产气荚膜梭状芽孢杆菌疫苗的制作方法

专利名称：产气荚膜梭状芽孢杆菌疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及产气荚膜梭状芽孢杆菌(Clostridium perfringens)β-毒素的脱毒的免疫原性衍生物，编码所述衍生物的DNA，含有编码所述衍生物的DNA的产气荚膜梭状芽孢杆菌，含有编码所述衍生物的DNA的革兰氏阳性细菌表达系统，表达野生型β-毒素的基于非产气荚膜梭状芽孢杆菌的革兰氏阳性细菌表达系统，基于此制备的用于抵抗产气荚膜梭状芽孢杆菌的疫苗，用于制备天然的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的方法，用于制备产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的脱毒的免疫原性衍生物的方法，和用于制备抵抗产气荚膜梭状芽孢杆菌的疫苗的方法。产气荚膜梭状芽孢杆菌(也称为魏氏梭状芽孢杆菌)是大属梭状芽孢杆菌的一个种。所有属于该属的细菌是形成孢子的厌氧革兰氏阳性芽孢杆菌。产气荚膜梭状芽孢杆菌种被划分为亚种。已经有人描述了五个亚种。通常将这些亚种称作“型”A-E。所有的亚种产生几种毒素，包括主要的和次要的毒素。四种主要的毒素是α,β,ε和τ毒素。产气荚膜梭状芽孢杆菌的所有的型产生α-毒素。β-毒素是由B和C型产气荚膜梭状芽孢杆菌产生的。另外，产气荚膜梭状芽孢杆菌的所有的型产生各种各样的次要毒素。这主要是由于在这5种产气荚膜梭状芽孢杆菌的型中存在一种或多种这些不同的毒素，所有的产气荚膜梭状芽孢杆菌种是致病的。
已知A型是人和猪的致病菌。B型主要是羔羊，绵羊和山羊的致病菌，并且引起“羔羊痢疾”和出血性肠炎。C型是人，绵羊，小牛，羔羊，猪和鸟的致病菌。它是“羊肠毒血病”，出血性肠炎，坏死性肠炎和肠性毒血症的致病因子。
如上文提到的，已知B型和C型产气荚膜梭状芽孢杆菌产生β-毒素。已知β-毒素在人和动物的坏死性肠炎的发病机理中起着主要的作用。对于人，已经将该疾病称作为pigbel(Johnson等人，Lancetⅱ:496-500,(1987))。对于动物，已经描述了小牛，羔羊和猪的坏死性肠炎(Hauschild,A.H.W.in S.Kadis,T.C.Montie,(ed.)微生物毒素，p.159-188。Academic press,Inc.New York(1971)和Willis,T.A.厌氧细菌学临床和实验室实践，第3版，Butterworths，伦敦(1977))。
已经从产气荚膜梭状芽孢杆菌分离到纯化形式的β-毒素(Sakurai等人，感染和免疫学18:741-745(1977),Sakurai等人，Toxicon25:1301-1310(1987))。对于该毒素的生物物理特性仍有许多是未知的，由此对于其作用模式也是未知的。但是，由于能够获得纯化形式的该毒素，在动物中清楚地证明了β-毒素的毒性。由Sakurai等人证明了纯化的β-毒素对例如小鼠和豚鼠的致死毒性(感染和免疫学21:678-680(1978),Sakurai等人，Toxicon 25:1301-1310(1987))。
近来，已经由Hunter等人阐明了产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的核酸序列(感染和免疫学61:3958-3965(1993))。核酸序列显示β-毒素蛋白质的大小是约35千道尔顿。
由于在发病机理中来自于B和C型的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的作用是首要的重要，在研制抗该毒素的免疫方面已经有许多的尝试。抗β-毒素的免疫足以保护免受B和C型产气荚膜梭状芽孢杆菌的感染。诱导抗β-毒素的免疫力的唯一的途径是以该毒素给待保护的动物给药。但是显然必须供给脱毒形式的所述毒素，因为否则的话给药会导致待免疫接种动物的严重的疾病或死亡。
大约在1960年已经获得了基于脱毒形式的β-毒素，也称作为β-类毒素的疫苗(例如英国专利No.901,433和美国专利No.3,288,680)。
但是目前可获得的基于失活的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的所有疫苗已经有几方面的明显的缺点。
在第一方面，所有基于β-毒素的疫苗包括化学脱毒的，主要是福尔马林脱毒的β-毒素，多年的实践证明使这些化学脱毒过程标准化是非常困难的。用于蛋白质脱毒的经典的化学方法具有缺点他们以相当随机的方式改变了该蛋白质的总的结构。因此，在化学脱毒过程中，β-毒素的免疫原性特性也快速地降低。例如从

图1和2可以看到这一点在图2中，显示了在标准条件下，至少1％的福尔马林，一种非常普遍使用的失活化合物，对于β-毒素的脱毒是必须的。但是，从图1和图2可以看到，随着福尔马林的量的增加，抗原性效价显著地下降了。不管怎样不可能得到全部效价，因为即使是脱毒必需的福尔马林的最低量(图2)也已经使效价下降。这意味着只存在很窄的带，其中可以得到脱毒和合理的效价和由此获得的免疫原性。给出这一非常窄的带，和至少存在三种变化脱毒的时间，温度和精确的福尔马林浓度的事实，再现性地生产脱毒的β-毒素是非常困难的就很显然了。所以非常需要对β-毒素脱毒的另一条途径。由于下面的原因至今还没有发现可接受的选择途径足够水平的脱毒性和残留的免疫原性之间的精细的平衡意味着在一方面是该蛋白质的结构和另一方面是该蛋白质的生物学特性之间的紧密联系。所以还不可能期望存在这样的可能改变蛋白质的结构从而使该蛋白质脱毒，同时没有明显损害该蛋白质的免疫原特性。
本发明的一个优点是第一次公开了避免上面提到的问题的方法利用遗传操作技术，惊人地发现了可以突变的特异的和较大氨基酸区域以便提供需要的β-毒素的非毒性的衍生物而没有明显地损害它的必须的免疫原特性。
