一种蜡样芽孢杆菌及其制剂及应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于微生物技术领域，更具体地，涉及一种蜡样芽孢杆菌、其筛选方法、制 剂及应用。
【背景技术】
[0002] 抗生素被广泛用于我国畜牧业养殖中，并以其本体或转化形态随着动物粪便和尿 液排入环境，并在环境中蓄积，造成环境中抗生素污染。抗生素进入环境后会破坏环境中原 有微生物种类平衡，从而导致相应生态系统失衡。另外，环境中的土霉素还可以通过生物链 进入人体，对人体健康造成威胁。为此，我国科技部启动国家高技术研究发展计划（863计 划），设立"集约养殖外源化学品污染控制技术"重大专项，主要针对集约养殖场造成的抗生 素污染从源头上进行处理。土霉素作为目前使用量最大的兽用抗生素，成为科技攻关的核 心问题。
[0003] 近年来，残留抗生素在环境中的降解、转化、迁移、归趋和对动植物、微生物等影响 有关的研究很多并呈上升趋势，成为国内外研究热点，但是有关如何削减环境中残留抗生 素的研究目前还比较少见。
[0004] 目前抗生素污染控制技术主要包括物理、化学及生物处理技术。抗生素的物理去 除方法主要有活性炭吸附、胶体吸附、絮凝沉淀以及膜过滤等方法。而抗生素的化学去除方 法现在以离子法为主。由于抗生素的生物降解相对其他物理、化学方法，具有成本低廉、环 境影响较小的独特优势，目前以受到广泛关注，而微生物在其中的作用也得到了重点研究。 许晓玲等从长期堆放四环素药渣的土壤中筛选四环素降解菌株两株，分别为缺陷短波单胞 菌和人苍白杆菌。它们均可利用四环素作为碳源生长。李丽等通过研究最终找到一种对 氯嘧磺隆10mg/L的降解率为94. 78%细菌。
[0005] 土霉素作为使用最为广泛的抗生素，目前其污染控制技术主要为堆肥，相应的土 霉素降解率仅为40%左右。因此，迫切需要找到一种堆肥强化手段以提高土霉素降解率。
【发明内容】
[0006] 针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种土霉素高效降解菌，其 目的在于降解土霉素，由此解决普通不加菌堆肥法降解土霉素效率低下的技术问题。
[0007] 为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种能够降解土霉素的蜡样芽 孢杆菌，其分类命名为蜡样芽孢杆菌0214Bacilluscereus0214,于2014年3月5日保藏 于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号为CCTCCM2014061，保藏地中国武汉。
[0008] 按照本发明的另一方面，提供了一种筛选土霉素高效降解菌的方法，包括以下步 骤：
[0009] (1)单菌落培养：取受土霉素污染的猪粪制备成菌悬液，将菌悬液加入到基础培 养基中，培养出细菌单菌落；所述基础培养基含有400yg/ml至500yg/ml的放线菌酮；
[0010] (2) 土霉素筛选：将步骤（1)中获得的细菌单菌落，分别加入含土霉素的基础培养 基，不断提高基础培养基中土霉素的浓度直至不低于200mg/L，保留能适应所述土霉素浓度 的细菌单菌落；
[0011] (3) 土霉素降解菌筛选：将步骤（2)中获得的细菌单菌落，分别加入无机盐培 养基培养，不断提高土霉素浓度直至不低于200mg/L，分时段测定培养基内土霉素含量和 0D600,计算土霉素降解率，保藏土霉素降解率不低于50 %且0D600不低于0. 2的细菌；
[0012] 所述无机盐培养基每升含：NaH2P040 . 05 % ~0? 1 %、K2HP040. 05 % ~0? 1 %、 (NH4) 2S04〇m，pH值在 7. 0 至 7. 4 之间。
[0013] 按照本发明的另一方面，提供了一种蜡样芽孢杆菌制剂，包括所述的蜡样芽孢杆 菌干粉和有机基质，所述芽孢杆菌干粉和有机基质质量比例在1:4至1:5之间。
[0014] 优选地，所述蜡样芽孢杆菌制剂，其特征在于，所述有机基质为腐殖酸、玉米粉、淀 粉、麸皮中的一种或多种；优选腐殖酸。
[0015] 按照本发明的另一方面，提供了一种所述蜡样芽孢杆菌制剂的制备方法，包括以 下步骤：
