专利名称：具有改变的持久性的梭状芽孢杆菌神经毒素的制作方法
技术领域：
本发明涉及梭状芽孢杆菌(Clostridal)神经毒素，如肉毒杆菌神经毒素，与相应 的野生型神经毒素相比，它们的蛋白质结构发明了改变。所述的蛋白质结构的差异导致了， 尤其是活性周期的改变，如活性或持久性的延长。
背景技术：
化学去神经(Chemodenervation)是指应用药物阻止神经刺激它的靶组织，如肌 肉、腺体或另一神经。例如，用酚、乙醇或肉毒毒素来实施化学去神经。化学去神经适用于 一块或两块大的肌肉或多块小肌肉局部痉挛的病人。它可用于减轻诸如肌肉痉挛、疼痛以 及反射亢进的症状。化学去神经药物能阻断神经肌接头处的神经肌肉的传递，导致受影响的骨骼肌的 麻痹或局部麻痹。术语“局部麻痹”在本申请中被定义为运动功能的部分丧失或运动功能 削弱的症状。这是通过抑制乙酰胆碱(ACh)的合成或释放发生突触前作用而完成或在乙酰 胆碱受体上发生突触后作用而完成。突触前作用的药物示例为肉毒毒素、河豚毒素和破伤 风毒素。术语“化学去神经”还包括所有直接或间接地受化学去神经药物诱导的作用，因此 还包括所述的化学去神经药物的上游、下游或长期作用。因此，也包括突触前以及突触后的 作用、组织作用和/或通过脊柱或传入神经元的间接作用。肉毒毒素，一种化学去神经药物，尽管是目前已知的最毒的化合物，在过去已 用于治疗大量的症状和疾病，其中的一些描述于如PCT/EP 2007/0057M中。另外，基 于A型肉毒毒素蛋白复合物的A型肉毒毒素分别以商标βο οχ (Allergan Inc.)和
Dysport (Ipsen Ltd.)可市售获得。基于纯度更高的毒素制剂并且包含A型肉毒毒素
的神经毒成分，但不含用于分离的复合蛋白的药物组合物可从德国麦氏大药厂(Mrez Pharmaceuticals GmBH)以商标Xeomin 市售获得。厌氧的革兰氏阳性菌肉毒杆菌(Clostridium botulinum)产生一种强效的多肽神 经毒素，肉毒毒素，其能在人和动物中引起神经性麻痹性疾病，称为肉毒中毒。肉毒杆菌的 孢子在土壤中被发现，并能在作坊式罐头工厂中不当灭菌和密封的罐头内生长，这也是许 多肉毒中毒事件的原因。肉毒毒素A(BoNT/A)是人类已知的最致命的天然生物药剂。小鼠 的肉毒毒素(纯化的神经毒素复合物)血清型A的半数致死剂量(LD5tl)约为50皮克。尽 管其有毒，但肉毒毒素复合物及纯化的神经毒素已经作为治疗药物应用于许多疾病中。肉毒毒素从裂解的梭状芽孢杆菌的培养物中释出，通常由具有肉毒毒素(神经毒 成分)毒性的蛋白和其它的细菌蛋白(无毒的“复合蛋白”或“檢状芽孢杆菌蛋白，，)结合 形成毒性复合物，也称为肉毒毒素复合物。该肉毒毒素复合物本质上处于亚稳定状态，因为 其稳定性似乎取决于多种因素，如盐浓度和/或PH值。该复合物的分子量约为300，000 约900，OOODaJP 300kDa 约900kDa。例如复合蛋白为各种血细胞凝集素。毒素复合物中的蛋白质它们本身是无毒的，但被认为能稳定神经毒成分并造成肉毒杆菌的口服中毒。肉 毒毒素有7种不同的抗原血清型，即肉毒毒素A、B、C1、D、E、F和G。在提及肉毒毒素血清型 A、B、Cl、D、E、F或G的任何地方，还包括已知的血清型的变种，如血清型Al、A2、A3、A4等。造成梭状芽孢杆菌毒素高毒件的组分为神经毒成分或蛋白(Mw ^ 150kD，精确的 分子量取决于血清型)。这几种不同的血清型在它们的氨基酸序列上存在差异，但都含有 一个类似的结构约50kDa的轻链(LC)和约IOOkDa的重链(HC)，其可通过一个或多个二 硫键相连(参见如 Simpson LL, Ann Rev Pharmacol Toxicol. 