专利名称：酪酸梭菌的固态发酵方法
技术领域：
本发明涉及微生物技术领域，尤其是涉及一种固态发酵制备酪酸梭菌的方法。
背景技术：
酪酸梭菌又称酪酸梭状芽孢杆菌，酪酸杆菌，酪酸菌，丁酸梭状芽孢杆菌，丁酸梭菌，丁酸杆菌，丁酸菌，拉丁文Clostridium butyricum。本菌存在于土壤、动物和人体的肠道中，细菌学分类归属于梭菌属，为革兰氏阳性厌氧杆菌。菌体中常有圆形成或椭圆形芽胞，使菌体中部膨大呈梭形。该菌在37°C、PH7时为生长发育的最适条件，它能利用多种糖类，如葡萄糖、乳糖、麦芽糖、蔗糖和果糖等，并能利用淀粉。本菌的主要代谢产物为丁酸、乙酸。酪酸菌是调节人体肠道微生态平衡的有益菌，其在人体肠道内可体现五大生物特性1、促进肠道有益菌群(双歧杆菌，乳酸杆菌)的增殖和发育，抑制肠道内有害菌和腐败菌的生长、繁殖，纠正肠道菌群紊乱，减少肠毒素的发生。2、在肠道内能产生B族维生素、 维生素K、淀粉酶等物质，对人体具有保健作用。3、酪酸菌的主要代谢产物丁酸是肠道上皮组织细胞的再生和修复主要营养物质。4、酪酸菌是厌氧芽胞杆菌，稳定性好，在人体内不受胃酸、胆汁酸等影响，在体外室温下能保存三年以上。5、酪酸菌对多种抗生素有较强的耐受性，在临床上可与其并用。目前酪酸梭菌的菌剂产品主要通过液态发酵方式生产，发酵后通过固液分离获得菌体沉淀物，而后加辅料，通过低热干燥或冷冻干燥制成菌剂产品，而发酵过程中酪酸菌产生的各种生理活性成分，如有机酸、水解酶、维生素、天然抗菌物质和促生长因子均随分离的上清液体排放掉。这既浪费了发酵产生的有效宝贵资源，又增加了对排放废水治理的负担，浪费了资源。
发明内容
针对现有技术存在的上述问题，本申请人提供了一种酪酸梭菌的固态发酵方法。 本发明操作方法简单，成本低，所得到的酪酸梭菌质量高，有效成分无损失。本发明的技术方案如下
一种酪酸梭菌的固态发酵方法，具体步骤如下
(1)以麸皮、玉米粉、米糠为主料，添加营养物和无机盐，制备成复合培养基，装入发酵容器，对该复合培养基进行灭菌；
(2)向发酵容器中通入氮气，驱赶发酵环境中的氧气；同时将酪酸梭菌菌种与枯草芽孢杆菌菌种加入发酵容器中，与复合培养基充分搅拌均勻；
(3)在通氮气的条件下将发酵容器中的混合物装入不透气无毒复合包装袋，密封袋口， 在35、0°C环境中静置，使酪酸梭菌发酵；发酵完毕后在低于50°C下烘干，粉碎，过筛，即成酪酸梭菌菌剂产品。所述主料的组分及各组分的质量分数为麸皮38飞5%，玉米粉20 30%，米糠15 35%，这三者的含水量均为12 15%;所述营养物和无机盐的组分及各组分的质量为以主料的重量为基数，葡萄糖占主料的0. 2 1%，酵母膏占主料的0. 5^0. 7%，牛骨蛋白胨占主料的0. 15 0. 35%，硫胺占主料的0. 15 0. 25%，NaCl占主料的0. 15 0. 2%，CaCO3占主料的 0. 2 0. 4%, MgSO4 · 7H20 占主料的 0. θΓθ. 03%。所述营养物和无机盐的各组分先溶解在水中，然后再添加到主料中；所述水的用量为与主料中含水量加起来一共占复合培养基总质量的45飞5%。所述酪酸梭菌菌种的重量为复合培养基总重量的1(Γ15%，所述枯草芽孢杆菌菌种的重量为复合培养基总重量的 0.5 1.5%。所述步骤(1)中灭菌条件为12(T130°C下3(T60min加热灭菌。所述复合包装袋可以为复合塑料袋或铝箔袋。通过美兰厌氧度指示剂观察发酵环境中氧气含量，当所述美兰厌氧度指示剂由深蓝色逐渐变浅、变淡，接近无色，表明已达到无氧或微氧状态。发酵时间可以为一周，也可以留在袋内继续发酵，产品内在质量可进一步得到提高，由于形成芽孢的酪酸梭菌很稳定，封闭在袋内的酪酸梭菌湿态产品可以在常温下存放两年。
本发明有益的技术效果在于
