梭菌毒素netb的制作方法

专利名称：梭菌毒素netb的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种新型毒素。本发明进一步涉及含有这种毒素的免疫原组合物以及 对动物，例如家鸡接种而使之不易于患上梭菌病的方法。
背景技术：
梭状芽孢杆菌属是由革兰氏阳性厌氧产芽胞细菌构成的。这些生物的天生栖息地 是人类和其它动物的环境和肠道。尽管已经识别了大约100种梭菌，但是仅仅少数已经被 认知为医疗和兽医重要性的病源物(或病原体)。尽管如此，这些物种还是与严重疾病有 关，包括肉毒梭菌中毒、破伤风、厌氧的蜂窝织炎、气性坏疽、菌血症、假膜性结肠炎和梭菌 肠胃炎。产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)是在经济上有价值的家畜禽中发现的 各种梭菌病的病源物。坏疽肠炎(NE)就是由产气荚膜梭菌引起的梭菌肠道疾病的一个实 例。坏疽肠炎导致在肠壁上产生坏疽病变，而导致家禽发病和死亡。这也是一种复杂的多 因子病，具有部分未知的流行病学和发病机理(Kaldhusdal，1999)。细菌，产气荚膜梭菌，通 常在家禽肠道中能够发现(Tschirdewahn et al.，1991)，然而，坏疽肠炎的出现是偶发性 的(Cowen et al.，1987)。尽管如此，被产气荚膜梭菌污染的进食还是间接表明在家鸡中坏 疽肠炎的发作(Kaldhusdal，1999)。研究也表明，健康家鸡在其肠道中所具有的产气荚膜梭 菌数量相对较低，同时细菌浓度的增长能够导致坏疽肠炎病症(Craven et al.，1999)。临床坏疽肠炎被认为在小肠中产气荚膜梭菌增殖到高数量并产生毁坏肠道的胞 外毒素时才发生。主要的毒素据信涉及的是α-毒素，但是其在疾病过程中的精确作用还 未完全知晓。α “毒素是一种分泌型的锌金属酶，其不但具有磷脂酶C活性，还具有神经磷 脂酶(或鞘磷脂酶)活性，是涉及到人类气性坏疽发病机理中的主要毒素(Awad，et al.， 1995 ；Songer, 1997) 0产气荚膜梭菌的所有五种毒素类型(A至E)承载和表达α毒素结构 基因，pic。迄今为止，还没有其它毒素被证实为坏疽肠炎中的关键毒性因子。

发明内容
本发明已经鉴别了一种新型梭菌毒素。本发明已经命名这种多肽为NetB。因此，本发明提供了一种基本纯化的或重组多肽，其中所述多肽含有i)按照SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3提供的氨基酸序列，ii)至少40%相同于SEQ ID NO :2和/或SEQ ID NO 3的氨基酸序列，或iii) i)或ii)的生物活性片段和/或抗原片段。在一个实施方式中，该多肽具有毒素活性。在另一实施方式中，该多肽与通过SEQ ID N0:2和/或SEQ IDNO :3编码的多肽相 比具有降低的毒素活性已经。在一个优选实施方式中，该多肽所含的氨基酸序列至少90%相同于SEQ ID NO 2或 SEQ ID NO :3ο在一个实施方式中，该多肽能够从梭状芽孢杆菌属的细菌中纯化。优选该多肽能 够从产气荚膜梭菌中进行纯化。在本发明的另一实施方式中，该多肽是类毒素。在还有的另一个优选实施方式中，该多肽是含有至少一种其它多肽序列的融合蛋 白。例如，至少一种其它多肽可以是增强本发明多肽稳定性的多肽，或者是辅助该融 合蛋白纯化的多肽，或者是增强本发明多肽的免疫性能的多肽。在还有的另一个优选实施方式中，本发明的多肽是合成多肽。本发明进一步提供了一种分离的和/或重组的多核苷酸，包含i)根据SEQ ID NO 1提供的核苷酸序列，ii)编码根据权利要求1至8任一项的多肽的核苷酸序列，iii)至少40%相同于SEQ ID NO 1的核苷酸序列，和/或iv)在严格条件下与i)至iii)任意之一杂交的序列或其反相互补序列。在一个实施方式中，分离的或重组的多核苷酸含有至少40%相同于SEQ ID NO 1 的核苷酸226至1194的核苷酸序列。本发明进一步提供了 一种含有本发明多核苷酸的载体。优选地，在该载体中的多核苷酸可操作地连接于启动子。在一个实施方式中，该载体是病毒载体或质粒载体。本发明进一步提供了一种宿主细胞，其含有本发明的多肽、本发明的多核苷酸和/ 或本发明的载体。本发明的宿主细胞可以是能够产生至少一种本发明多肽的任何细胞，并包括动 物、植物、细菌、真菌(包括酵母)和节肢动物的细胞。优选该宿主细胞是细菌。在一个实施方式中，细菌是大肠杆菌。在更优选的实施方式中，细菌是选自 CCEC22, CCEC31 和 CCEC59 的大肠杆菌。本发明进一步提供了用于生产根据本发明的多肽的方法，该方法包括对根据本发 明的宿主细胞或编码所述多肽的本发明载体在容许表达编码该多肽的多核苷酸的条件下 进行培养。优选地，该方法进一步包括分离所述多肽。本发明进一步提供了一种特异性地结合于本发明多肽的基本纯化的抗体，或其片 段。本发明进一步提供了一种含有本发明多肽、本发明多核苷酸、本发明载体、本发明 宿主细胞和/或本发明抗体的组合物。在一个实施方式中，该组合物是免疫原的组合物。在一个实施方式中，该免疫原的组合物进一步含有佐剂和/或药用载体。本发明进一步提供了含有抗原的疫苗，其中抗原含有根据本发明的多肽。在一个实施方式中，疫苗含有佐剂和/或药用载体。在一个实施方式中，该疫苗进一步含有一种或多种附加抗原。
本发明进一步提供了含有编码根据本发明的多肽的多核苷酸的DNA疫苗，其中一 旦向受试者给药，多肽就会表达而对多肽产生免疫应答。本发明进一步提供一种减毒细菌，其能够产生含有至少40%相同于SEQ ID NO 2 和/或SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多肽，其中该细菌与野生型细菌相比产生降低量的多 肽和/或与野生型细菌相比具有降低的毒素活性。在一个实施方式中，减毒细菌并不表达多肽。在另一个实施方式中，减毒细菌经过了进一步改性(或修饰)而表达异源多肽。该 异源多肽可以例如是生物活性多肽或抗原。生物活性多肽的实例包括细胞因子、生长因子 和酶。抗原可以例如来自细菌、真菌、寄生生物病原体(或病原物)或病毒性病原体(或病 原物)。优选地，减毒细菌属于梭状芽孢杆菌属。在最优选的实施方式中，细菌是产气荚膜 梭菌。本发明进一步提供了一种削弱表达含有至少40%相同于SEQID NO :2和/或SEQ ID NO 3的氨基酸序列的多肽的细菌毒性的方法，该方法包括突变多核苷酸序列而降低多 肽的表达和/或多肽的毒素活性，由此减毒细菌与未减毒细菌相比具有降低的毒素活性。本发明进一步提供了一种提高受试者体内免疫应答的方法，该方法包括向受试者 给予本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的组合物、本发明的疫苗、本 发明的宿主细胞和/或本发明的细菌。在一个实施方式中，宿主细胞或细菌是活的(或活体)。在另一实施方式中，该多肽、多核苷酸、组合物、载体、宿主细胞或细菌是在卵中 (或卵胚中，in ovo)递送的。本发明进一步提供了一种检测受试者是否已经暴露于表达含有至少40%相同于 SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多肽的病原体的方法，其中该方法包括 检测由该受试者获得的样品中存在或不存在这种多肽，其中这种多肽的存在是暴露于病原 体的指征(或指示)。 