2004 ；44 :167-93)。最初形 成的肉毒毒素复合物的神经毒成分为一个单独的多肽链。以血清型A为例，多肽的蛋白水 解导致产生一种由轻链和重链组成的，以二硫键连接的双链多肽形式的活性多肽。在人体 中，重链介导突触前胆碱能神经末端的结合和毒素进入细胞内的内化作用。轻链被认为决 定着毒性效果，起着作为锌肽链内切酶和切开决定膜融合的特殊蛋白质(SNARE复合物)的 作用(参见 Montecucco C，Shiavo G.，RosettoO :The mechanism of action of tetanus and Botulinum neurotoxins. ArchToxicol. 1996 ； 18(Suppl.) :342-354)。本申请通篇所用的术语“肉毒毒素”是指不含任何其它梭状杆菌蛋白的神经毒成 分，也指“肉毒毒素复合物”。在本申请中，当不必或不需要区分毒素组合物和神经毒成分 时，使用术语“肉毒毒素”。“BoNT”或“NT”分别为肉毒神经毒素和神经毒素的通用缩写。本 申请文件中所述的肉毒毒素复合物的神经毒素亚基被称为“神经毒成分”或“无复合蛋白的 神经毒成分”。A型和B型肉毒毒素的神经毒成分的产品描述于如国际专利申请W000/74703 中。这几种血清型在它们的治疗效果的持续时间上存在差异通常，A型肉毒毒素的 药物如果注射到人体肌肉内，其活性周期为3 4个月。在一些个例中，该周期甚至可延 长到12个月以上。也有报道在汗腺的治疗过程中，其活性周期为27个月(Bushara K.， botulinum toxin andrhinorrhea,Otolaryngol. Head. Neck. Surg. ,1996 ； 114 (3) 507 and TheLaryngoscope 109 :13441346 :1999)。Cl型肉毒毒素的活性周期与A型肉毒毒素的活 性周期类似(Eleopra et al. , 1997 & 2002)。令人意外的是，在啮齿类动物(如小鼠)中 的作用周期远远短于在人体中的作用周期A型肉毒毒素约为1 2个月，B型肉毒毒素约 为 21 天，E 型肉毒毒素仅为 4 天(DePaiva et al.，1999，Juradinski et al. ,2001) Foran等人于2003年分析了大鼠小脑-神经元上的体外作用周期，发现A型肉毒 毒素抑制谷氨酸胞吐作用的半衰期为大于31天；Cl型肉毒毒素大于25天；B型肉毒毒素约 为10天；F型肉毒毒素约为2天；E型肉毒毒素仅为0. 8天。A型肉毒毒素在如治疗人体的肌张力障碍(如，颈斜、睑痉挛)中的活性周期为 3 4个月。之后，病人还必须注射含有肉毒毒素的药物。延长神经毒素的作用周期能为病 人带来极大的好处。如果这样，每年必须注射的次数以及梭状芽孢杆菌蛋白质的总量都会 降低。此外，这也会降低产生针对外源蛋白的抗体的风险。因此，提供持久性延长的肉毒毒 素将会是人们所希望的。然而，人们并不总是希望进行长期的麻痹。例如，在某些美容治疗中，有时仅需要 进行暂时的“微调(fine-adjustment)”。为达到降低持久性的目的，医师受现有技术方法 所限，只能减小体积或更换血清型。这些技术被证明无法得到令人满意的结果，并且要求在 动力学活力和不同神经毒素血清型的抗原性方面都具有渊博的知识。因此，具有持久性“内置(built-in) ”调节的神经毒素将是一个主要的改进。US 2003/0219462,EP1849801和WO 02/08268公开了在天然的神经毒素中添加亮