本发明解决了酪酸梭菌液态发酵工艺的两大问题一是发酵液体经固液分离只取菌体沉淀物制成菌剂产品，而发酵产生的多种有效活性成分，包括有机酸、消化酶、维生素、天然抗菌物质和促生长因子等，因为它们可溶，却随废液外排，宝贵资源严重浪费；二是外排废液污染程度高，COD达到了 2779ang/L，NH3-N 达到了 643. 8mg/L,形成了一种高浓度的有机废水，为此需要加大环保治理力度，增加了企业的环保压力。本发明使这两个问题得到解决，既大大提高了酪酸梭菌产品的内在质量和实际应用效果，也可使酪酸梭菌产品的生产做到没有发酵废液外排，真正实现零排放清洁生产。本发明采用塑料袋(或铝箔袋)替代厌氧发酵罐，具有下列优点1、投资小，成本低；2、容量可大可小；3、容易处理达到厌氧或微氧条件；4、发酵产物可以干粉固态形式作产品，也可以湿态形式作为产品，后者可降低生产能耗；5、具有商品包装功能。本发明发酵中通过生物耗氧体枯草芽孢杆菌，可促进和稳定环境厌氧，保障酪酸梭菌顺利进行发酵。
具体实施例方式本实施例所用酪酸梭状芽孢杆菌的菌种源于江苏省微生物研究所，菌种编号 jsim-BCB 20040312。枯草芽孢杆菌的菌种源于江苏省微生物研究所，菌种编号jsim-1019。美兰厌氧度指示剂的制备方法为(1)取3ml浓度为0. 5%的美兰溶液，用蒸馏水稀释至IOOml ;(2)配制6ml浓度为0. lmol/L的氢氧化钠溶液，用蒸馏水稀释至IOOml ； (3) 取6g试剂级葡萄糖加蒸馏水稀释至IOOml ； (4)将上述三种溶液等体积混合即可得到美兰厌氧度指示剂。实施例1
(1)以麸皮38kg、玉米粉30 kg、米糠32 kg为主料，其含水量为均12%，即主料的水分质量为12kg ；添加溶于水中的营养物和无机盐(营养物和无机盐的组分为葡萄糖0. 2 kg，酵母膏 0.5 kg，牛骨蛋白胨 0.15 kg，硫胺 0.15 kg, NaCl 0. 15 kg, CaCO3 0.2 kg, MgSO4 ·7Η20 0.01 kg，以上组分溶解在61. Ilkg水中，与主料中水分加起来一共为73. Ilkg的水，其占复合培养基总质量(162. 47kg)的45%)，制备成复合培养基，装入发酵容器，对该复合培养基进行灭菌，灭菌条件为120°C下50min加热灭菌；
(2)向发酵容器中通入氮气，驱赶发酵环境中的氧气；同时将16.247kg (占复合培养基总质量的10%)的酪酸梭菌菌种与0. 81kg (占复合培养基总质量的0. 5%)的枯草芽孢杆菌菌种加入发酵容器中，与复合培养基充分搅拌均勻；
(3)在通氮气的条件下将发酵容器中的混合物装入不透气无毒复合塑料袋，密封袋口， 在35°C环境中静置一周，使酪酸梭菌发酵；发酵完毕后在45°C下烘干，粉碎，过筛，即成酪酸梭菌菌剂产品。实施例2
(1)以麸皮阳kg、玉米粉25kg、米糠20 kg为主料，其含水量为均15%，即主料的水分质量为15kg ；添加溶于水中的营养物和无机盐(营养物和无机盐的组分为葡萄糖1 kg，酵母膏 0.7 kg，牛骨蛋白胨0.35 kg %，硫胺0.25 kg,NaCl 0.2 kg, CaCO3 0.4 kg，MgSO4 ·7Η20 0. 03 kg,以上组分溶解在92. 47kg水中，与主料中水分加起来一共为107. 47kg的水，其占复合培养基总质量(195. 4kg)的55%)，制备成复合培养基，装入发酵容器，对该复合培养基进行灭菌，灭菌条件为130°C下30min加热灭菌；
(2)向发酵容器中通入氮气，驱赶发酵环境中的氧气；同时将四.31kg(占复合培养基总重量的15%)的酪酸梭菌菌种与2. 931kg (占复合培养基总重量的1. 5%)的枯草芽孢杆菌菌种加入发酵容器中，与复合培养基充分搅拌均勻；
(3)在通氮气的条件下将发酵容器中的混合物装入不透气无毒铝箔袋，密封袋口，在 40°C环境中静置一周，使酪酸梭菌发酵；发酵完毕后在45°C下烘干，粉碎，过筛，即成酪酸梭菌菌剂产品。检测与对比