本发明进一步提供了 一种检测受试者是否已经暴露于表达含有至少40 %相同于 SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多肽的病原体的方法，其中该方法包括 检测由样品中特异性地结合于根据本发明多肽的抗体存在或不存在，其中这种抗体的存在 是暴露于病原体的指征(或指示)。本发明进一步提供了一种检测受试者是否已经暴露于表达含有至少40%相同于 SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO :3的核苷酸序列的多核苷酸的病原体的方法，其中该方法 包括检测由该受试者获得的样品中多核苷酸存在或不存在，其中这种多核苷酸的存在是暴 露于病原体的指征(或指示)。检测多核苷酸存在或不存在的任何合适技术都可以使用。例如，多核苷酸的存在 或不存在可以通过杂交，例如通过DNA印迹(或萨慎印迹，Southern blot)，或通过多核苷 酸的扩增，例如，通过PCR进行检测。在一个实施方式中，病原体来自梭状芽孢杆菌属。在一个优选实施方式中，病原体 是产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)。在本发明方法的一个实施方式中，受试者是禽类。
优选地，受试者是家禽。例如，受试者可以是家鸡、火鸡、野鸡、鹌鹑、鸭子、鸵鸟或 其它常见的以商业量饲养的家禽。在最优选的实施方式中，受试者是家鸡。本发明进一步提供了一种用于筛选调节本发明的多肽活性的激动剂或拮抗剂的 方法，该方法包括将本发明的多肽与候选化合物接触，并确定所述化合物是否增加或减少 本发明多肽的毒素活性。在一个实施方式中，该化合物是拮抗剂。优选该化合物是抗体。本发明进一步提供了一种测试样品毒素活性的方法，该方法包括(a)将疑似含有根据权利要求1至8任一项的多肽的样品分成至少第一和第二子 样品，(b)将所述第一子样品与根据权利要求1至8任一项的多肽的拮抗剂接触，和(c)检测第一和第二子样品是否具有毒素活性，其中在所述第一子样品中缺乏毒素活性和在所述第二样品中存在毒素活性是至 少40%相同于SEQ ID NO :2禾Π /或SEQ ID NO 3的多肽存在的指征(或指示)。在一个实施方式中，步骤(C)包括独立地用动物细胞在各种条件下培养所述第一 和第二子样品一段时间而足以使该多肽产生细胞病理效应，并检测细胞上是否存在或不存 在细胞病理效应。在一个优选实施方式中，拮抗剂是抗体。本发明进一步提供了一种含有根据本发明多肽的拮抗剂的食物和/或饮料。优选地，拮抗剂是根据本发明的抗体。本发明进一步提供了本发明的食物和/或饮料降低由表达含有至少40%相同于 SEQ ID Ν0:2和/或SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多肽的细菌对动物的感染和/或群集 (或殖民化，colonization)的用途。本发明进一步提供了含有编码根据本发明的多肽的外源性多核苷酸的非人基因 转移生物。优选地，非人基因转移生物是植物。本发明进一步提供了含有本发明多肽的食物和/或饮料。优选地，当非人基因转移生物和/或食物和/或饮料口服给予受试者时，该多肽提 高对细菌病原体的免疫应答。细菌病原体可以是梭状芽孢杆菌属，例如，产气荚膜梭菌。优 选地，受试者是禽类，例如，家鸡、火鸡或鸭子。正如本领域技术人员所理解的那样，本发明的非人基因转移生物和/或食物和/ 或饮料能够用于向受试者给予本发明的多肽，使得在受试者体内提高对该多肽的免疫应答。因此，在一个实施方式中，本发明提供了一种提高对本发明多肽的免疫应答的方 法，该方法包括向受试者口服给予本发明的非人基因转移生物和/或本发明的食物和/或 饮料。本发明进一步提供了一种提供对雌性禽类后代被动免疫的方法，该方法包括在所 述雌性禽类产下含有所述后代的卵之前向该雌性禽类给予本发明的多肽、本发明的多核苷 酸、本发明的载体、本发明的宿主细胞、本发明的组合物、本发明的疫苗、本发明的减毒细 菌、本发明的非人基因转移生物、和/或本发明的食物和/或饮料，由此为所述后代提供对 表达含有至少40%相同于SEQ ID NO :2和/或SEQ ID NO 3的氨基酸序列的多肽的细菌
9的被动免疫。本发明进一步提供了本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的 组合物、本发明的疫苗、本发明的宿主细胞、本发明的细菌、本发明的非人基因转移生物和/ 或本发明的食物和/或饮料在生产用于提高受试者体内免疫应答的医药中的用途。本发明进一步提供了本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的 组合物、本发明的疫苗、本发明的宿主细胞、本发明的细菌、本发明的非人基因转移生物和/ 或本发明的食物和/或饮料作为提高受试者体内免疫应答的医药的用途。这将是很明显的，本发明一方面的优选特征和特性适用于本发明的许多其它方在整个说明书中词语“包括”，或变体如“含有”或“包含”，应该理解为是指所陈述 的元件、整体或步骤的包含，或元件、整体或步骤的分组，并不排除任何其它元件、整体或步 骤，或元件、整体或步骤的分组。本发明此后将通过以下非限制性实施例的方式并参照附图而进行描述。


图1.来自产气荚膜梭菌的NetB和β -毒素的ClustalW对齐；“*”是指在该列中 残基或核苷酸在对齐中的所有序列中相同；“”是指已经观察到保守替换Λ ”是指观察 到半保守替换。图2. NElS-AnetB染色体区域的示意图。netB的突变通过采用含有在基因两侧 具有约2kb的同源DNA的插入性灭活netB基因的自毁质粒进行等位交换而构建并引入到 EHE-NE18 中。图3.在LMH细胞上产气荚膜梭菌EHE-NE18培养基上清液的细胞毒性测定。a. TPG 培养基介质(纯的)；b.产气荚膜梭菌EHE-NE18培养基上清液(1 16稀释)；c.产气荚 膜梭菌JIR325(菌株13-非坏疽肠炎菌株)培养基上清液(1 2稀释)；d.产气荚膜梭菌 NE18-Ml(plc突变体)培养基上清液(1 16稀释)。图4在LMH细胞上EHE-NE18培养基上清液netB阴性衍生物的细胞毒性测定。
a.EHE-NE18培养基上清液(1 16稀释)；b. NE18-缺失(或消除)的netB培养基上清液 (1 2稀释)；c. NE18-缺失的netBl+pJIR1457 (穿梭质粒)培养基上清液(1 2稀释)； d. NE18-缺失的netBl+pALK20 (netB互补质粒)培养基上清液(1 16稀释)；e. TPG培养 基介质(纯净的)；f.柱纯化的重组 NetB (Columnpurified recombinant NetB) (1 8 稀 释)。图5.用NetB处理的LMH细胞的乳酸脱氢酶细胞毒性测定。在上清液中释放的LDH 作为细胞溶解指示剂用Cyto-TodPromega)试剂盒进行测定并以细胞毒性百分数给出。每 次稀释按照一式三份进行而对每次稀释计算SEM。图6.对于netB存在的NE和非NE产气荚膜梭菌菌株的PCR筛选。a. NE菌株；
