一株蜡状芽孢杆菌及其在产氨肽酶中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及一株深海来源的氨肽酶生产菌株，具体涉及蜡状芽孢杆菌cereus SffJS 54)及其液体发酵所产的氨肽酶。
【背景技术】
[0002]氨肽酶是一类从多肽链的N端顺序水解氨基酸、使氨基酸逐个释放出来的外切酶，广泛分布于动物、植物及微生物中。外肽酶在生物体内主要涉及信号转导、肽类激素的调节、蛋白质结合和消化等过程，所以一直是医学领域内的重要课题。另一方面氨肽酶在食品工业中也有着重要的应用，如实现蛋白质的深度水解、减弱蛋白酶解液的苦味、制备生物活性多肽等。氨肽酶的研究始于1936年，Johnson等发现了三种来源于Aspergillus
的肽酶,经过几十年的发展，国内外学者陆续有关于新的氨肽酶的研究的报道。但到目前能查到了食品工业中用的商业氨肽酶仅有Rhodia Food和NOVO公司生产的产品，氨肽酶活力分别为220 LAPg—1和500 LAPg'现有的氨肽酶产品显然不能满足食品工业大量需求，氨肽酶产品的开发有重要的应用前景。
[0003]目前氨肽酶的来源主要有两个方面，一是从高等动物的胰脏和肠液、肌肉中提取分离出一些氨肽酶，存在提取工艺复杂、提取效率低等问题；另外一个重要来源就是微生物所产的氨肽酶。H.Choi等于1996年利用乳酸菌产氨肽酶的水平为0.16 LAP -mr1左右，田亚平等利用枯草芽孢杆菌Zj016生产氨肽酶达到5500 U.mL—1，赵光鳌等利用诱变米曲霉生产氨肽酶达到323.1 UiL—1等。目前已报道的产氨肽酶的菌株主要是米曲霉、红曲霉、枯草芽孢杆菌、嗜热芽孢杆菌等。本发明从深海沉积物中分离得到一株产氨肽酶的蜡状芽孢杆菌，并对其氨肽酶性质进行了初步的研究，旨在为氨肽酶产品的开发提供新的生产菌种及理论基础。
【发明内容】
[0004]本发明的目的是提供一株蜡状芽孢杆菌及其在产氨肽酶中的应用。
[0005]本发明的一株蜡状芽孢杆菌分离自南海深海沉积物样品，采用酪蛋白平板初筛和摇瓶发酵氨肽酶活性测定复筛得到，分类命名为蜡状芽孢杆菌cereus SffJS54)。该菌株已于2014年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路I号院中科院微生物研究所，保藏编号为CGMCC N0.9697。
[0006]对保藏编号为CGMCC N0.9697菌株的16S rRNA基因进行PCR扩增与序列测定，测得16S rDNA基因片段长度为1353bp，具体序列见序列表。该基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行分析得知，该菌株与数据库中Cerew1S不同菌株的16S rDNA序列性具有99%的相似性,与cereus strain B4相似性最高，同源性达99%,鉴定该菌株为蜡状芽孢杆菌(也&77心cereus SffJS 54)。
[0007]本发明对保藏编号为CGMCC N0.9697菌株液体发酵产氨肽酶的最适反应温度、最适反应pH、温度及pH稳定性、底物特异性进行了研究。
[0008]与现有技术相比，本发明具有如下优点和效果:本发明筛选得到一株深海来源的产氨肽酶的菌株蜡状芽孢杆菌SWJS 54，其氨肽酶反应条件温和，有较强的特异性。该菌株可能成为新型氨肽酶资源的生产菌种或提供新的氨肽酶编码基因，具有重要的后续开发及工业应用价值。
【附图说明】
[0009]图1为蜡状芽孢杆菌SWJS 54产氨肽酶的最适反应温度曲线。
[0010]图2为温度对蜡状芽孢杆菌SWJS 54产氨肽酶稳定性的影响曲线。
[0011]图3为蜡状芽孢杆菌SWJS 54产氨肽酶的最适反应pH曲线。
[0012]图4为pH对蜡状芽孢杆菌SWJS 54产氨肽酶稳定性的影响曲线。
[0013]图5为蜡状芽孢杆菌SWJS 54产氨肽酶的底物特异性对比图。
【具体实施方式】
[0014]以下结合实例对本发明的实施作进一步说明，但本发明的实施和包含不限于此，需指出的是，以下若有为特别详细说明之处，均是本领域技术人员可参照现有技术实现的。
[0015]富集及种子培养基:蛋白胨5g，酵母粉lg，人工海水lL，pH 7.4-7.6。
[0016]酪蛋白培养基:酪蛋白10g，牛肉浸粉3g，磷酸二氢钾2g，琼脂粉15g，人工海水IL’pH 7.2 左右。
[0017]发酵培养基:甘油3g，葡萄糖5g，酵母粉10g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸镁0.3g，硫酸铵lg，氯化钙lg，海盐10g，PH7.2。
[0018]产氨肽酶的CGMCC N0.9697的分离筛选
富集培养:称取2g深海海泥样品样于50mL灭菌离心管中，加15mL无菌蒸馏水，充分混合，在摇床中振摇30min，静置后取上清液ImL于富集培养中(25 mL /250mL), 37°C,120rpm，培养 48h。
[0019]初筛:取富集后的培养液ImL加入9mL无菌生理水中，用倍比法稀释到不同梯度(KT1-1(T7)tj选取10Λ 10_5，10_6，10_7稀释度，各吸取0.lmL，加入已凝固的酪蛋白培养基中，涂布均匀。倒置放在37 °C培养箱中培养24-48h。
[0020]分离纯化:挑选上述酪蛋白平板中有明显水解圈的菌落，在新的酪蛋白平板上连续划线分离三次以上，直到为纯培养物为止。挑选水解圈较大的单菌落保存于试管斜面上，保藏于4°C冰箱。
[0021]摇瓶发酵复筛:将上述保藏的菌株接种于种子培养基中，37°C，150rpm，活化12h，以2%接种量接种于发酵培养基中，37°C，150rpm，培养48h。发酵液在4°C，1000rpm离心1min,取上清液即为粗酶液。采用LNA法测定氨肽酶活力，复筛出液体发酵氨肽酶产量高的菌株。