实施例1和2所制备得到的发酵产品采用硫乙醇酸盐流体培养基发酵培养，然后按照中华人民共和国农业行业NY 527-2002光合细菌菌剂标准附录B有效活菌数的测定步骤 MPN 5管法进行计算，实施例1中发酵产品中酪酸梭菌活菌数和芽孢数为1. 3*109cfu/克， 实施例2中发酵产品中酪酸梭菌活菌数和芽孢数为2. I^lO9Cfu/克；一般液体发酵法生产的酪酸梭菌的含量为3. 6 6. 4*108cfu/ ml,《天津科技大学学报》2010年第二期《酪酸梭状芽孢杆菌发酵培养基的优化》报道4. l*108cfu/ml,《饲料工业》2004年第25卷第2期《一株饲用酪酸菌特性和培养条件的研究》报道8. 2*108cfu/ml,《饲料工业》2005年第沈卷第 10期《酪酸梭状芽孢杆菌培养条件的研究》报道6. 5*108cfu/ml，《饲料工业》2009年第4期 《益生菌酪酸菌93-7发酵培养基及培养条件的研究》报道8. 5*108cfu/ml。上述数据单位中 Iml可以约为lg。通过对比实施例及所提供的对比例，本固态发酵法的发酵活菌数和芽孢数提高了 2飞倍。
权利要求
1.一种酪酸梭菌的固态发酵方法，其特征在于具体步骤如下(1)以麸皮、玉米粉、米糠为主料，添加营养物和无机盐，制备成复合培养基，装入发酵容器，对该复合培养基进行灭菌；(2)向发酵容器中通入氮气，驱赶发酵环境中的氧气；同时将酪酸梭菌菌种与枯草芽孢杆菌菌种加入发酵容器中，与复合培养基充分搅拌均勻；(3)在通氮气的条件下将发酵容器中的混合物装入不透气无毒复合包装袋，密封袋口， 在35、0°C环境中静置，使酪酸梭菌发酵；发酵完毕后在低于50°C下烘干，粉碎，过筛，即成酪酸梭菌菌剂产品。
2.根据权利要求1所述的酪酸梭菌的固态发酵方法，其特征在于，所述主料的组分及各组分的质量分数为麸皮38 55%，玉米粉20 30%，米糠15 35%，这三者的含水量均为 12 15%;所述营养物和无机盐的组分及各组分的质量为以主料的重量为基数，葡萄糖占主料的0. 2 1%，酵母膏占主料的0. 5^0. 7%，牛骨蛋白胨占主料的0. 15^0. 35%，硫胺占主料的 0. 15 0. 25%, NaCl 占主料的 0. 15 0. 2%, CaCO3 占主料的 0. 2 0. 4%, MgSO4 · 7H20 占主料的 0.01 0.03%。
3.根据权利要求2所述的酪酸梭菌的固态发酵方法，其特征在于，所述营养物和无机盐的各组分先溶解在水中，然后再添加到主料中；所述水的用量为与主料中含水量加起来一共占复合培养基总质量的45飞5%。
4.根据权利要求1所述的酪酸梭菌的固态发酵方法，其特征在于，所述酪酸梭菌菌种的重量为复合培养基总重量的1(Γ15%，所述枯草芽孢杆菌菌种的重量为复合培养基总重量的 0. 5 1. 5%ο
5.根据权利要求1所述的酪酸梭菌的固态发酵方法，其特征在于，所述步骤(1)中灭菌条件为12(Tl30°C下3(T60min加热灭菌。
6.根据权利要求1所述的酪酸梭菌的固态发酵方法，其特征在于，所述复合包装袋可以为复合塑料袋或铝箔袋。
全文摘要
一种酪酸梭菌的固态发酵方法，具体步骤如下(1)以麸皮、玉米粉、米糠为主料，添加营养物和无机盐，制备成复合培养基，装入发酵容器，对该复合培养基进行灭菌；(2)向发酵容器中通入氮气，驱赶发酵环境中的氧气；同时将酪酸梭菌菌种与枯草芽孢杆菌菌种加入发酵容器中，与复合培养基充分搅拌均匀；(3)在通氮气的条件下将发酵容器中的混合物装入不透气无毒复合包装袋，密封袋口，在35~40℃环境中静置，使酪酸梭菌发酵；发酵完毕后在低于50℃下烘干，粉碎，过筛，即成酪酸梭菌菌剂产品。本发明操作方法简单，成本低，所得到的酪酸梭菌质量高，有效成分无损失。
文档编号C12N1/20GK102533597SQ20111043704
公开日2012年7月4日 申请日期2011年12月23日 优先权日2011年12月23日
发明者刘凤琴, 薛宏基, 邹益东 申请人:宜兴市天石饲料有限公司