株属于本发明保护范围。具体实施方式下述实施例对本发明作进一步说明而不限制本发明的保护范围。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为体积分数。实施例1、单因素实验优化解淀粉芽孢杆菌Y1发酵培养基（1）将-20℃下甘油保藏的解淀粉芽孢杆菌Y1转接入5mL营养肉汤到10ml离心管中，35℃，150r/min的摇床上培养12h；（2）以2%的接菌量扩大培养解淀粉芽孢杆菌Y1到50ml的营养肉汤培养基中，35℃，150r/min的摇床上培养12h；（3）碳源单因素实验：以2%的接菌量接种Y1到含碳源0.5g（蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和可溶性淀粉）50ml发酵培养基中，其它成分与营养肉汤相同。35℃，150r/min的摇床上培养36h，将Y1发酵液采用牛津杯法进行大肠杆菌抑菌试验，结果显示蔗糖效果最佳，抑菌圈直径达到14mm；（4）氮源单因素实验：以2%的接菌量分别接种Y1到含0.5g不同氮源：1％酵母浸出物、牛肉膏、尿素0.5g、氯化铵0.5g、（酵母浸出物：胰蛋白胨=1:1）0.5g、(酵母浸出物:胰蛋白胨:尿素=2:2:1)0.5g和(酵母浸出物:胰蛋白胨:氯化铵=2:2:1)0.5g50ml发酵培养基中，35℃，150r/min的摇床上培养36h。将Y1发酵液采用牛津杯法进行大肠杆菌抑菌试验，氮源成分及配比为酵母浸出物：胰蛋白胨：氯化铵=2:2:1时抑菌效果最佳，抑菌圈直径为13.5mm；（5）无机盐单因素实验：以2%的接菌量分别接种Y1到含0.2g不同无机盐：硫酸锰、硫酸镁、硫酸亚铁、氯化钠和氯化钙50ml发酵培养基中。35℃，150r/min的摇床上培养36h。将Y1的发酵液采用牛津杯法进行大肠杆菌抑菌试验，最佳无机盐为硫酸镁，抑菌圈直径达到14mm。实施例2、正交试验优化解淀粉芽孢杆菌Y1发酵参数（1）正交实验根据单因素多水平试验结果，选择发酵温度、发酵时间、发酵培养基pH为影响因素，设计三因素四水平正交试验。采用最佳发酵培养碳源、氮源和无机盐条件，每组样品设三次重复，采用营养琼脂培养基以倾注平板培养法检测发酵液中的活菌数量，实验结果见表1；由表1极差分析可知，对发酵液的活菌数影响因素的顺序为：C＞A＞B，即发酵培养基pH影响最大，发酵温度次之，发酵时间影响最小。由结果分析得出发酵参数的最优组合为A2B4C2，即优化后的发酵条件为：发酵温度为35℃，发酵时间为40h，pH为7.3；表1解淀粉芽孢杆菌Y1发酵条件正交试验结果表(2)验证试验根据正交试验优化结果进行验证试验。在5L自动发酵罐中以1L最佳发酵培养基。采用营养琼脂以倾注平板培养法检测发酵液中的活菌数量，每个稀释度设3次重复，结果见表2；表2正交试验的验证试验结果发酵条件组合发酵液活菌数×109(CFU/mL)35℃、40h、pH7.3（优化组）8.65±0.0537℃、32h、pH7.8（对照组）2.02±0.10由表2可知，在优化条件下进行发酵，发酵液活菌数达8.65×109CFU/mL，是对照组活菌数的4倍多。实施例3、解淀粉芽孢杆菌Y1活菌制剂的制备方法1、菌种的活化和扩大培养（1）将-20℃下甘油试管保藏的解淀粉芽孢杆菌Y1转接入5mL营养肉汤到10ml离心管中，35℃，150r/min的摇床上培养12h，如此活化2代后，冷藏备用；（2）将活化好的菌液以2%的接菌量扩大培养解淀粉芽孢杆菌YX5到50ml的营养肉汤培养基中，35℃，150r/min的摇床上培养18h，得到扩大培养液；2、高密度发酵将2LY1最佳发酵培养基加入到5L全自动发酵罐中，利用发酵罐灭菌系统于115℃灭菌15min，利用冷水机将发酵罐中的培养基冷却至发酵温度。将Y1菌株的扩大培养液按2%(V/V，体积分数)的接种量移种至发酵罐中，利用发酵罐自动控温系统维持发酵温度为35℃，发酵液pH7.3，搅拌转速为150r/min，发酵36h，得到发酵液；3、离心浓缩与加保护剂将发酵液4℃条件下，4000r/min离心20min，弃上清液，收集得到菌泥。将收集的菌泥加入冻干瓶中，加入2.0%脱脂奶粉和3%甘油作为冻干保护剂，混合均匀后，得到浓缩活菌制剂；4、预冻和冻干将浓缩活菌制剂于-30℃预冻15h至完全冻结状态，得到预冻活菌制剂。利用6L真空冷冻干燥机将预冻活菌制剂于冻干温度-55℃、真空度0.16mBar的条件下，冻干48h至完全干燥状态，得到冻干活菌制剂；所得解淀粉芽孢杆菌Y1活菌制剂的活菌数量可达1.0×1010CFU/g以上，菌种存活率可达85%以上。该活菌制剂价格低廉，活菌数量高，可作为畜禽饲料添加剂，具有调节畜禽的肠道菌群平衡作用。当前第1页1 2 3