因此，在一个实施方案中，本发明涉及了在野生型β-毒素中不存在的在它的氨基酸序列中至少携带一个突变的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的脱毒的免疫原性衍生物或其免疫原片段。
其免疫原片段可理解为，虽然不包括β-毒素的衍生物的全部长度的氨基酸序列，但仍然含有能够在宿主动物中诱导保护性免疫应答的衍生物的那些区域的片段。突变可理解为与野生型β-毒素的氨基酸序列相比衍生的β-毒素的氨基酸序列的变化。突变是替代，缺失，插入或倒位，或它们的组合。突变可以是例如β-毒素的一个或更多的氨基酸被具有不同特性的其它氨基酸替代。适当的替代是例如带正电的氨基酸替代了带负电的氨基酸，如赖氨酸替代了天冬氨酸。另一个适当的替代是脂肪族的氨基酸替代芳香族氨基酸例如色氨酸甘氨酸。同时还有亲水氨基酸替代疏水氨基酸，例如天冬氨酸替代异亮氨酸是合适的。
因此，本发明的优选形式涉及本发明的β-毒素的衍生物，其中至少一个突变是替代突变。显然，在替代之外，仍然能够诱导免疫学应答，但含有提供β-毒素的非毒性衍生物的一个或多个氨基酸的插入和/或缺失的突变也是本发明的一部分。所以同样优选的形式，本发明涉及本发明的β-毒素的衍生物，其中至少一个突变是缺失或插入。当存在两个或更多突变，替代和缺失/插入突变的组合同样是可能的。如果在小鼠中β-毒素的衍生物的LD50(在实验中杀死所有动物的50％的致死剂量)至少比天然β-毒素的LD50高10倍，那么认为该β-毒素衍生物是非毒性的。天然β-毒素的LD50约为0.15微克/小鼠。
如前面提到，本发明的一个优点是，与本领域设想的相反，发现可以从遗传上改变β-毒素的氨基酸序列以致得到非毒性的但仍然具有免疫原性的类毒素。然而，不是所有突变导致需要的非毒性和仍具有免疫原性的β-毒素衍生物。所以，已经开发了快速筛选和选择产生仍然具有免疫原性的β-毒素非毒性衍生物的试验。这一试验允许筛选大量的产生非毒性但仍然具有免疫原性的β-毒素的衍生物的突变体。下面将公开这一试验。
还发现优选地将在β-毒素的中性和亲水部分之间形成转换区域的那些区域作为导入得到具有需要的特性的β-毒素的非毒性衍生物的突变的靶区是恰当的。通过将Hoop-Woods算法应用到β-毒素的序列，可以容易地跟踪这些区域(Hopp和Woods；Proc.Natl.Acad.Sci.78:38248-3828(1981))。所以，在这一实施方案的更优选的形式中，本发明涉及具有定位于β-毒素的中性和亲水部分之间的转换区的突变的β-毒素的衍生物。
非常适于作为突变的靶区的区域定位于位置62，位置182，位置197，与肽前导甲硫氨酸相关的氨基酸编号80-103,145-147,281-291,295-299之间和氨基酸位置292的唯一的半胱氨酸的下游区。所以，甚至以一个更优选的形式，本发明涉及具有一个突变的β-毒素的衍生物，该突变至少定位于下列区域之一在位置62,182,197和氨基酸编号80-103,145-147,281-291,295-299之间和/或与肽前导甲硫氨酸相关的氨基酸位置292下游的区域。以甚至更为优选的形式，该突变定位于位置62，位置80-82，位置95-97，位置101-103，位置145-147，位置182，位置197，位置287-291，位置295-299。
通过化学地替代或修饰蛋白质中的氨基酸可以产生本发明的β-毒素的非毒性免疫原性衍生物。它们也可以通过在编码β-毒素的基因中导入突变产生。下面将叙述在DNA片段中导入突变的方法。然后突变的DNA片段可以例如克隆进核苷酸序列如适当的表达质粒并随后表达。
所以，在另一个实施方案中，本发明涉及含有具有作为特性的编码从遗传上脱毒的本发明的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的免疫原性衍生物或其免疫原性片段的突变DNA片段的核苷酸序列。
如前面提到，在这一实施方案的优选形式中，本发明涉及具有定位于β-毒素的中性和亲水部分之间的转换区的突变的β-毒素的衍生物。通过表达编码这一的β-毒素的衍生物的DNA片段可以制造这样的β-毒素的衍生物。所以，在优选的形式中，编码β-毒素的衍生物的突变的DNA片段具有在至少一个编码β-毒素的衍生物的中性和亲水部分之间的转换区域的DNA区域中的突变。
本发明的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的脱毒的免疫原性衍生物例如可以通过将编码β-毒素的基因随机诱变得到。本领域诱导随机诱变的许多方法是已知的，例如利用化学诱变试剂的化学诱导诱变，通过紫外辐射或γ-辐射的诱变或利用重组DNA技术的随机诱变。DNA水平的突变也可以在特异位点产生定点诱变。这是在已知的遗传工程技术的帮助下进行的。例如可以使用限制性酶切出在或包含靶区的DNA片段，和用具有突变序列的合成片段替代这些片段。定点诱变也是在靶区中导入突变的非常方便的技术。如果该突变有关替代突变，阅读框架当然将保持不变。缺失和/或插入突变和替代突变的组合也是可能的。上面叙述的DNA突变技术是本领域熟知的并已经在Maniatis，分子克隆，冷泉港实验室出版，ISBN 0-87969-309-6(1989)中有叙述。
表达本发明的β-毒素的衍生物的适当的细菌表达系统是产气荚膜梭状芽孢杆菌细菌本身。利用同源重组法，编码本发明的β-毒素的衍生物的突变的DNA片段可以容易地替代天然的β-毒素基因。同源重组是本领域已知的技术。
然后，这样得到的重组产气荚膜梭状芽孢杆菌细菌生产本发明的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的遗传上脱毒的免疫原性衍生物。所以在另一个实施方案中，本发明涉及含有带有如上所述的突变DNA片段的核苷酸序列的产气荚膜梭状芽孢杆菌细菌。