b.非NE菌株。图7.在各种产气荚膜梭菌菌株(NE和非-NE)中对于蛋白存在的蛋白印迹观测 (Western blot survey)。对于NetB表达的产气荚膜梭菌筛选的NE菌株和非NE菌株的免 疫印迹分析。产气荚膜梭菌菌株在TPG介质中生长直至达到由SDS-PAGE分离的0. 6和培养基上清液0D600nm。将经分离的蛋白转移至PDVF膜并用兔rNetB抗血清探测。Brackets 指示NE菌株和非NE产气荚膜梭菌菌株。图8用NetB接种的家鸡血清的蛋白印迹分析。Lane 1 分子量标记 (Invitrogen SeeBlue Plus2 预染色标准)；Lanes 2-14 接种的鸟 #1_#13 的血清。关键序列列表SEQ ID NO 编码产气荚膜梭菌NetB毒素的核苷酸序列。SEQ ID NO :2_产气荚膜梭菌NetB毒素成熟氨基酸序列。SEQ ID NO :3_包括信号肽序列的产气荚膜梭菌NetB毒素的氨基酸序列。SEQ ID NO :4_产气荚膜梭菌β -毒素的氨基酸序列。SEQ ID No :5至10-寡核苷酸引物。
具体实施例方式一般性技术和定义除非另外明确指出，本文中所使用的所有技术和科学术语都应采取本领域普通技 术人员所共同理解的相同意义(例如，按照微生物学，细胞培养学，分子遗传学、免疫学、免 疫计量化学，蛋白质化学，和生物化学领域)。除非另外指出，本发明中所使用的重组蛋白、细胞培养基、微生物学和免疫学技术 都是标准的方法，是本领域普通技术人员众所周知的方法。这种技术在文献源的整个文献 中进行了描述和解释，例如 J. Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley andSons(1984), J. Sambrook et al. , Molecular Cloning :A LaboratoryManual, Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989) , T. A. Brown (editor) , Essential Molecular Biology :A Practical Approach, Volumesl and 2, IRL Press (1991), D. M. Glover and B. D. Hames(editors), DNA Cloning :A Practical Approach, Volumes 1-4,IRL Press(1995 andl996),and F. M. Ausubel et al. ,(editors),Current Protocols inMolecular Biology, Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present), Ed Harlow and David Lane(editors) Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring HarbourLaboratory, (1988), 禾口 J.E.Coligan et al. , (editors)Current Protocolsin Immunology, John Wiley & Sons (including all updates untilpresent)，并)其结合于本文中作为参考。正如本文中所使用的，术语“受试者”是指动物，例如鸟类或哺乳动物。在一个优选 实施方式中，该受试者是禽类，例如家鸡。在另一个实施方式中，该受试者是人。其它优选 的实施方式包括宠物(或同伴性动物，companion animals)如猫和狗，以及家畜如马、牛、 绵羊和山羊。如本文中所使用的，术语“禽类”是指分类学分类为鸟类的生物的任何种、亚种 或品种，诸如但不限于家鸡、火鸡、鸭、鹅、鹌鹑、野鸡、鹦鹉、雀、鹰、乌鸦和包括鸵鸟、鸸鹋 和鹤鸵在内的平胸鸟。该术语包括各种已知的原鸡(或红原鸡，Gallus galIus)的品 系(strain)，或家鸡，(例如，白来航(White Leghorn)、棕色来航鸡(Brown Leghorn)、 横斑芦花鸡(Barred-Rock)、苏塞克斯鸡(Sussex)、新罕布什尔鸡(New Hampshire)、 罗德岛红鸡(RhodeIsland)、澳洲黑鸡(Australorp)、考尼什鸡(Cornish)、米诺卡
11鸡(Minorca)、Amrox、加利福尼亚灰鸡(California Gray)、意大利鹧鸪色鸡(Italian Partidge-co 1 ored))、以及火鸡、野鸡、鹌鹑、鸭、鸵鸟和其它以商业规模饲养的家禽的品 系。如本文中所使用的，“毒素活性”是指多肽或肽(例如，NetB毒素)杀死动物细胞、 或导致动物细胞中的细胞病理效应的能力。在某些情况下，对于多肽与NetB毒素相比具 有降低的毒素活性或许是合乎需要的。毒素活性的降低优选至少50、60、70、80、90、95或 99%。毒素活性方面的降低可以例如作为细胞病理效应的降低而进行测定。如本文中所使用的，术语“细胞病理效应”或“CPE”描述了细胞结构中由于细胞毒 素的活性(即，病例效应)而产生的变化。常见的细胞病理效应包括细胞破坏、细胞圆形 化、合胞体(即，融合的大细胞)形成、细胞空泡化形成、和内含体的形成。CPE产生于毒素 在细胞上的作用，而负面地影响细胞实施其保持存活体的所需功能的能力。在体外细胞培 养系统中，当细胞与含有毒素的样品接触后，作为部分融合性单层，显示非融合性的区域时 CPE是显而易见的。细胞病理效应易于被本领域技术人员辨别和区分。如本文中所使用的，术语“类毒素”是指任何至少部分失活的毒素，但并非意指以 任何方式限制产生类毒素的毒素失活的具体方式。这种失活技术包括(i)改性(或修饰) 完整毒素的化学方法，例如甲醛或戊二醛处理；(ii)物理方法如加热；(iii)改变毒性的酶 方法，如将毒素切割成片段的蛋白酶；(iv)重组方法，如移除或改变毒素酶区域但保留一 个或多个抗原决定基(或抗原决定部位)的毒素基因的遗传工程化。如本文中所使用的，有关细菌的术语“野生型”是指天然存在的细菌，其产生含有 至少40%相同，更优选至少90%相同于具有毒素活性的SEQ ID NO :2或SEQ ID NO 3的氨 基酸序列的多肽。如本文中所使用的，术语“处理” “治疗”或“处治”包括给予治疗有效剂量的本发 明的多肽、多核苷酸、载体、宿主细胞、组合物、疫苗和/或减毒细菌而足以降低或消除由表 达具有毒素活性的多肽的细菌感染所导致的疾病的至少一种症状。术语“预防”是指保护或许被暴露于细菌的受试者免于发展由于细菌感染和/或 群集(或殖民化，colonization)而导致的至少一种症状，或降低被暴露于细菌的受试者体 内感染和/或群集症状的严重度。多肽/肽术语“多肽”和“蛋白” 一般可以互换使用，是指可以或不可以通过添加非氨基酸 基团改性的单多肽链。应该理解到，这种多肽链可以与其它多肽或蛋白或其它分子如辅助 因子相关。如本文中所使用的，术语“蛋白”和“多肽”包括本文中描述多肽的变体、突变体、 生物活性片段、改性体(或修饰物)、类似物和/或衍生物。对于“基本纯化的多肽”或“分离的多肽”，我们意指一般从脂质、核酸、其它肽、和 其它与其天然状态有关的污染分子中分离出来的多肽。优选地，基本纯化的多肽至少60% 游离出，更优选至少75%游离出，而更加优选至少90%游离出与之天然相关的其他组分。在多肽的上下文中的术语“重组”是指当由细胞、或在无细胞表达系统中，以变化 的量或以变化的速率产生时的多肽。在一个实施方式中，该细胞是并不会天然产生多肽的 细胞。然而，该细胞可以是含有导致该多肽的产生量改变，优选提高的非内源性基因的细 胞。本发明的重组多肽包括还未从转录(重组)细胞、或产生该蛋白的无细胞表达系统的