氨酸或络氨酸基序的改性肉毒杆菌毒素。这些改良想法基于观察到特定的亮氨酸或络氨酸基序能将特定亚型的神经毒成 分的轻链定位到靶细胞的内膜上。作者猜想这一机制能改变某些轻链的持久性。然而，到目 前为止，作者尚不能提供这一效果的任何证据，而且较新的实验表明整个猜想是不正确的。此外，即使在某些情况下，添加基序会导致膜定位，该方法仍不能用于修饰A型肉 毒杆菌毒素。因为天然的A型肉毒杆菌毒素的轻链已经定位于细胞内膜上，因此，对膜的额 外束缚并不能提供额外的效果。因此，本发明遵循着一条不同的途径。根据本申请，发现在神经毒素上添加另外的 第二轻链能导致活性周期的改变，其仍具备蛋白水解活性。通过所用的血清型的组合，可延 长周期，生产顾客定制的神经毒素。可以设想给医师提供一系列的血清型与持久性无关的 神经毒素，用于更多标准化的治疗。发明概述本发明涉及梭状芽孢杆菌神经毒素，在一个实施方案中，为活性(即持久性)增加 或延长的肉毒杆菌神经毒素。因此，本申请一方面涉及一种多肽，包括(a)梭状芽孢杆菌毒素的神经毒成分的HC结构域或其片段；和(b)梭状芽孢杆菌毒素的神经毒成分的第一 LC结构域或其片段；和(c)梭状芽孢杆菌毒素的神经毒成分的至少一个另外的LC结构域或其片段，其中 第一和至少一个另外的LC结构域可彼此相同或不同，其中，所述的第一和所述的至少一个 另外的LC结构域的每一个所述片段仍具有蛋白水解活性。在一个实施方案中，单元和/或结构域通过键、肽接头、化学接头、二硫键或其两 种或多种的组合进行连接。在一个实施方案中，所述的LC和/或HC结构域的氨基酸序列与血清型A、B、C、D、 E、F或G肉毒毒素的神经毒成分的氨基酸序列至少有50%的同一性。在一个另外的实施方案中，所述所述的LC和/或HC结构域的氨基酸序列同破伤 风毒素(破伤风痉挛毒素)的氨基酸序列至少有50%的同一性。在一个实施方案中，第一和/或第二个LC结构域和/或HC结构域包含至少一种 修饰。在一个实施方案中，该修饰为突变，在一个另外的实施方案中为缺失，在又一实施 方案中为插入，在又一实施方案中为添加或在又一实施方案中为氨基酸互换或在进一步的 实施方案中为其两种或多种的组合。在一个实施方案中，本发明涉及一种多肽，其中，对神经毒素的神经节苷脂结合域 和/或蛋白受体结合域进行修饰，从而与HC结构域衍生而来的野生型神经毒素相比，提高 了结合能力。在一个实施方案中，多肽选自下组LCBoNT/A-LCBoNT/A-HCBoNT/A、LCBoNT/ C-LCBoNT/A-HCBoNT/A、LCBoNT/B-LCBoNT/A-HCBoNT/A、LCBoNT/A-LCBoNT/C-HCBoNT/ C、LCBoNT/C-LCBoNT/C-HCBoNT/C、LCBoNT/B-LCBoNT/C-HCBoNT/C 禾口 LCTeNT-LCBoNT/ A-HCBoNT/A。
在又一实施方案中，该修饰为化学修饰，其中化学修饰可选自下组磷酸化、 聚乙二醇化、糖基化、磷酸化、硫酸化、甲基化、乙酰化、脂化、羟基化、酰胺化或在又一实 施方案中为其两种或多种的组合。在另一实施方案中，脂化可为豆蔻酰化、棕榈酰化 (plamitoylation)、异戊二烯化、连接葡萄糖基_磷脂酰肌醇或在进一步的实施方案中为 其两种或多种的组合。本发明还公开了上述任何一种多肽的特异性抗体。本发明还公开了编码上述任何一种多肽的氨基酸序列。此外，本发明还公开了含 有所述核酸或其片段的载体。本申请还公开了含有所述的核酸或所述载体的宿主细胞。本发明还公开了制备多肽的方法，包括下述步骤先培养上述提到的宿主细胞，制 备和纯化由所述的核酸或载体编码的多肽和，可选的，将所述多肽配制到药物组合物中。本发明还公开了含有所述多肽或由上述方法制备的多肽的组合物。