但是在从产气荚膜梭状芽孢杆菌中分离毒性的和遗传性改变的非毒性产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的过程中遇到几个其它问题。首先，从操作人员的健康观点出发梭状芽孢杆菌是生长危险的细菌。用于生产β-毒素的梭状芽孢杆菌菌种的生长必须在高度安全的条件下进行，而该条件使大规模生产变得困难。第二，如上所述，与β-毒素一起产生了几个其它主要的/次要的毒素。正如对疫苗生产是必须的，在这些毒素中，β-毒素的分离和纯化是困难的和耗时的。第三，梭状芽孢杆菌菌种是形成孢子的细菌。从β-毒素制剂中去除所有孢子并同时保留β-毒素的免疫原特性是必须的但也是困难的，因为这些孢子对热和化学试剂是高度抗性的。所以，显然需要提供无其它梭状芽孢杆菌毒素和无梭状芽孢杆菌孢子的β-毒素的方法。
前面已经叙述了用于芽孢杆菌β-毒素的表达的基于革兰氏阴性细菌大肠杆菌的非梭状芽孢杆菌表达系统。Hunter等(感染和免疫61:3958-3965(1993))已经将大肠杆菌系统用于β-毒素基因的表达。只发现了对应于期望的34千道尔顿的蛋白质的较小的带，而发现最大部分的β-毒素蛋白质是大的118kD的多体形式。Steinporsdottir等(FEMS微生物学通讯130:273-278(1995))试图在大肠杆菌中将β-毒素基因作为与谷胱甘肽S-转移酶融合的融合蛋白表达。它们也象Hunter一样，只发现高分子量的非天然的β-毒素。在这篇文章中得出的结论是大肠杆菌中产生的蛋白质与天然β-毒素具有不同的构型。所以似乎是在构型的折叠和天然β-毒素的分泌中其它梭状芽孢杆菌编码蛋白质起着附加的作用。已知这是许多其它分泌细菌蛋白质的情况。为了这一原因，由于如上所述，在结构和免疫原性之间存在精细的平衡，不能期望从除了产气荚膜梭状芽孢杆菌以外的其它来源得到并因此是非天然形式的β-毒素成为疫苗的有效基础，不管使用的表达系统如何。
现在惊人地发现，在除了产气荚膜梭状芽孢杆菌的革兰氏阳性细菌中表达天然β-毒素基因提供具有如在产气荚膜梭状芽孢杆菌中产生的天然β-毒素的所有生物学和生物物理特性和活性的天然β-毒素，但比产气荚膜梭状芽孢杆菌或大肠杆菌中产生的β-毒素具有几个非常如人所愿的优点a)它没有被产气荚膜梭状芽孢杆菌孢子污染，b)它的产生是无污染的脂多糖，c)它的产生是无其它主要/次要的芽孢杆菌毒素和d)它呈它的天然构象。这样得到的β-毒素可以用福尔马林失活，比从梭状芽孢杆菌得到的β-毒素更具有优点，因为在失活过程中唯一有待考虑的生物学材料是β-毒素本身孢子，脂多糖和其它主要/次要的梭状芽孢杆菌毒素不需要考虑，因为它们并不存在。
所以，在另一个实施方案中，本发明涉及革兰氏阳性细菌表达系统，其中革兰氏阳性细菌不是产气荚膜梭状芽孢杆菌，所述的表达系统含有编码野生型产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的基因。
β-毒素基因可以在天然启动子的控制下。它也可以置于异源启动子的控制下。这样一个启动子例如可以是Lac-启动子(Chang等，自然学275:615(1978))或Trp-启动子(Goeddel等，N.A.R.8:4057(1980))。这样一个启动子可以是强启动子，导致β-毒素的过度表达，或它可以是诱导型启动子。两类启动子在本领域是已知的。
已经叙述了几个革兰氏阳性细菌的表达系统，并且用于几个革兰氏阳性细菌科中的多用途的表达质粒是本领域已知的。作为例子有Simon和Chopin叙述的基于pAMβ1的肠球菌广谱革兰氏阳性宿主范围的复制子的表达系统(Biochimie70:559-567(1988))。这一质粒的衍生物可以用于在例如链球菌，乳杆菌，和芽孢杆菌种中表达外源基因。在非梭状芽孢杆菌革兰氏阳性细菌的组中，基因组中具有较高的AT-含量的那些细菌是最适用于从梭状芽孢杆菌属中克隆和表达基因。所以，以更优选的形式，用于制备天然β-毒素或本发明的β-毒素衍生物的革兰氏阳性细菌选自乳球菌，乳杆菌，明串珠菌，片球菌，链球菌，肠球菌，葡萄球菌，芽孢杆菌，八叠球菌，瘤胃球菌或利斯特氏菌属的组。在除了梭状芽孢杆菌属的革兰氏阳性细菌中表达本发明的突变β-毒素基因当然具有更大的优点在这种情况下可以完全省略用福尔马林脱毒处理。这样得到的β-毒素的非毒性衍生物，几乎是无孢子，无脂多糖，无其它主要/次要的芽孢杆菌毒素，是天然形式，其它优点是本身无毒性。
所以，以更优选的形式，本发明涉及革兰氏阳性细菌表达系统，所述的革兰氏阳性细菌不是产气荚膜梭状芽孢杆菌，含有编码本发明的衍生的β-毒素基因或其免疫原片段的核苷酸序列。
本发明的另一个实施方案涉及基于产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的遗传脱毒的免疫原性衍生物的，抵抗产气荚膜梭状芽孢杆菌感染的疫苗。这样的疫苗例如可以通过混合免疫学足够量的本发明的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的脱毒免疫原性衍生物和生理学可接受载体。免疫学足够量可理解为能够在宿主动物中诱导保护性免疫应答的脱毒的免疫原性产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的量。
所以，本发明的另一个实施方案涉及含有本发明产气荚膜梭状芽孢杆菌β-类毒素的衍生物或其免疫原片段，和生理可接受载体的抵抗产气荚膜梭状芽孢杆菌感染的疫苗。
生理可接受载体例如是，水或生理盐溶液。通常，疫苗另外和稳定剂混合，例如，防止易于降解的多肽的降解，从而增强疫苗的搁置寿命，或提高冷冻干燥的效力。有用的稳定剂特别是SPGA(Bovarnik等；细菌学杂志59:509(1950))，碳水化合物，如山梨醇，甘露醇，海藻糖，淀粉，蔗糖，葡聚糖或葡萄糖，蛋白质如白蛋白或酪蛋白或它们的降解产物，和缓冲液，如碱金属磷酸盐。无需说明，通过添加化合物稳定疫苗的其它方法也是本发明的实施方案。