12其它组分中分离出的多肽，以及在随后从至少一些其它组分中纯化出的这种细胞或无细胞 系统中产生的多肽。多肽的识别％通过GAP (Needleman and Wunsch, 1970)分析(GCG程序)采用间隔 生成罚分=5、和空格延伸罚分=0. 3进行测定。在长度上查询序列为至少15个氨基酸， 而GAP分析在至少15个氨基酸的区域内比对两个序列。更优选地，查询序列在长度上为至 少50个氨基酸，而GAP分析在至少50个氨基酸的区域内比对两个序列。更优选地，查询序 列在长度上为至少100个氨基酸，而GAP分析在至少100个氨基酸的区域内比对两个序列。 更加优选地，查询序列在长度上为至少250个氨基酸，而GAP分析在至少250个氨基酸的区 域内比对两个序列。更加优选地，在其整个长度内比对这两个序列。关于定义的多肽，应该理解到，比以上提供的识别％图更高的那些多肽将会涵盖 优选的实施方式。因此，根据最低的识别％图，只要适用，优选该多肽含有的氨基酸序列为 至少40 %，更优选至少45 %，更优选至少50 %，更优选至少60 %，更优选至少65 %，更优 选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少76 %，更优选至少80 %，更优选至少85 %，更优 选至少90 %，更优选至少91%，更优选至少92 %，更优选至少93 %，更优选至少94 %，更优 选至少95 %，更优选至少96 %，更优选至少97 %，更优选至少98 %，更优选至少99 %，更优 选至少99. 1 %，更优选至少99. 2 %，更优选至少99. 3 %，更优选至少99. 4 %，更优选至少 99.5%,更优选至少99. 6%，更优选至少99. 7%，更优选至少99. 8%，而甚至更优选至少 99. 9%相同于相关指定的SEQ ID NO。本发明多肽的氨基酸序列突变能够通过向本发明的核酸中引入合适的核苷酸而 变成本发明的核酸、或通过所需多肽的体外合成而进行制备。这种突变例如包括，该氨基酸 序列中的残基的缺失(或删除)、插入或替换。缺失(或删除)、插入或替换的组合能够使 之达到最终的构建，条件是，最终的肽产品具有所需要的特性。突变(经改变的)多肽能够采用本领域已知的任何合适技术进行制备。例如，本 发明的多核苷酸能够进行体外诱发突变。这种体外诱变技术包括将多核苷酸亚克隆到合适 载体中，将载体变换成“增变”菌株，如大肠杆菌XL-I红(Stratagene)并繁殖所转化细菌 达到合适的繁殖代数。在另一实例中，本发明的多核苷酸进行按照Harayama(1998)广泛描 述的DNA改组技术。这些DNA改组技术可以包括与本发明的那些(多肽)相关的毒素编码 基因，如来自细菌而不是产气荚膜梭菌的那些。衍生于突变的/经改变的DNA的产品采用 本文中描述的技术能够易于被筛选而确定它们是否具有毒素活性。在设计氨基酸序列的突变体中，突变位点的定位和突变的性质将取决于待修饰的 特性。突变位点能够进行个别或连续修饰，例如，通过(1)首先用保守氨基酸选项进行替换 而后用更激进选项替换，这要取决于所实现的效果，(2)删除(或缺失)靶残基，或(3)在 邻近于定位位点插入其他残基。氨基酸序列删除(或缺失)一般在约1至15个残基，更优选约1至10个残基而 典型地约1至5个毗邻残基的范围内。替换突变体在移除的多肽分子中具有至少一个氨基酸残基和在其位置处插入不 同的残基。对于替换突变最感兴趣的位点包括验证为活性位点的位点。其它感兴趣的位点 是其中由各种菌株或物种获得的特定残基相同的位点。这些位置对于生物活性而言或许是 很重要的。这些位点，尤其是落入至少三个其它同等保守位点的序列中的那些位点，优选以相对保守的方式进行替换。这种保守替换如下表1中“典型替换”标题下所示。表1-典型替换 本发明的多肽的生物活性片段也包含在本发明范围内。如本文中所使用的，“生物 活性片段”是本发明多肽的一部分，其保持了全长多肽的指定活性。生物活性片段能够是它 们保持所指定活性的长度的任何长度。优选地，生物活性片段保持全长蛋白的至少10%的 活性。正如熟练的收阅人(addressee)所知，验证多肽的生物活性片段的技术在本领域内 是已知的。例如，本发明多肽的片段可以用合适的测定(或分析)法，例如通过确定该片段 是否能够诱导细胞中的细胞病理效应，进行测试而确定该片段是否具有毒素活性。在一个 实施方式中，生物活性片段在长度上为至少100个氨基酸，更优选在长度上为至少110个氨 基酸，更优选在长度上为至少120个氨基酸，更优选在长度上为至少130个氨基酸，更优选 在长度上为至少140个氨基酸，更优选在长度上为至少150个氨基酸，更优选在长度上为至 少175个氨基酸，或更优选在长度上为至少200或更多个氨基酸。术语“抗原”和“抗原的”在本领域内很好理解，是指通过免疫系统的组分特异性 识别的大分子的部分，例如，抗体或T-细胞抗原受体。术语“抗原”是指肽、多肽或其它在 宿主中能够被诱导对其产生免疫应答的其它大分子。因此，本发明包括本发明多肽的抗原 片段。优选地，抗原片段能够提高对细菌病原体例如来自梭状芽孢杆菌属包括但不限于产 气荚膜梭菌的细菌的免疫应答。在一个实施方式中，抗原是本发明多肽的抗原决定基(或 部位)。在一个实施方式中，抗原片段在长度上是6个氨基酸，更优选在长度上是7个氨基 酸，更优选在长度上是8个氨基酸，更优选在长度上是9个氨基酸，更优选在长度上是10个 氨基酸。可替代地，抗原片段在长度上为至少20、30、40、50、60、70、80、90、100或更多个氨 基酸。在一个实施方式中，当向受试者给药时抗原能够诱发对含有按照SEQID N0:2和/或 SEQ ID NO :3提供的氨基酸序列的多肽的免疫应答。而且，如果需要，非天然氨基酸或化学合成氨基酸类似物能够作为替换物到或 插入物而引入本发明的多肽中。这种氨基酸包括但不限于，常见氨基酸的D-异构体、2， 4- 二氨基丁酸、α -氨基异丁酸、4-氨基丁酸、2-氨基丁酸、6-氨基己酸、2-氨基异丁酸， 3_氨基丙酸、鸟氨酸、正亮氨酸、正缬氨酸、羟基脯氨酸、肌氨酸、瓜氨酸、高瓜氨酸、磺基 丙氨酸、叔丁基甘氨酸(t-butylglycine)、叔丁基丙氨酸(t-butylalanine)、苯基甘氨酸 (phenylglycine)、环己基丙氨酸(cyclohexylalanine)、β _丙氨酸、氟-氨基酸、设计的 (designer)氨基酸如β _甲基氨基酸、C α -甲基氨基酸、N α -甲基氨基酸和一般的氨基酸 类似物。本发明的多肽，在合成期间或之后，例如通过生物素化、苯甲酰化、糖基化、乙酰 化、磷酸化、酰胺化、由已知的保护基/阻断基衍生化、蛋白水解裂解、连接于抗体分子或其 它细胞配体等进行差异化改性(或修饰)，也都包含在本发明的范围内。这些改性(或修 饰)可以用于提高本发明多肽的稳定性和/或生物活性。本发明的多肽能够以各种方式进行生产，包括天然多肽的生产和回收，重组多肽 的生产和回收、以及多肽的化学合成。在一个实施方式中，本发明分离的多肽是通过在有效