[0016] (a)将如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌种子液接入发酵罐培养基内培养，接种 量为2 % -5 %，直至形成芽孢不低于90%，获得发酵液；所述发酵罐培养基的配置如下： 大豆粉6~7 %、玉米粉7~8 %、麸皮1 %~2 %、腐殖酸0? 5 %~1 %、NaH2P040 . 05 %~ 0? 1%、K2HP040. 05%~0? 1%和（NH4)2S040. 1%~0? 2%，调pH值为 7. 0 ~7. 4,高温高压灭 菌 15_30min。
[0017] (b)将步骤（a)中获得的发酵液离心，去除上清液，添加有机基质，获得含蜡样芽 孢杆菌的混合物；
[0018] (c)将步骤（b)中的混合物在30°C至50°C下干燥，控制其水分在5%至8%之间， 粉碎后即获得所述蜡样芽孢杆菌制剂。
[0019] 优选地，所述蜡样芽孢杆菌制剂的制备方法，其蜡样芽孢杆菌种子液用所述蜡样 芽孢杆菌菌种通过多级培养的方式制得。
[0020] 本发明提供的蜡样芽孢杆菌应用于土霉素污染的猪粪堆肥。
[0021] 优选地，本发明提供的蜡样芽孢杆菌应用于土霉素污染的猪粪堆肥，包括以下步 骤：
[0022] A、取土霉素污染的猪粪，加入碳源和水，控制碳氮比在20至25之间，含水率在 60%至70%之间，添加如权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌或其活性制剂，使得猪粪混有活 菌数目不低于l〇6/g;
[0023] B、将经步骤A处理的猪粪，在25°C至35°C的条件下堆肥，不少于20天。
[0024] 总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，能够取得下列有 益效果：
[0025] (1)本发明选择土霉素污染猪粪用于土霉素高效降解菌的筛选研究，是基于所筛 得菌株为猪粪中土著菌，相比于现有技术从土霉素生产药渣或土壤中筛选菌株而言，对猪 粪生长环境具有更强的适应性，能够缩短后续加入猪粪中进行堆肥处理的延迟期，更快的 发挥作用，缩短降解土霉素时间，适合大规模应用，这对工程应用具有重要意义；
[0026] (2)本发明提供的土霉素高效降解菌的筛选，通过选择抗菌药物种类及用量，控制 细菌菌落及真菌菌落生长状况，从而精确选择目标菌种，防止杂菌干扰，选择效率高；
[0027] (3)本发明提供的蜡样芽孢杆菌制剂，通过选择适当的有机基质，与蜡样芽孢杆菌 合适的配比结合，使得蜡样芽孢杆菌更加易于保藏，适合环境下生长更为迅速，降解效率更 商；
[0028] (4)本发明利用所述蜡样芽孢杆菌进行堆肥，能有效降解抗生素，相对于其他物 理、化学方法，成本低廉，环境影响小。
【附图说明】
[0029] 图1是蜡样芽孢杆菌B.cereus0214的形态特征；
[0030] 图2是实施例8猪粪堆肥实验数据分析图；
[0031] 图3是实施例9猪粪堆肥实验数据分析图；
[0032] 图4是实施例10猪粪堆肥实验数据分析图；
[0033] 图5是实施例11猪粪堆肥实验数据分析图。
【具体实施方式】
[0034] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对 本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并 不用于限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要 彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
[0035] 本发明提供的蜡样芽孢杆菌，其特征在于，其分类命名为B.CereUS〇214,于2014 年3月3日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏地址中国武汉大学，保藏编号为 CCTCCM2014061。
[0036] 经鉴定，该菌具有以下特征：
[0037] (1)菌落形态：菌落近圆形，灰白色，不透明，菌落较大，直径为5~7mm，边缘不整 齐呈扩展状，表面稍有光泽呈白蜡状，不分泌色素；
[0038] (2)细胞形态：革兰氏阳性杆菌，杆状，菌株宽度为1.0~1.2iim，长为3.0~ 5. 0ym，无鞭毛，中生芽孢，孢囊无明显膨大；
[0039] (3) 16SrRNA鉴定结果：芽孢杆菌属；
[0040] (4)生理生化特征：兼性厌氧，酚红葡萄糖肉汤鉴定实验结果为阳性，改良v-p培 养基鉴定实验结果为阳性，硝酸盐肉汤鉴定实验结果为阳性，动力_硝酸盐培养基（A法） 鉴定实验结果为阳性，木糖-明胶