可选择地，一个或更多具有佐剂活性的化合物可以加入到疫苗中。佐剂是免疫系统的非特异刺激剂。它们增强宿主对给药的免疫原的免疫应答。所以，以更优选的形式，本发明的疫苗含有佐剂。本领域已知的佐剂的例子有弗氏完全和不完全佐剂，维生素E，非离子嵌段聚合物，胞壁酰肽，ISCOMs(免疫刺激复合物，参见例如欧洲专利EP109942)，皂角苷，矿物油，植物油，和Carbopol(均聚物)。
特定地适于粘膜应用的佐剂例如是大肠杆菌热易变毒素(LT)或霍乱毒素(CT)。
其它适当的佐剂例如是氢氧化铝，磷酸铝和氧化铝，油乳液(例如，Bayol F(R)或Marcol52(R)，皂角苷或维生素-E可溶物。利用本领域已知的储藏活疫苗的方法可以储藏本发明的疫苗。储藏可以例如在零下温度进行。
冷冻干燥也是已知和适当的保存疫苗的方法。冷冻干燥具有的优点是它能稳定疫苗以致它能储藏在一定的温度下保持良好，该温度刚好高于保持非冷冻干燥储藏物所必须的温度。
这些疫苗可以非常有效地冷冻干燥，特别是当本发明的疫苗与稳定剂如上面提到的那些在冷冻干燥之前混合。
该疫苗可以对对B或C型产气荚膜梭状芽孢杆菌感染敏感的所有宿主如人，羔羊，绵羊，山羊，猪，鸟和小牛给药。
疫苗可以早在出生时给药，但也可以在以后的任何时期给药。部分地根据动物的大小，优选的疫苗剂量为每个动物在1和100微克的衍生物。例如猪的最适的剂量范围为20和80微克之间。
虽然原则上所有常规的给药途径都可以使用，优选地疫苗是通过腹膜内，鼻内，肌内，皮下，口或皮内给药。
本发明的另一个实施方案涉及制造抵抗产气荚膜梭状芽孢杆菌感染的疫苗的可选择的另一条途径。可以利用具有对作为宿主的人或动物敏感的B或C型产气荚膜梭状芽孢杆菌的减毒或非致病活细菌和病毒作为如上所述的本发明的突变的β-毒素基因的载体。这些所谓的活重组载体疫苗可以安全地与生理可接受载体一起对宿主动物给药它们是非致病的并且它们表达β-毒素的非毒性衍生物。基于活的重组载体的疫苗具有的优点是它们在宿主中直接生产和或呈现产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的衍生物。
用这样的重组细菌或病毒接种的动物将生产不仅抗载体的免疫原，而且抗多肽的免疫原部分的免疫原性应答，为此另外将遗传密码克隆进重组载体。这具有的优点是通过以这样的重组载体给药，可以保护其抵抗两种或更多疾病。
目前，本领域已知有许多活重组载体病毒和细菌。适当的活重组载体细菌例如是沙门氏菌种类和大肠杆菌种类。经常用于本领域作为活重组载体的病毒是腺病毒，逆转录病毒，牛痘病毒和疱疹病毒。同时适于作为特异的口服应用载体病毒是猪细小病毒。另一个用作携带编码β-类毒素的基因的活重组载体病毒的病毒是疱疹病毒伪狂犬病病毒(PRV)(例如在欧洲专利号606,437中叙述)。这样的携带β-类毒素基因的PRV将保护猪不受PRV和C型产气荚膜梭状芽孢杆菌的感染。所以，含有携带本发明的突变β-毒素基因的活重组载体生物体的抵抗产气荚膜梭状芽孢杆菌感染的疫苗也是本发明的一部分。
很显然，即使不是产气荚膜梭状芽孢杆菌中的最重要的毒力因子，天然β-毒素也是重要的。
所以，梭状芽孢杆菌菌株已经失去重要的毒力因子，该菌株中由本发明的突变β-毒素基因替代了天然β-毒素基因。这样的菌株可以用作活的减毒疫苗，因为该β-毒素不是以它的毒性形式而是非毒性衍生物形式制备的。这样一个活减毒疫苗的优点是它产生β-毒素的非毒性但仍然是免疫原性形式，而另外它还具有天然产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株的所有其它免疫原性抗原。
所以，含有活减毒产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株的疫苗也是包括在本发明内，该菌株中本发明的突变的β-毒素基因代替了天然β-毒素基因。
也是本发明的实施方案中的是除了含有本发明的β-毒素衍生物外，还含有来自其它致病原的免疫原的疫苗。这允许在一个接种给药步骤中进行抗不同疾病的接种。在这一实施方案的更优选的形式中，本发明的疫苗含有选自包括大叶性肺炎放线杆菌，伪狂犬病病毒，猪流行性感冒病毒，猪细小病毒，可传播的胃肠炎病毒，轮状病毒，大肠杆菌，猪丹毒杆菌，出血败血性巴斯德氏菌，支气管炎博德特氏菌，沙门氏菌种类，猪肺炎支原体，副猪嗜血菌和类螺旋杆菌的细菌的组的其它免疫原。
本发明还涉及制备天然产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的方法，该方法的基础是在除了产气荚膜梭状芽孢杆菌以外的革兰氏阳性细菌中表达含有编码所述的β-毒素的DNA片段的核苷酸序列。
另外，本发明提出了用于制备本发明的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的非毒性衍生物的方法。这些方法的基础是在革兰氏阳性细菌中表达含有编码β-毒素的衍生物的DNA片段的核苷酸序列。
同时，本发明提供用于制备抵抗产气荚膜梭状芽孢杆菌感染的疫苗的方法。这些方法例如包括将本发明的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的衍生物和生理学可接受载体混合。
附图的说明图1.a．质粒pTREX1ANEW的结构。阴影盒表示了MLS抗生素抗性标记的编码序列。OripAMB1质粒pAMB1的复制起点，MLS大环内酯，lincosamindes，链阳性菌素B抗生素抗性基因。下面显示了pIL253的EcoRI和平齐的SacⅠ位点之间克隆的表达盒的结构。如影线盒显示了盒的不同功能区。指出了唯一的限制位点。SD与乳酸乳球菌16S rRNA互补的Shine Dalgarno序列，ATG:SD作用的翻译起始密码。