15生产多肽的条件下培养能够表达该多肽的细胞、并回收多肽而进行生产的。用以培养的优 选细胞是本发明的宿主细胞。有效的培养条件包括但不限于，有效的介质、生物反应器、温 度、PH和容许多肽生产的氧条件。有效介质是指其中细胞被培养而生产本发明多肽的任何 介质。这种介质典型地包括具有可吸收碳、氮和磷酸盐(酯)源的含水介质，和合适的盐、 矿物质、金属和其它营养成分，如维生素。本发明的细胞能够在传统的发酵生物反应器、摇 瓶、试管、微孔板盘和培养皿中进行培养。培养能够在温度、PH和适用于重组蛋白的氧含量 条件下实施。这些培养条件都在本领域普通技术人员的专门知识的范畴之内。抗体如本发明中所使用的，术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、双特异性 抗体、双抗体(diabodies)、三抗体(triabodies)、异源偶联抗体(hetreoconjugate antibodies)、包括完整分子及其片段的嵌合抗体，例如能够结合抗原决定基(或部位)决 定子的Fab、F(ab' )2和Fv，以及其它的类抗体分子。抗体片段保持了与其抗原或受体选择性结合的一些能力，而定义如下(l)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，能够通过用酶木瓜蛋白酶消 化整个抗体而产生完整轻链和一个重链的部分而进行生产；(2)Fab'，抗体分子的片段，能够通过用胃蛋白酶处理整个抗体接着还原而产生 完整轻链和重链的部分而获得；每分子抗体能够获得两个Fab'片段；(3) (Fab' ) 2，能够通过用酶胃蛋白酶处理整个抗体但随后并不还原而获得的抗 体片段；F (ab) 2是通过两个二硫键固定到一起的两个Fab'片段的二聚体；(4) Fv，定义为含有表达为双链的轻链可变区域和重链可变区域的基因工程片段； 和(5)单链抗体(“SCA”)，定义为含有轻链可变区域、重链可变区域、由合适的多肽 连接子连接成为基因融合单链分子的基因工程分子。制备这些片段的方法在本领域内是已知的。(参见，例如，Harlow and Lane, Antibodies :A Laboratory Manual,Cold SpringHarbor Laboratory, New York(1988),结 合于此作为参考)。(6)单结构域抗体，典型地为无轻链的可变重结构域。多克隆抗体本发明的抗体可以是多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法对于本领域技术人员 是已知的。多克隆抗体能够在哺乳动物或禽类体内，例如通过一次或多次注射表达该多 肽的细胞以及如果需要还有佐剂而进行提高。典型地，细胞和/或佐剂在哺乳动物或禽类 体内通过多次皮下或腹膜内注射而进行注射。可以采用的佐剂实例包括弗氏完全佐剂和 MPL-TDM佐剂(单磷酰类脂A，人工合成的海藻糖二霉菌酸酯)。免疫方案可以通过本领域 技术人员进行选择而无须采取过分(或不当)实验。单克隆抗体可替代地，由本发明方法生产的抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可以采用杂 交瘤方法进行制备，例如，文献Kohler andMilstein, (1975)描述的那些方法。在杂交瘤方 法中，鼠、仓鼠或其它合适的宿主动物典型地采用表达衍生于基因转移哺乳动物的第一物 种的多肽的细胞进行免疫而诱发产生或能够产生将会特异性地结合于第一物种多肽的抗体的淋巴细胞。一般而言，如果需要人源细胞，则要么使用周围血液淋巴细胞(“PBL”)，或者如 果需要非人哺乳动物源，则使用脾细胞或淋巴结细胞。然后采用合适的融合剂如聚乙二 醇而使淋巴细胞与永生化细胞系融合而形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibody Principles and Practice, Academic Press, (1986)pp. 59—103)。永生化细胞系通常由哺 乳动物细胞，尤其是啮齿动物、牛和人源的骨髓瘤细胞转化。通常采用大鼠或小鼠骨髓瘤细 胞系。杂交瘤细胞可以在优选含有一种或多种抑制不融合的永生化细胞生长或存活的物质 的合适培养介质中进行培养。例如，如果亲本细胞缺乏酶次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT 或HPRT)，则杂交瘤的培养介质典型地将含有次黄嘌呤、氨基蝶呤和胸腺嘧啶核苷(“HAT介 质”)，该物质能够阻止HGPRT-缺乏细胞的生长。优选的永生化细胞系是通过所选的产生抗体的细胞有效融合、维持抗体稳定的 高水平表达、而对介质如HAT介质敏感的那些。更优选的永生化细胞系是鼠科骨髓瘤细 胞系，其能够例如从 SalkInstitute Cell Distribution Center, San Diego, Calif.和 American TypeCulture Collection,Manassas,Va.获得。人骨髓瘤和鼠-人杂交骨髓瘤细 胞系对于人单克隆抗体的生产也进行了描述(Kozbor, 1985 ；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques andApp1ications, Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987 pp.51-63)。其中进行杂交瘤细胞培养的培养介质然后能够针对第一物种多肽的单克隆抗体 的存在进行分析(或测定)。优选地，通过杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性由免 疫沉淀法或通过体外结合测定(或分析)，如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定 (或分析)(ELISA)来确定。这些技术和分析(或测定)在本领域内是已知的。例如，单克 隆抗体的结合亲和力能够通过芒森和波拉德(Munson and Pollard, (1980))的斯卡查德分 析来确定。在识别所需的杂交瘤细胞之后，该克隆通过限制稀释步骤就可以进行亚克隆而 通过标准方法进行生长。为此目的的合适培养介质，例如，包括Dulbecco，s Modified Eagle' s Medium和RPMI-1640介质。可替代地，杂交瘤细胞可以在哺乳动物体内作为腹 水进行体内生长。通过亚克隆分泌的单克隆抗体可以从培养介质或腹水流体中通过传统的免疫球 蛋白纯化技术如例如蛋白A-琼脂糖凝胶(protein A-S印harose)、羟基磷灰石色谱、凝胶 电泳、透析、或亲合色谱进行分离或纯化。单克隆抗体也可以通过重组DNA方法，如描述于美国专利US4，816，567中的那些 方法制备。编码本发明的单克隆抗体的DNA能够易于采用传统方法(例如，通过使用能够 特异性结合于编码鼠科抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)进行分离和排序(或定 序)。本发明的杂交瘤细胞能够作为这种DNA的优选来源。一旦分离，这种DNA就可以被置 入表达载体，然后表达载体被转染到宿主细胞如猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、或 其它不产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞中，而在重组宿主细胞中获得合成的单克隆抗体。DNA 也可以例如通过用编码序列替换人重链和轻链恒定结构域而代替同源鼠科序列(美国专 利US 4，816，567)或通过共价结合于免疫球蛋白编码序列、非免疫球蛋白多肽的所有或部 分编码序列而进行改性(或修饰)。这种非免疫球蛋白多肽能够替换本发明抗体的恒定结构域，或者能够替换本发明抗体的一个抗原结合位点的可变结构域而产生嵌合二价抗体。抗体可以是单价抗体。制备单价抗体的方法在本领域内是众所周知的。例如，方 法之一涉及免疫球蛋白轻链和经修饰(或改性)重链的重组表达。