本发明还公开 了所述组合物进一步包含一种药学上可接受的载体。在另一实施方案中，组合物进一步包 含PH缓冲液、赋形剂、冷冻保护剂、防腐剂、止痛剂、稳定剂或其任何组合。在一个实施方案 中，组合物以冻干物(lyophilisate)的形式提供。在一个另外的实施方案中，组合物以溶 液的形式提供。本发明还公开了所述组合物在药物治疗中的应用。本发明还公开了所述组合物在制备治疗药物中的应用。在一个实施方案中，所述的治疗包括治疗局部性肌张力障碍(focal dystonia), 痉挛或可通过抑制分泌进行治疗的疾病。本发明还公开了所述的组合物在美容治疗中的应用。在这些美容治疗中，特别是 对患有影响心理的疾病如皱纹或眉间的皱眉纹的哺乳动物治疗的效果非常好。发明详述本发明涉及一种多肽，包括(a)梭状芽孢杆菌毒素的神经毒成分的HC结构域或其片段；和(b)第一 LC结构域或其片段，和(c)至少一个另外的LC结构域或其片段，其中第一和第二个LC结构域可彼此相同 或不同。本发明特别涉及一种多肽，包括(a)梭状芽孢杆菌毒素的神经毒成分的HC结构域或其片段；和(b)梭状芽孢杆菌毒素的神经毒成分的第一 LC结构域或其片段；和(c)梭状芽孢杆菌毒素的神经毒成分的至少一个另外的LC结构域或其片段，其中 第一和至少一个另外的LC结构域可彼此相同或不同，其中，所述的第一和所述的至少一个 另外的LC结构域的每一个所述片段仍具有蛋白水解活性。令人意外的是，发现添加一条或多条(另外的)轻链(LC)至如上所定义的包含至 少一条重链(HC)和至少一条轻链(LC)的梭状芽孢杆菌神经毒素的多肽上，产生的多肽与 野生型毒素相比增加即延长了毒素活性的持久性。抛开理论的限制，可以假设轻链结合到细胞表面后，都进入细胞内，增加了细胞内 具蛋白质水解活性的蛋白质的浓度，从而使神经毒素的活性和持久性都得到了增加。
也即，如果需要一种本发明所述的长持久性的多肽，可以指导技术人员使用特定 的HC和LC结构域的组合，如具长持久性的来自于血清型的LC结构域。在其它实施方案中， 通过组合某些其它的LC结构域或片段，如具有较短持久性的来自于血清型的那些，可获得 较短的持久性。本申请所用的术语“持久性”描述了神经毒成分的作用周期。通常，它是指活性药 剂的活性表现出仅为它的起始活性的一半时的周期。因此，术语“持久性”可与术语“活性 半衰期”或术语“代谢稳定性半衰期”同义使用，其定义为由于代谢过程，仅半数起始蛋白具 有活性时的时间点，即直到蛋白发生代谢的半衰期。由于蛋白的半衰期与治疗效果的持续 时间有关，那么术语“持久性”还间接地包含神经毒成分对细胞功能造成的干扰或影响的持 续时间。本领域技术人员知晓测定持久性的各种试验。根据本发明的教导，可通过小鼠 奔跑试验(mouse running assay)测定持久性(KeIler JE.，2006，Neuroscience. 139(2) 629-37)。该试验使持久性同运动活性相关联。或者，可通过SNAP-25裂解试验测定持久性， 使持久性同蛋白质水解活性相关联。如果上述试验中的一种，优选为SNAP-25裂解试验，测 定出了持久性的增加，那就实现了持久性增加的效果。在本申请中，术语“增加的持久性”和“延长的持久性”是可互换的。为了测定本发明多肽的另外添加的LC链或LC链的片段对持久性的影响，将本发 明的多肽同缺乏所述的添加的(另一条)LC链的相应多肽进行比较。例如，这种多肽可为 本发明的另外的LC链已经缺失的多肽。可使用任何本领域技术人员公知的的持久性试验 来测定持久性。在一个实施方案中，可通过上述的或本发明实施例中例举的试验测定持久 性。在另一个实施方案中，设想延长短效神经毒素血清型的持久性。