图1.b完整的pTREX1A序列，包括限制酶位点。
图1.c高度相似的pTREX1表达盒的特征。
图1.d用于产生用于pTREX7,-14和-1A(显示5’-3’)的PCR起源的启动子片段的寡核苷酸。
图2.a:TIR偶联载体pKS90，图解表示pKS90表达盒。
图2.b完整的pKS90序列，包括限制酶位点。
图2.c用于产生形成pKS90的TIR区的人工DNA序列的寡核苷酸。
图3.a用于构建Cpβ-突变体的引物。
图3.b如用于Cpβ M1的构建过程的实施例。
图4产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的氨基酸序列。
实施例1构建表达质粒pKS90,pTREX1A,pTREX7和pTREX14pKS90质粒是高拷贝数(40-80/细胞)的pTREX1质粒基础上的θ-复制革兰氏阳性质粒，pTREX1质粒本身是以前公开的pIL253质粒的衍生物。pIL253掺入了pAMb1的广谱革兰氏阳性宿主范围的复制子(Simon,D.，和A.Chopin.1988.载体质粒家族的构建和它在乳链球菌中的分子克隆中的应用.Biochimie.70:59-567)并且由于乳酸乳球菌(Llactis)性因子它是非可动的。pIL253也缺乏tra功能，该功能是以pIL501为例的接合亲本质粒转移或有效地移动所必须的。前面已经将肠球菌pAMb1复制子转移到各种菌种中，包括链球菌，乳杆菌和芽孢杆菌菌种以及丙酮丁醇梭状芽孢杆菌(Gibson,E.M.,N.M.Chace,S.B.London和J.London.1979，细菌学杂志137:614-619,LeBlanc,D.J.,R.J.Hawley,L.N.Lee和E.J.St.Martin.1978,Proc.Natl.Acad.Sci.USA.75:3484-3487,Oultram,J.D.，和M.Young.1985,FEMS Micro.Lett.27:129-134)的各种菌种，表明了潜在的广谱宿主范围效用。尽管pTREX1(和pTREX1A)代表基本组成型转录载体，为了提高表达水平，衍生的pKS90使用了与乳球菌的翻译起始区的翻译偶联。下面给出了pKS90的构建详情和它的直接亲本pTREX1。
pTREX1通过将两个互补的低聚核苷酸退火并用Tfl DNA聚合酶延伸产生含有推断的RNA稳定序列，翻译起始区(TIR)，用于插入靶基因的多重克隆位点和转录终止子的人工DNA片段。该有意义和反义低聚核苷酸在它们的5’末端分别含有Nhel和BamHl识别位点以便有助于克隆。将这一片段克隆进pUC19NT7中的Xbal和BamHⅠ位点之间，pUC19NT7是含有来自克隆在EcoRⅠ和HindⅢ位点之间的pLET1的T7表达盒(Wells,J.M.,P.W.Wilson和R.W.F.Le Page.1993,J.Appl.Bact.74:629-636)的pUC19的衍生物。将得到的构建体命名为pUCLEX。然后在克隆进pIL253的EcoRⅠ和SacⅠ(截短)位点之前通过用HindⅢ裂解并接着用EcoRⅠ切割成平齐末端来除去pUCLEX的完全的表达盒以便产生载体pTREX。推断的RNA稳定序列和TIR是起源于大肠杆菌T7细菌噬菌体序列并在一个核苷酸位点有修饰以便增强Shine Dalgarno(SD)序列基元对乳酸乳球菌的核糖体16sRNA的互补性。将命名为P1的乳酸乳球菌MG1363染色体启动子克隆进存在于表达盒中的EcoRⅠ和BgⅢ位点之间，产生pTREX1。以前利用该启动子探针载体pSB292已经分离了这一启动子并通过引物延伸和DNA测序分析得到鉴定(Nick.R.Waterfield,R.W.F.Le Page,P.W.Wilson和J.M.Wells，基因165,1995,9-151。利用Vent DNA聚合酶通过PCR扩增启动子片段。PCR片段包括所有克隆启动子上游的DNA序列和转录起始位点的3’端的多达15个碱基。存在于这一启动子的转录起始位点的下游的Shine-Dalgarno(SD)序列被故意地从PCR扩增启动子片段中排除以便防止在除了表达盒指示的起始密码以外的位点开始翻译。利用克隆在EcoRⅠ和BgⅢ位点之间的更弱的P7和P14启动子代替P1，也已经产生了命名为pTREX7和pTREX14的两个类似的载体。图1.d说明了用于产生这些启动子片段的PCR引物。pTREX1A质粒代表了pTREX1的一种替代品，其中来自pET3A的Xbal-Spel T7-表达盒片段替代了Xbal结合的表达盒。所以SD序列对于乳球菌不是最佳的。图1阐明了完整的pTREX1A序列和图示表达盒。
pKS90:
pKS90质粒是pTREX1的衍生物，当利用同样的转录启动子P1时，它具有修饰的含有SD的TIR和乳球菌染色体起源的解离酶基因P11的起始20个密码子(Nick.R.Waterfield,R.W.F.Le Page,P.W.Wilson和J.M.Wells.基因，165.1995.9-15)。这是通过在pTREX1的BgⅢ和BamHⅠ位点之间克隆含有新的TIR的人工DNA序列得到的。图2表示了用于这一过程的低聚核苷酸序列。通过仔细选择PCR引物序列，PCR起源的靶基因可以通过翻译与这一TIR偶联，该TIR当与从pTREX1亲本质粒得到的质粒比较时已经证明有提高的表达水平。图2说明了完整的pKS90序列和图示说明表达盒。