重链一般在Fc区域的 任何点发生短截以便防止重链交联。可替代地，相关的半胱氨酸残基用另一氨基酸残基替 换或缺失(或删除)而防止交联。体外方法也适用于制备单价抗体。产生其片段，尤其是Fab片段的抗体的消化，能 够采用本领域已知的常规技术来完成。抗体也可以是采用已知的选择和/或本领域已知的突变形成方法成熟的亲合性。 优选的亲合力成熟的抗体具有的亲合力比成熟抗体制备所用的起始抗体高5倍、更优选10 倍。甚至更优选20倍或30倍。双特异件抗体双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的单克隆抗体。例如，结合 特异性之一可以是对本发明的多肽，另一结合特异性是对于任何其它抗原，而优选是对于 细胞表面蛋白或受体或受体亚单元的结合特异性。用于制备双特异性抗体的方法在本领域也是已知的。传统上，双特异性抗体的 重组生产基于两个免疫球蛋白重链/轻链对的共表达，其中两个重链具有不同的特异 性(Milstein and Cuello，1983)。因为免疫球蛋白重链和轻链的随机搭配，这些杂交瘤 (quadromas)产生10个不同抗体分子的潜在混合物，其中仅仅一个具有正确的双特异性结 构。该正确分子的纯化通常通过亲合色谱步骤完成。类似的方法公开于W093/08829和文 献 Traunecker (1991)中。双特异性抗体能够作为全长抗体或抗体片段(例如，F(ab' )2双特异性抗体)来 制备。由抗体片段产生双特异性抗体的技术在文献中已经进行了描述。例如，双特异性抗 体能够采用化学键连来进行制备。各种直接从重组细胞培养基中制备和分离双特异性抗体 片段的技术也已经进行了描述。Hollinger et al. (1993)提供了一种用于制备双特异性抗体片段的可替代机制。 该片段含有通过太短而不容许在同一链上的两域之间配对的连接子连接到轻链可变结构 域的重链可变结构域(Vh)。因此，一个片段的Vh结构域和八结构域被迫与另一片段的 互补\结构和Vh结构域域配对，由此而形成两个抗原-结合位点。通过使用单链Fv(sFv) 二聚体用于制备双特异性抗体片段的另一策略已经由文献Gruber et al. (1994)进行了报 道。具有多于两价的抗体也是可设想的。例如，三特异性抗体也能够制备，如Tutt et al. (1991)。异源 禺联抗体(HetreoconiURate Antibodies)异源偶联抗体也落入本发明的范围内。异源偶联抗体由两个共价连接的抗体构 成。这种抗体，例如，有人提出将免疫系统细胞靶向不希望的(或多余)细胞(美国专利 US 4，676，980)，而用于治疗 HIV 感染(W0 91/00360 ；WO 92/200373 ；EP 03089)。可以设 想，这些抗体可以采用合成蛋白化学中已知的方法，包括那些涉及交联剂的方法而进行体 外制备。例如，免疫毒素可以采用二硫化物交换反应或通过形成硫醚碱而进行构建。为 此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇盐(iminothiolate)和4-巯基丁酰亚氨甲酯
18(methyl-4-mercaptobutyrimidate)以及例如在美国专利US4, 676，980中公开的那些试 剂。多核苷酸对于“分离的多核苷酸”，我们意指一般从与其有关的或在其天然状态与之连接的 多核苷酸序列中分离出来的多核苷酸。优选地，经分离的多核苷酸至少60%游离出，更优选 至少75%游离出，而更优选至少90%游离出天然与之相关的其它组分。而且，术语“多核苷 酸”在本文中可以与术语“核酸分子”、“基因”和“mRNA”互换使用。在多核苷酸的上下文中术语“重组”是指当与其天然状态相比，在细胞中，或在无 细胞表达系统中，以变化的量存在时的多核苷酸。在一个实施方式中，该细胞是并不天然含 有该多核苷酸的细胞。然而，该细胞可以是含有导致编码的多肽生产量的改变，优选提高的 非内源性多核苷酸的细胞。本发明的重组多核苷酸包括还未从转录(重组)细胞、或者在 其中其存在的无细胞表达系统的其它组分中分离出的多核苷酸，以及在随后从至少一些其 它组分中纯化出的这种细胞或无细胞系统中产生的多核苷酸。“多核苷酸”是指寡核苷酸、多核苷酸或其任何片段。这可以是染色体组或合成源、 双链或单链的DNA或RNA，而与碳水化合物、脂质、蛋白或其它物质化合而实施本文中定义 的特定活性。多核苷酸的识别％通过GAP (Needleman and Wunsch, 1970)分析(GCG程序)采用 间隔生成罚分=5和空格延伸罚分=0. 3而进行测定。在长度上查询序列为至少45个核 苷酸，而GAP分析在至少45个核苷酸的区域内比对两个序列。更优选地，查询序列在长度 上为至少150个核苷酸，而GAP分析在至少150个核苷酸的区域内比对两个序列。更加优 选地，查询序列在长度上为至少300个核苷酸，而GAP分析在至少300个氨基酸的区域内比 对两个序列。更优选地，在其整个长度内比对这两个序列。关于所定义的多核苷酸，应该理解到，比以上提供的识别％图更高的多核苷酸将 会涵盖优选的实施方式。因此，根据最低识别％图，只要适用，优选该多核苷酸含有的多核 苷酸序列为至少40 %，更优选至少45 %，更优选至少50 %，更优选至少55 %，更优选至少 60 %，更优选至少65 %，更优选至少70 %，更优选至少75 %，更优选至少76 %，更优选至少 80 %，更优选至少85 %，更优选至少90 %，更优选至少91%，更优选至少92 %，更优选至少 93 %，更优选至少94 %，更优选至少95 %，更优选至少96 %，更优选至少97 %，更优选至少 98 %，更优选至少99 %，更优选至少99. 1 %，更优选至少99. 2 %，更优选至少99. 3 %，更优 选至少99. 4 %，更优选至少99. 5 %，更优选至少99. 6 %，更优选至少99. 7 %，更优选至少 99. 8%，而更加优选至少99. 9%相同于相关指定的SEQ ID NO。本发明的多核苷酸，当对比于天然存在的分子时，可以拥有一个或多个核苷酸残 基的缺失(或删除)、插入或替换的突变。突变体能够是天然发生的(也就是说，从天然来 源中分离出的)或人工合成的(例如通过在以上描述的核酸上实施定位突变或DNA改组)。 因此，显而易见本发明的多核苷酸能够是天然产生的或重组的。本发明的多核苷酸包括在对于含有至少40%相同于，优选至少90%相同于SEQ ID NO 1的核苷酸序列的多核苷酸的严格条件下杂交的那些。如在本文中所使用的，术语“严 格的杂交条件”等是指与本领域中所熟悉的那些参数，包括随寡核苷酸的长度变化的杂交 温度。核酸杂交参数可以在编撰这些方法的文献Sambr00k，et al. (supra), and Ausubel,