例如，E型血清型 可能通过增加长效血清型如A型血清型的轻链来延长持久性，因此可制备一种持久性同A 型肉毒毒素野生型类似的神经毒素。因为大多数神经毒素的抗原表位位于重链亚基中，因 此可以进行此种修饰以将神经毒素施用于对某种血清型产生免疫反应的病人。因此，结合 另一种血清型提供的优势，可维持之前的活性周期。如上所述，术语“HC-结构域”和“LC-结构域”分别指野生型或重组型的神经毒素 的神经毒成分的重链和轻链。此外，在一些实施方案中，HC和/或IC结构域来源于不同的 血清型和/或不同的毒素。该定义还包括轻链和重链的片段。HC和LC结构域还可又被进 一步分成亚结构域。本申请中的术语“另外的LC结构域或其片段”指一个或多个LC结构域，如第二结 构域。根据本发明的教导，本发明的多肽可包含其它另外的LC结构域或其片段。例如，本 发明的多肽可包含梭状芽孢杆菌毒素的神经毒成分的HC结构域和第一 LC结构域或其片段 和第二 LC结构域或其片段和第三LC结构域或其片段。在一个实施方案中，所述的第一和所述的另外的LC结构域的片段表现出野生型 LC的蛋白质水解活性。为了获得增加持久性的效果，另外的亮氨酸和酪氨酸基序(如US 2003/0219462、 EP1849801和WO 02/08268中公开的)是必要和希望的。因此，在一个实施方案中，另外的 轻链不含有任何所述的基序。
在一个实施方案中，修饰的神经毒素不含有包含7个氨基酸的亮氨酸基序，其中， 前五个氨基酸起始于亮氨酸基序的氨基末端，形成一个五重氨基酸(quintet of amino acids)，另外两个氨基酸形成一个双重氨基酸(dublet of amino acids)，其中，五重氨基 酸包含至少一个选自下组谷氨酸和天冬氨酸；双重氨基酸包含至少一个选自异亮氨酸和 亮氨酸的氨基酸。在一个另外的实施方案中，修饰的神经毒素不含有下述任一序列FEFYKLL、 EEKRAIL、EEKMAIL、SERDVLL、VDTQVLL、AEVQALL, SDKQNLL、SDRQNLI, ADTQVLM、SDKQTLL、 SQIKRLL、ADTQALL 和 NEQSPLL。本申请使用的术语“相同”是指具有相同的氨基酸序列，即氨基酸一致性为100% 的LC结构域。因此，例如本申请的第二个“相同的” LC结构域，是指它与第一个LC结构域 的氨基酸序列相同。另一方面，第二个“不同的” LC结构域是指它与第一个LC结构域的序 列一致性小于100%，也即如与第一个LC结构域的一致性为99. 95%或更低。“不同的LC结 构域”为不同血清型的LC结构域或氨基酸序列与第一个LC结构域不同的LC结构域，如替 换其中一个氨基酸。不同的LC结构域的一个另外的示例为N-或C-端截短(truncation) 或内部缺失的LC结构域。不同的LC结构域的又一个示例为化学修饰的LC结构域。因此， 同第一个LC结构域相比，“不同的LC结构域”可分别源自相同或不同的血清型。上述同样 适用于“第三个”或任何其它的LC结构域。在一个实施方案中，所有的HC和LC结构域的血清型来自于A型肉毒毒素，在另 外的实施方案中，第二个轻链为Cl型血清型。然而，本申请覆盖血清型A、B、Cl、D、E、F和 G的所有可能的组合，这对本领域技术人来说是显而易见的，本领域技术人员在公开的不同 血清型的持久性的基础上，可选择合适的组合。血清型的组合和所使用重链和轻链的数量 都不受本发明的限制。因此，在一个另外的实施方案中，设计了更长的融合蛋白，即含有三 个以上亚基的融合蛋白，如含有3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个或10个LC结构域的蛋 白质串联体(protein-concatemers)。