构建分泌活性β-毒素的乳酸乳球菌的重组菌株将含有如Hunter等公开的(感染和免疫学61:3958-3965(1993))编码β-毒素的基因的pJF2000DNA(如J.Frey，兽医细菌学院，Berne大学，CH-3012Berne，瑞士提供的)电穿孔转入大肠杆菌SURE。将来自六个独立的转化体的质粒DNA分离，通过限制消化来检查并合并。将这些菌株在-70℃储藏于15％甘油。用Xbal/BamHⅠ或Smal/BamHⅠ消化从这一合并的质粒DNA制剂中切除含有相关的翻译起始区(和上游RNA稳定茎-环)的cpb基因。将纯化的cpb基因片段连接进表达载体pTREX1A,pTREX14和pTREX7的多重克隆位点，它们分别指导高，中等和低水平的组成型表达。当将Smal/BamHⅠ为末端的cpb片段连接进BamHⅠ/BgⅢ(平齐末端)的pTREX14和pTREX7DNA时，Xbal/BamHⅠ为末端的cpb片段连接到Xbal/BamHⅠ消化的pTREX1ANEW。将这些构建体成功地电穿孔转入特定的无活力的菌株乳酸乳球菌pep5-acmA-，该菌株缺乏染色体编码的肽酶pep5，该酶能让生物体利用从酪蛋白释放的肽。另外，它也缺乏与细胞壁相关的自溶素，acmA。但是任何其它乳酸乳球菌菌株适用于这一目的。利用限制消化分析鉴定了10个准确的各种类型的分离物并已经储存于-70℃下的15％的甘油中。将这些菌株类型命名为乳酸乳球菌pep5-acmA-[pTREX1Acpb]，乳酸乳球菌pep5-acmA-[pTREX14cpb]和乳酸乳球菌pep5-acmA-[pTREX7cpb]。另外，利用Vent DNA聚合酶和来自质粒pJF2000的BamHⅠ为末端的低聚核苷酸，通过PCR扩增cpb基因。将这一PCR产物克隆进TIR偶联的载体pKS90的BamHⅠ位点。
在转移到硝酸纤维素滤膜之前利用SDS-PAGE分辨从对数中期细胞和上清液提取的总蛋白质。利用MAB(单克隆抗体)纯化的β-毒素作为对照，利用抗Cpb的单克隆和多克隆抗体探测这些滤膜。通过Western印迹和SDS-凝胶的考马斯蓝染色，在来自所有四个菌株的培养物上清液中检测准确大小的单个蛋白质产物(大约30千道尔顿)。每个菌株分泌的β-毒素的量是与使用的表达载体中启动子的相对强度一致的。没有检测到胞内毒素暗示了梭状芽孢杆菌输出序列在乳球菌中有效地起作用。来自pTREX1A表达子，乳酸乳球菌MG1363 pep5-acmA-[p3-1/5]，和pKS90表达子乳酸乳球菌MG1363 pep5-acmA-[p5-123]的过滤的上清液显示含有活性毒素，提供了重组β-毒素的阳性对照。
cpb突变基因利用从存在于质粒pJF2000(由J.Fery提供)的原始的模板cpb基因(从C型产气荚膜梭状芽孢杆菌克隆)通过Vent DNA聚合酶扩增的PCR片段进行体外基因构建产生突变的cpb基因。图3给出了在这一构建中使用的引物，和使用的构建过程的例子。在终端cpbF2的5’末端和cpbR PCR引物中的BamHⅠ位点允许在pKS90表达质粒(参见上面)的BamHⅠ位点克隆这些突变体。选择掺入适当地间隔cpb ATG起始密码的BamHⅠ位点的PCR引物允许突变体cpb基因通过翻译与pKS90中的P11 TIR偶联。使用这一方法可以产生一系列突变表达菌株。利用3到4倍的冗余序列自动序列分析确定这些突变基因的准确序列(在克隆进pKS90后)，由此证实了基因序列和在表达质粒中的定位。在这些载体中克隆突变基因允许凭借天然cpb N-末端输出引导物将基因产物分泌进入培养上清液。将培养上清液过滤灭菌并直接用于动物生物测定。
表1突变基因构建体。
突变表达菌株基于pKS90的类毒素表达质粒在特定的无活力的乳球菌宿主菌株乳酸乳球菌MG1363 pep5-acmA-中增殖，但其它乳球菌菌株也可以使用。这一菌株代表了原噬菌体和用质粒处理的菌株，该菌株是高度营养缺陷型的和不能在天然牛奶环境中生存的。另外它的生长速度比其它乳球菌菌株慢。
表1代表了如上所指的非毒性表达菌株。在这一表中，指出了哪些氨基酸突变了和突变定位于哪里。
类毒素表达菌株可以生长在用0.5％w/v的葡萄糖和5克/毫升的红霉素补充的M17培养基中(Difco cat.号1856-17)。不需要通气，缺氧条件确实是优选的，虽然不是必要的。最适的生长温度是30℃。已经证明所有这些菌株产生的各种类毒素蛋白质在培养基中积累到小于5克/毫升的水平。利用单克隆和多克隆抗体二者的Western印迹分析证实准确大小的蛋白质单体是通过所有上面列出的命名表达菌株分泌到上清液中的。作为例子的突变蛋白质，M4(4-3)的N-末端序列分析证实在从乳球菌的细胞质中输出的过程中准确地切除了前导肽。
用于cpb基因的随机诱变的方案如下建立了典型的PCR反应混合物10mM Tris-HCl(pH8.7,25℃)50mM KCl,5微克/毫升牛血清白蛋白0.5μM的各种PCR引物(cpbg2:5’-ggaggatccaaatgaagaaaaaatttatttcattagttatag-3’)(cpbR:5’-atggatccgtctaaatagctgttactttgtgag-3’)4mM MgCl20.5mM MnCl23.4mM强制dNTP和0.2mM其它3dNTPs(dNTP浓度的范围可以是0.1到10mM之间)600pM的模板DNA(pJF2000cpb克隆或其它cpb衍生物)2U Taq DNA聚合酶热循环条件如下(94℃30秒，50℃60秒，72℃180秒)30个循环，接着在72℃温育600秒。
利用4个dNTP的每一个作为强制核苷酸进行反应，然后合并。这获得了替代物的适当的随机混合物。然后用BamHⅠ消化合并的PCR片段并连接到BamHⅠ消化的pKS90。将这一连接混合物转化进乳酸乳球菌MG1363。在液体培养基中生长转化体并在实施例3中叙述的体外β-毒素测试中测试过滤的上清液。
实施例2乳酸乳球菌的培养
在用0.5％w/v葡萄糖和5微克/毫升红霉素补充的M17培养基(如，Difco cat.1856-17)中生长生产基因修饰的β-毒素的乳酸乳球菌。通气不是必须的，缺氧条件是优选的，虽然不是必须的。最适生长温度是30℃。在指数生长过程中添加葡萄糖是必须的。