19et al. (supra)中找到。例如，如在本文中所使用的，严格杂交条件能够是指在65°C下的杂 交缓冲液(3. 5XSSC,0. 02% Ficoll,0. 02%聚乙烯吡咯烷酮，0. 02%牛血清白蛋白，2. 5mM NaH2PO4(pH7) ,0. 5% SDS,2mM EDTA)中的杂交。载体和宿主细胞本发明的一个实施方式包括重组载体，其包含本发明的至少一种分离的多核苷酸 分子，被插入到能够将多核苷酸分子递送到宿主细胞中的任何载体中。这样的载体含有异 源性多核苷酸序列，这是并非天然发现的毗邻本发明的多核苷酸分子而优选衍生于除了多 核苷酸衍生物种之外的物种的多核苷酸序列。该载体能够是RNA或DNA，原核的或是真核 的，而典型地是转位子(或转座子)(例如描述于美国专利US 5，792，294)，病毒或质粒。如本文中所使用的，“可操作地连接”是指两个或多个核酸(例如DNA)片段之间的 功能关系。典型地，这是指转录调控元件对转录序列的功能关系。例如，如果启动子刺激或 调节合适细胞中的编码序列的转录，则启动子可操作地连接于编码序列，例如本文中所定 义的多核苷酸。一般而言，可操作地连接于转录序列的启动子转录调节元件对转录序列是 物理上邻近的，即它们是顺式作用的。然而，一些转录调节元件，如增强子，并不需要是物理 上邻近的或定位于它们增强其转录的编码序列的紧邻。正如本文中所使用的，表达载体是能够转变宿主细胞并实施指定多核苷酸分子表 达的DNA或RNA载体。优选地，表达载体也能够在宿主细胞中进行复制，表达载体能够是原 核的或真核的，而典型地是病毒或质粒。本发明的表达载体包括在本发明的重组细胞，包括 在细菌、真菌、内源性寄生生物(或体内寄生生物)、节肢动物、动物、和植物细胞中发挥功 能(即，引导基因表达)的任何载体。具体而言，本发明的表达载体含有调节序列，如转录控制序列，翻译控制序列，复 制起点、和其它与重组细胞相容并控制本发明的多核苷酸分子表达的调节序列。具体地，本 发明的重组分子包括转录控制序列。转录控制序列是控制转录开始、延长和终止的序列。特 别重要的转录控制序列是控制转录开始，如启动子、增强子、操纵基因和阻抑物序列的那些 序列。合适的转录控制序列包括那些能够在本发明至少一种重组细胞中发挥功能的任何转 录控制序列。各种这样的转录控制序列对于本领域的技术人员而言是已知的。本发明的重组分子也可以(a)含有使本发明所表达的多肽能够从产生该多肽的 细胞中分泌出来的分泌信号(即，信号片段核酸序列)，和/或(b)含有导致本发明的核酸 分子作为融合蛋白表达的融合序列。合适的信号片段的实例包括任何能够引导本发明的多 肽分泌的信号片段。重组分子也可以包括围绕和/或在本发明的核酸分子的核酸序列内的 插入序列(或间插序列)和/或非翻译序列。本发明的另一实施方式包括含有本发明的一种或多种重组分子的宿主细胞。多核 苷酸分子转化到细胞中能够通过多核苷酸分子能够插入到细胞中的任何方法来完成。转化 技术包括但不限于，转染、电穿孔、显微注射、脂质体转染、吸附、和原生质体融合。重组细 胞可以保持单细胞或者可以生长成组织、器官或多细胞生物。本发明的转化的多核苷酸分 子能够保持是染色体外的、或者能够以保留其表达能力的这种方式结合到所转化的(即重 组)细胞的染色体中的一个或多个位点。待转化的合适宿主细胞包括能够用本发明的多核苷酸转化的任何细胞。本发明的 宿主细胞能够内源性地(即，天然的)生产本发明多肽或在用本发明的至少一种多核苷酸
20分子转化后能够产生这种多肽。本发明的宿主细胞能够是能够产生本发明至少一种蛋白的 任何细胞，包括动物、植物、细菌、真菌(包括酵母)、寄生生物、和节肢动物的细胞。优选地， 该宿主细胞是细菌细胞。在一个优选实施方式中，该宿主细胞是具有血清型H抗原HlO的 大肠杆菌菌株。合适的大肠杆菌菌株实例包括在WO 2007/025333中描述的CCEC22、CCEC31 和 CCEC59。重组DNA工艺学能够用于通过，例如，可操作控制宿主细胞中的多核苷酸分子复 制体的数目而改进所转化多核苷酸分子的表达、这些多核苷酸分子的转录效率、所得转录 物的翻译效率、和翻译后修饰的效率。对提高本发明的多核苷酸表达的有用重组技术包 括但不限于，可操作地将多核苷酸分子连接到高复制数质粒，将多核苷酸分子结合到一个 或多个宿主细胞染色体中，将载体稳定性序列添加入质粒中，替换或修饰转录控制信号 (例如，启动子、操纵基因、增强子)，替换或修饰翻译控制信号(例如，核糖体结合位点， Shine-Dalgarno序列(或SD序列))，修饰本发明的多核苷酸分子而对应于宿主细胞的密 码子使用，以及确实(或删除)对转录去稳定化的序列。多核苷酸的检测任何容许用于检测本发明多核苷酸的合适技术都可以使用，包括那些容许定量评 价多核苷酸在组织和/或细胞中的表达水平的技术。例如，转录基因的存在或水平能够通 过RNA印迹法(或诺慎印迹法，Northernblotting)、和/或多核苷酸的扩增，如通过PCR就 能够检测。比较可以通过参照标准对照进行。例如，转录基因的水平能够通过RNA印迹法 和/或RT-PCR就能够测定。随着定量(实时)PCR的出现，基因表达的定量分析通过采用 对于所感兴趣基因的合适引物就能够实现。核酸可以在基因阵列上进行标记和杂交，在这 种情况下，基因浓度将直接与阵列中产生的放射性或荧光信号的强度成比例。“聚合物酶链反应”(“PCR”)是其中复制副本采用构成“上游”和“下游”引物 的“引物对”或“引物组”、以及聚合催化剂如DNA聚合物酶、和典型的热稳定性聚合物酶 而制成多核苷酸靶的反应。用于PCR的方法在本领域内是已知的，例如于"PCR" (Ed. Μ. J. McPherson and S. G Moller (2000)BIOS Scientific Publishers Ltd, Oxford)中所 教导的。PCR能够在由从生物样品中分离出的反转录mRNA获得的cDNA上实施。然而，如果 PCR在染色体组的DNA上实施，则一般这将会更容易些。引物通常是约20个核苷酸长，最少约15个核苷酸的寡核苷酸，其能够在序列特异 性模式下杂交到靶序列中而在PCR期间扩展。扩增子或PCR产物或PCR片段或扩增产物是 含有引物和靶序列的新近合成的复制体的扩展产物。多重PCR系统含有导致同时产生多于 一个扩增子的多组引物。引物可以极好地匹配于靶序列或它们可以含有能够在特异性靶序 列中产生限制内切酶或催化性核酸识别/裂解位点诱导的内部不匹配碱基。引物也可以含 有其它序列和/或修饰或标记的核苷酸而有利于捕获或检测扩增子。DNA的热变性、引物 的退火到其互补序列和退火引物用聚合物酶进行扩展的重复循环，导致了靶序列的指数扩 增。术语“靶”或“靶序列，，或“模板”是指扩增的核酸序列。本领域技术人员将会理解到，还有许多可替代的技术可以用于扩增本发明的多核 苷酸。其它扩增技术的实例包括反转录聚合物酶链反应(RT-PCR)、连接酶链反应(“LCR”)， 还包括等温扩增技术，如链替换扩增(SDA)、DNA环介导等温扩增(LAMP)。可替代地，本发明的多核苷酸可以在样品中采用合适的杂交技术，例如采用合适标记探针的DNA印迹杂交，进行检测。“探针”是能够碱基配对到含有互补序列(靶)的第 二 DNA或RNA分子的定义序列的单链DNA或RNA分子。所得的杂交分子的稳定性取决于所 发生的碱基配对的程度，并受到参数如探针和靶分子之间的互补程度、以及杂化条件的严 格程度的影响。对于本文中描述的多核苷酸、或其部分具有特异性的探针，在长度上可以变 化，包括从至少8个核苷酸到500个核苷酸之间的任何在内的整数值，这取决于探针所使 用的目的、和在此目的下的条件。例如，探针在长度上可以是至少8、10、15、20或25个核苷 酸，或者在长度上可以是至少30、40、50或60个核苷酸，或在长度上可以是100、200、500或 1000个核苷酸内的长度。例如采用比对(Align)程序分析(Myersand Miller，1989)，对 本文中描述的多核苷酸具有特异性的探针一般至少40 %、50 %、55 %或60 %，或至少65 %、 75%、80%、85%、90%或95%，或多达96%、97%、98%或99%相同于本文中描述的核酸序 列。如本文中所使用的，术语“杂交”是指两个核酸分子相互之间通过氢键的关联作 用。