例如A型肉毒杆菌(C. botulinum)神经毒素的HC和LC结构域包含不同的亚结构 域。例如，HC结构域包含3个亚结构域，即氨基末端的50kDa的易位亚结构域HCN，接下来 的25kDa的HCcm亚结构域和位于羧基末端的25kDa的HCee亚结构域。合起来，将HCN、HCcn 和HC。。结构域指定为HC结构域。表1列出了不同BoNT/A血清型和它的变种的各个结构域的各个氨基酸范围。表1 :A型肉毒毒素1 4亚型的氨基酸序列的数据库登录号和各个结构域的氨基
酸范围。
权利要求
1.一种多肽，包括(a)梭状芽孢杆菌毒素的神经毒成分的HC结构域或其片段；和(b)梭状芽孢杆菌毒素的神经毒成分的第一LC结构域或其片段；和(c)梭状芽孢杆菌毒素的神经毒成分的至少一个另外的LC结构域或其片段，其中第一 和至少一个另外的LC结构域可彼此相同或不同，其中，所述的第一和所述的至少一个另外 的LC结构域的各所述片段仍显示蛋白水解活性。
2.如权利要求1所述的多肽，其中，结构域通过键、肽接头、化学接头或其两种或多种 的组合进行连接。
3.如权利要求1或2所述的多肽，其中，所述的LC和/或HC结构域的氨基酸序列与血 清型A、B、C、D、E、F或G肉毒毒素的神经毒成分的氨基酸序列至少有50 %的同一性。
4.如前述权利要求任一项所述的多肽，其中，HC或至少一个另外的LC结构域或HC和 至少一个LC结构域包含至少一种修饰。
5.如权利要求4所述的多肽，其中的所述修饰为突变、缺失、插入、添加或氨基酸互换 或其两种或多种的组合。
6.如前述权利要求任一项所述的多肽，其中对神经毒素的神经节苷脂结合域和/或蛋 白受体结合域进行修饰，从而与HC结构域衍生而来的野生型神经毒素相比，提高了结合能 力。
7.如前述权利要求任一项所述的多肽，其选自下组LCBoNT/A-LCBoNT/A-HCBoNT/ A、LCBoNT/C-LCBoNT/A-HCBoNT/A、LCBoNT/B-LCBoNT/A-HCBoNT/A、LCBoNT/A-LCBoNT/ C-HCBoNT/C、 LCBoNT/C-LCBoNT/C-HCBoNT/C、 LCBoNT/B-LCBoNT/C-HCBoNT/C 禾口 LCTeNT-LCBoNT/A-HCBoNT/A。
8.权利要求1 7任一项所述的多肽的特异性抗体。
9.编码权利要求1 7任一项所述的多肽的核酸。
10.含有权利要求9所述的核酸或其片段的载体。
11.含有权利要求9所述的核酸或权利要求10所述的载体的宿主细胞。
12.制备多肽的方法，该方法包括下述步骤培养权利要求11所述的宿主细胞、制备和 纯化由所述的核酸或载体编码的多肽以及，可选的，将所述多肽配制到药物组合物中。
13.包含权利要求1 6任一项所述的多肽或由权利要求12所述的方法制备的多肽的 组合物。
14.如权利要求13所述的组合物在治疗中的应用。
15.权利要求1 7任一项所述的多肽或权利要求13所述的组合物在美容治疗中的应用。
全文摘要
本发明涉及一种多肽，包括(a)梭状芽孢杆菌毒素的神经毒成分的HC结构域或其片段；和(b)梭状芽孢杆菌毒素的神经毒成分的第一LC结构域或其片段；和(c)梭状芽孢杆菌毒素的神经毒成分的至少一个另外的LC结构域或其片段，其中第一和至少一个另外的LC结构域可彼此相同或不同，其中，所述的第一和所述的至少一个另外的LC结构域的各所述片段仍具有蛋白水解活性。
文档编号C07K14/33GK102131823SQ200980133468
公开日2011年7月20日 申请日期2009年8月28日 优先权日2008年8月29日
发明者朱尔根·弗瑞沃特 申请人:德国麦氏大药厂