抗原制备通过离心手段从细胞中分离培养物上清液。在灭菌过滤上清液后，用硫酸铵沉淀衍生物(0.3克/克)。将沉淀重悬浮于PBS。作为另一种可选的方案，培养上清液可以在滤纸＜10,000道尔顿上浓缩。
小鼠致死率通过给约20克重的NRMⅠ小鼠腹膜内注射无菌过滤的培养上清液0.5毫升开始测试乳酸乳球菌中生产的β-毒素的衍生物。衍生物pM6-1,6-5和6-7的致死水平与天然毒素相类似。在氨基酸位置Cys292→Ala292中已经修饰了pM6-1,6-5，和6-7衍生物。
表2小鼠致死率测试在随后的实验中，用硫酸铵沉淀含有衍生物的上清液。以10×更小的体积在PBS中重悬浮含各个衍生物的沉积物。将各个衍生物腹膜内注射进小鼠。衍生物pM1-4,pM1-10,pM3-69和pM7-15在野生型毒素具致死作用的水平时都是非毒性的。它们仅在非常高浓度20-40微克/毫升时是毒性的。衍生物pM4-18和pM6-16在野生型毒素具致死性的水平上也是非毒性的。它们在更高的浓度30-50微克/毫升甚至是非毒性的。其余的3个衍生物pM2,pM3-3和pM4-3是轻微毒性的。(野生型毒素的LD50是0.15微克/小鼠)。也可参见表2。
在豚鼠中的皮肤坏死将300克的自家喂养的白变种豚鼠的两侧4×8厘米的面积脱毛。在动物的每侧4个位置皮内注射0.2毫升提取液。在24,48和72小时后检测动物，对注射位置的损伤进行评分。在注射位置明显的坏死(++++)，严重的红斑(+++)，红斑(+++)，变红(+)，没有反应(0)。pM1-4,1-10,3-3,4-3,6-16和7-15衍生物甚至在非常高的浓度下也没有皮肤坏死。
衍生物pM6-1,6-5和6-7在5微克/毫升的水平皮肤坏死。它们在0.5微克/毫升没有皮肤坏死。浓缩之后，pM3-69衍生物在6微克/毫升的剂量产生皮肤坏死，该剂量对应于比天然毒素的皮肤坏死低至少60倍。衍生物pM 4-18比天然毒素的皮肤坏死的潜力小15倍。通过分别测试浓度1微克/毫升和2微克/毫升还没有显示衍生物pM2具有任何皮肤坏死反应。所以pM2至少比天然毒素的毒性低20倍。
也可参见表3。
疫苗制备分别用弗氏不完全佐剂(50％)或Alhydrogen(20％)作佐剂制备抗原。
0 没有反应
+变红++ 红斑+++ 严重红斑++++ 在注射位置明显坏死CpCβC型产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素表3在猪中的皮肤坏死猪的免疫接种以约40微克/毫升的浓度制备衍生物3-69和加入佐剂到最后浓度20微克/毫升。以2星期的间歇肌内对猪注射2毫升。在第一次接种之前，第二次接种之前和第二次接种后2星期取血样。观察第一次接种后24小时对猪的副作用。没有观察到副作用。
实施例3用于检测从随机诱变的β-毒素基因得到的非毒性β-毒素衍生物的快速筛选测试BT细胞测试的过程将在含有5％的小牛血清的伊格尔氏培养基中的1.5×105细胞/毫升的胰蛋白酶消化的BT(牛陀螺状细胞)细胞的培养物转移到96孔的微滴平板，每孔100微升。在37℃和3％的CO2下温育平板24小时。在20℃,PBS,pH7.0在稀释平板中稀释待测试的β-毒素样品。谨慎地从细胞中滗弃培养基并在每个孔中加入100微升β-毒素稀释液。然后在37℃，和3％CO2下温育细胞30分钟。谨慎地滗弃样品并加入加热到37℃的含有5％小牛血清的新鲜伊格尔氏培养基。在如上所述的同样条件下温育细胞3天。然后从微滴平板中滗弃培养基并加入吉姆萨染色溶液5微升/孔。在10分钟后，滗弃染色剂，并用水洗涤平板3次，并允许保持至少20分钟以便干燥。
检测所有孔中多核细胞的存在和不均匀的单层。在特定的孔中缺乏这些信号表明在该孔中非毒性β-毒素衍生物的存在。在下面所述的半定量的ELISA测试中测试证明为非毒性的这些β-毒素衍生物的免疫原性。
半定量ELISA在蛋白质A柱上纯化兔中抗天然产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的高度特异的抗体并用约2微克/毫升的这些特异的抗体涂覆ELISA平板。以3倍的稀释度在平板中加入含有β-毒素衍生物的上清液。在温育1小时后，利用辣根过氧化物酶缀合的多克隆兔抗-C.p.β-毒素抗体检测。
那些比天然β-毒素在ELISA中的反应效价低不少于1000倍的β-毒素衍生物被视为所需的非毒性的和仍然是本发明的免疫原性β-毒素衍生物。
实施例4猪中的接种实验制备疫苗用乳酸乳球菌菌株pM1-4生产衍生物pM1-4。在发酵后，通过离心(100000×g，35分钟)除去细胞。然后在每克上清液中加入0.31克硫酸铵。将混合物置于4℃，沉淀3小时。在100000×g离心45分钟后，将沉淀以1/30的原始体积溶解并对PBS透析。通过与BSA标准相关的SDS-PAGE定量衍生物pM1-4的最后含量。最后用Diluvac Forte以1∶1的比例混合衍生物溶液。疫苗中pM1-4的最后浓度为80微克/毫升。
接种使用5个5星期大的猪。用2毫升在0天和21天肌内接种猪。
观察根据下面的范围在接种后开始的3小时的过程中记录动物总体症状0=没有症状1=轻度压抑，粗糙地包裹(少于1小时)2=压抑，颤抖(少于1小时)3=压抑，颤抖，躺下和进水有限(小于1小时)
4=呕吐，严重压抑(小于1小时)5=压抑超过1小时并不吃随后供给的食物血液取样和确定效价在第一次接种(0天)之前，在第二次接种(21天)之前和第二次接种后2星期(35天)取血样并通过竞争ELISA分析抗-β-毒素抗体。简要地说，在ELISA平板中涂覆抗天然β-毒素的单克隆抗体。允许血清的系列稀释液与固定浓度的β-毒素在独立的平板上反应。将含有抗体的血清和毒素的混合物转移到Mab涂覆的平板并确定剩余的天然β-毒素含量。相对于WHO抗毒素标准1959，以对未抑制的β-毒素有50％抑制计算出效价。