[0022]氨肽酶活性测定:将粗酶液用pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液稀释到合适的浓度，取80 μ L样品稀释液加入96孔板中，加20 μ L L-亮氨酸对硝基苯胺(L-leu-pNA)，在40°C准确反应10 min后,加入100 μ L无水乙醇终止反应,测定405nm下的吸光值。以不同浓度对硝基苯胺在405nm下的吸光值绘制标准曲线。40°C每分钟酶解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生I μ mol对硝基苯胺所需的酶量即为一个酶活单位。
[0023]产蛋白酶的CGMCC N0.9697的鉴定
将活化的CGMCC N0.9697接种于LB培养基中，37°C，150rpm培养10h，取1.5mL新鲜菌液4°C，1000rpm离心5min，收集菌体于2mL离心管中，采用DNA提取试剂盒提取DNA。电泳检测后采用通用弓I物进行PCR (正向引物:5 ’ -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ’，反向引物:5’ -GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)。
[0024]扩增总反应体系为(20 μ L):模板基因DNA 0.5yL;上下游引物(20μηιο1/1)各
1.0 μ L ;Taq DNA 聚合酶 0.2 μ L ; 10 X buffer 2.0 μ L ;4 种脱氧核苷酸混合物 dNTP (各 2.5mmol/L) 1.6 μ L，25 mmol/L MgCl2 1.6 μ L，双蒸水(ddH20) 12.1 μ L。PCR 扩增条件:95°C 5min ；95°C 30 s ；55°C 30 s ；72°C 1.5 min ；72°C 10 min ;10°C，共 30 个循环。PCR 产物纯化后完成测定的16S rRNA基因基因片段长度为1353bp,与cereus strain B4相似性最高，同源性达99%,与其它Bacillus不同菌株的16S rDNA序列性达99%,具体序列见序列表，鉴定CGMCC N0.9697为腊状芽抱杆菌cereus SffJS 54)。
[0025]蜡状芽孢杆菌CGMCC N0.9697所产氨肽酶的酶学性质研究
最适反应温度:粗酶液通过超滤浓缩、凝胶柱层析后得到电泳纯酶，分别在25°C、30 °C >35 °C >40 °C >45 °C >50 °C >60 °C >65 °C、70°C、75 °C 测定氨肽酶的活力，以最高活力为100%，以其它温度下氨肽酶的活力以最高酶活的百分比表示，结果见图1。氨肽酶在60°C下活力最高，在50 - 65°C有较高的活力。温度低于25°C或高于75°C基本无活力。
[0026]热稳定性的研究:将氨肽酶在25 - 75°C范围内保温30min后，在60°C下测定残留的氨肽酶活力，以不保温时的酶活为100%，结果见图2。温度低于55°C，保温30min后活力基本不变，60 - 65°C保温30min剩余50%左右的活力，温度高于65°C则较快失活。
[0027]最适pH:用pH 6.0_10.0的缓冲液稀释酶液，在60°C下分别测定氨肽酶的活力，结果见图3。该氨肽酶的最适反应pH为9.5，在pH 7.5-9.5范围内有较高的活力，pH超出此范围测活力大大降低，低于50%。
[0028]pH稳定性:将氨肽酶在不同的pH缓冲溶液(pH 3.0_10.0)放置(4°C )不同的时间，然后在pH9.5、60°C下测定氨肽酶活力，以放置Oh时的活力为100%，结果见图4。该氨肽酶在pH 5.0-10.0范围内有较好的稳定性，放置48h后仍能保持80%以上的活力，pH低于
5.0时稳定性较差。
[0029]底物特异性:在相同的条件下，分别测定不同的氨基酸-对硝基苯胺(Leu-/7NA、Phe_/?NA、Ala_/?NA、Arg-/?NA、Glu_/?NA、Lys_/?NA、Pro-/?NA 和 Met_/?NA)作为底物时氨妝酶的活力，以Leu-^NA作为底物时的活力为100%。如图5可知氨肽酶对Leu-^NA和Met-^NA有较强的底物特异性，氨肽酶活力较高，对其他底物的特异性差。
【主权项】
1.一株蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus SffJS 54)，该菌株于2014年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC N0.9697。
2.权利要求1所述的蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus SffJS 54)在液体发酵产氨肽酶中的应用。
【专利摘要】本发明涉及一株蜡状芽孢杆菌及其在产氨肽酶中的应用。该深海来源的产氨肽酶的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus SWJS 54），于2014年9月23日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9697。该菌株所产氨肽酶的最适反应温度为60℃，温度不高于55℃保温30min活性基本不变；最适反应pH 9.5,在pH 5-10的范围内有较好的稳定性。该酶对N端为亮氨酸及甲硫氨酸的肽键有较强的水解能力，属于亮氨酸氨肽酶。可与内切酶协同作用以提高蛋白酶解利用率、蛋白酶解液脱苦、制备生物活性肽等。CGMCC No. 969720140923
【IPC分类】C12N1-20, C12N9-48, C12R1-085
【公开号】CN104651283
【申请号】CN201510100394
【发明人】赵谋明, 崔春, 雷芬芬, 赵强忠
【申请人】华南理工大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月6日