结果观察猪没有表现出任何由于接种引起的临床反应。参见表4。
血清学一个猪(编号52)对第一次接种应答。在第二次接种后所有四个猪血清转化，在ELISA中测量平均抗β-毒素效价为66i.u.。单个效价显示于表4。
表4在猪中的抗β-毒素抗体应答在ELISA中以i.u.测量猪中抗β-毒素抗体应答并评价试验中的非特异性毒性。
结论通过产生抑制β-毒素的抗β-毒素抗体所有猪对用遗传修饰的β-毒素的接种产生应答。
权利要求
1．在野生型β-毒素中不存在的，在它的氨基酸序列中携带突变的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的脱毒免疫原性衍生物或其免疫原片段。
2．根据权利要求1所述的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的衍生物或其免疫原片段，其特征是突变为替代突变。
3．根据权利要求1所述的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的衍生物或其免疫原片段，其特征为突变是插入和/或缺失。
4．根据权利要求1-3所述的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的衍生物或其免疫原片段，其特征是突变定位于β-毒素的中性和亲水部分之间的转换区中。
5．根据权利要求1-4的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的衍生物或其免疫原片段，其特征是突变定位于位置62,182,197或氨基酸编号80-103,145-147,281-291,295-299之间的区域之一或与肽前导甲硫氨酸相关的氨基酸位置292下游。
6．根据权利要求1-5的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的衍生物或其免疫原片段，其特征是突变定位于氨基酸编号80-82,95-97,101-103或287-291之间的区域之一。
7．含有突变的DNA片段的核苷酸序列，所述的突变的DNA片段编码权利要求1-6所述的脱毒的免疫原产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素或其免疫原片段。
8．含有权利要求7所述的核苷酸序列的产气荚膜梭状芽孢杆菌细菌。
9．基于革兰氏阳性细菌的表达系统，所述的革兰氏阳性细菌不是产气荚膜梭状芽孢杆菌，所述表达系统含有编码野生型产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的基因。
10．基于革兰氏阳性细菌的表达系统，所述的革兰氏阳性细菌不是产气荚膜梭状芽孢杆菌，其中所述的革兰氏阳性细菌含有权利要求7所述的核苷酸序列。
11．用于抵抗产气荚膜梭状芽孢杆菌感染的疫苗，其特征是它含有权利要求1-6所述的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的衍生物或其免疫原片段，和生理学可接受载体。
12．根据权利要求11所述的疫苗，其特征是它含有佐剂。
13．用于抵抗产气荚膜梭状芽孢杆菌感染的疫苗，其特征是它含有活的重组载体生物体，所述的载体生物体携带权利要求7所述的DNA片段。
14．用于抵抗产气荚膜梭状芽孢杆菌感染的疫苗，其特征是它含有活的减毒的产气荚膜梭状芽孢杆菌菌株，其中天然β-毒素基因被权利要求7所述的核苷酸序列替代。
15．根据权利要求11-14所述的疫苗，其特征是它另外含有来自其它病原体的免疫原。
16．根据权利要求15所述的疫苗，其特征是所述的来自其它病原体的免疫原选自含有大叶性肺炎放线杆菌，伪狂犬病病毒，猪流行性感冒病毒，猪细小病毒，可传播的胃肠炎病毒，轮状病毒，大肠杆菌，猪丹毒杆菌，出血败血性巴斯德氏菌，支气管炎博德特氏菌，沙门氏菌种类，猪肺炎支原体，副猪嗜血菌和类螺旋杆菌的细菌的组。
17．用于制备天然产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的方法，其特征是权利要求7所述的含有编码所述β-毒素的DNA片段的核苷酸序列在革兰氏阳性细菌中表达，所述的革兰氏阳性细菌不是梭状芽孢杆菌。
18．用于制备权利要求1-6所述的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的衍生物的方法，其特征是权利要求7所述的含有编码β-毒素的衍生物的DNA片段的核苷酸序列在革兰氏阳性细菌中表达。
19．根据权利要求17或18所述的方法，其特征是革兰氏阳性细菌选自乳球菌，乳杆菌，明串珠菌，片球菌，链球菌，肠球菌，葡萄球菌，芽孢杆菌，八叠球菌，瘤胃球菌或利斯特氏菌属的组。
20．制备用于抵抗产气荚膜梭状芽孢杆菌感染的疫苗的方法，其特征是所述的方法包括混合权利要求1-6所述的产气荚膜梭状芽孢杆菌β-毒素的衍生物和生理学可接受载体。
全文摘要
本发明涉及产气荚膜梭状芽孢杆菌β－毒素的脱毒的免疫原性衍生物或其免疫原片段,它具有的特征是它们携带在野生型β－毒素氨基酸序列中不存在的,β－毒素氨基酸序列的突变。本发明也涉及编码这样的β－毒素的基因以及表达这样的β－毒素的表达系统。另外,本发明涉及表达天然β－毒素的细菌表达系统。最后,本发明涉及基于产气荚膜梭状芽孢杆菌β－毒素的脱毒的免疫原性衍生物的疫苗,和用于制备这样的疫苗的方法。
文档编号C07K14/195GK1215729SQ9810318
公开日1999年5月5日 申请日期1998年6月19日 优先权日1997年6月20日
发明者R·P·A·M·塞格斯, N·R·瓦特非尔德, P·L·弗兰德森, J·M·韦尔斯 申请人:阿克佐诺贝尔公司