影响这种结合的因素包括溶剂的类型和体积 ’反应温度；杂交时间；搅拌；阻断液相分 子非特异性连接于固体载体的试剂(登哈特试剂或BL0TT0)；分子的浓度；用于增加分子关 联比率的化合物的使用(硫酸葡聚糖或聚乙二醇)；和杂交后的冲洗条件的严格度(参见， Sambrook et al. ,Molecular Cloning ；ALaboratory Manual,Second Edition(1989))。根 据这些原理，互补分子与靶分子的杂交的抑制作用可以采用杂交试验分析进行检测；具有 更大程度同源性的基本同源的分子，接着就会竞争而在各种严格条件下抑制竞争性同源分 子结合于靶分子，正如在文献Wahl et al. , (1987)中所教导的。正如本文中关于杂交所使用的，“严格条件”是指这样一些条件(1)采用低离 子强度和高温冲洗，例如，50°C的0. 015MNaCl/0. 0015 M柠檬酸钠/0. 1 % NaDodSO4 ； (2) 杂交期间采用变性试剂如甲酰胺，例如，42°C的50% (ν/ν)甲酰胺与0. 牛血清清蛋 白、0. 菲可(聚蔗糖，Ficoll)、0. 聚乙烯吡咯烷酮、50mM pH6. 5磷酸钠缓冲液与 750mM NaCl、75mM柠檬酸钠；或(3)采用42°C在0. 2 X SSC和0. 1% SDS中的50%甲酰胺、 5X SSC(0. 75M NaCl, 0. 075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6. 8)、0. 焦磷酸钠、5X 登哈特 溶液(Denhardt' s solution)、超声处理的鲑鱼精子 DNA (50g/ml)、0. 1% SDS 和 10%硫酸 葡聚糖。减毒细菌细菌病原体的减毒方法在本领域内是已知的。典型地，将突变引入到细菌染色体 组中以阻止或降低毒素或其它毒性基因的表达而缺失(或删除)或使该基因失活。在某些 情况下，它们完全敲除这些基因的功能。这可以通过完全从基因中废止任何多肽的合成、或 通过使之产生突变而导致非功能性多肽的合成而实现。为了废止多肽的合成，整个基因或 其5'-端部可以进行删除(或缺失)。在基因编码序列中删除或插入，可以用于产生仅仅 合成非功能性多肽的基因(例如，仅仅含有野生型蛋白的N-端序列的多肽)。在毒素基因 的情况下，突变可以导致该基因产物变成无毒性。“突变”包括与亲代菌株相比在生物的DNA序列，即染色体组中的任何改变。这种 改变可以通过将生物暴露于诱变刺激物，如诱变化学品、能量、辐射、重组技术、交配、或任 何用于改变DNA的其它技术而产生。突变可以包括在本文中描述的任何核苷酸序列中的改 变，或者可以包括在编码本文中描述的任何多肽的核苷酸序列中的改变。
作为突变的结果，当与亲本菌株相比时，如果突变细胞的毒性水平降低至少10%、 20%,30%,40%,50%,60%,70%,80%,100 %，则突变可以“弱化毒素毒性”。毒 性的降低也可以通过当与亲本菌株相比时降低多肽，例如含有基本相同于序列SEQ IDNO 2 或SEQ ID NO :3、或其片段或变体的氨基酸序列在突变菌株中至少10%、20%、30%、40%、 50%、60%、70%、80%、90%或100%的表达和/或毒素活性而进行测定。本领域技术人员将会理解到，本发明的减毒细菌病原体可以适用于向受试者递送 一种或多种生物活性多肽。适用于通过本发明的减毒细菌递送的生物活性多肽的实例包括 能够局部或系统地发挥功能的多肽，例如能够发挥内分泌活性而影响局部或全身代谢的多 肽。在一个实施方式中，生物活性多肽可以是异源多肽。术语“异源多肽”在本领域内 很好理解，是指非细胞内生的多肽。编码所感兴趣的多肽的核酸分子可以源于能够产生所 感兴趣多肽的任何生物，或者可以是完全人工合成的基因。编码该多肽的核酸分子能够例 如通过感染、转染、显微注射、电穿孔、(高速粒子)喷射技术(microprojection)等加入到 细胞中。以举例的方式，生物活性多肽可以是能够调节免疫造血系统的多肽。可替代地，生 物活性多肽可以是能够影响体内各种正常细胞或肿瘤细胞的生存力、生长和分化的多肽。 可替代地，生物活性多肽可以是能够影响免疫调节或对受伤和感染的急性期发炎应答的诱 导的多肽。可替代地，生物活性多肽可以是能够增强或诱导对由作用于其靶细胞受体上的 趋化激素介导的细胞和组织感染的抗性、或上皮细胞增殖或伤愈促进的多肽。这种多肽的具体实例包括胰岛素，生长激素，催乳素，降钙素，黄体生成素，甲状旁 腺激素，促生长素抑制素，促甲状腺激素，血管活性肠肽，结构组1细胞因子(structural group 1 cytokine)如 IL-1β 、 IL-2、 IL-3、 IL-4、 IL-5、 IL-6、 IL-7、 IL-8、 IL-9、 IL-10、 IL-IU IL-12、 IL-13、 IL-15、 IL-16、 IL-17、 IL-18、 IL-19、 IL-20、 IL-21、 IL-23、 IL-24、 IL-25、IL-26、IL-32、cMGF、LT、GM-CSF、M-CSF, SCF、IFN- y、IFN- λ、EPO, G-CSF, LIF、OSM、 CNTF、GH、raL或IFNa/β，结构组2细胞因子如TNF族的细胞因子例如TNFa配体、TNF3配 体、⑶40配体、⑶27配体或FAS配体，IL-I族的细胞因子，成纤维细胞生长因子族，血小板衍 生的生长因子，转化生长因子β和神经生长因子，结构组3细胞因子例如上皮生长因子族 的细胞因子，趋化因子，胰岛素相关的细胞因子，结构组4细胞因子如调蛋白(heregulins) 或神经调节蛋白，例如EGF。可替代地，生物活性多肽能够是对于以上定义的生物活性多肽的受体或拮抗剂。在本发明的一个实施方式中，生物活性多肽是抗体，优选重组抗体。可替代地，生物活性多肽能够是抗微生物肽或其合成变体。抗微生物肽包括杀菌 肽、爪蟾抗菌肽(或蛙皮素，magainin)和防卫素(defensin)。杀菌肽是第一族特征化较佳的结构相关的抗微生物肽，据发现广泛分布于昆虫体 内(Boman，2003)。在脊椎动物中，爪蟾抗菌肽(或蛙皮素)族抗微生物肽已经从爪蟾皮 肤和胃肠道的腺体中分离出来，而被认为是构成两栖动物粘膜表面抗感染防御体系的基础 (Soravia et al. ，1988)。防卫素是在从几种哺乳动物物种包括人类中分离出的吞噬细胞中发现的抗微生 物肽，而其特征是序列中的8个不变残基(Gabayet al.，1989)。肽，如防卫素的抗微生物活性机理是经由选择性地破坏膜而产生抗生物活性的特征广谱(Boman，1995)。防卫素的抗微 生物谱包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌、分枝杆菌、许多真菌和一些包膜病毒。细菌源的抗微生物肽已知为小菌素、大肠杆菌素和细菌素(Jacket al. , 1995 ； Ingham et al.，2003)。据所知，细菌素活性的序列、结构和机理是不同的。最丰富的和研 究最透彻的细菌素包括I类(羊毛硫抗生素)和II类(含非羊毛硫氨酸的小热稳定肽) 细菌素(Ermahar et al.，2000)。II类细菌素因为其活性和潜在的应用构成了一重要的 亚群。IIa类细菌素包括Piscicolin 126、明串珠菌素A(leucocin A)和肠道菌素P (或 促肠活动素，enterocin P)等。IIa类细菌素具有共同的N-端基序AGNGVXaaCXaa(K/ N) XaaXaaCXaaV (N/D) (ff/K/R) Xaa- (G/A/S) (Α/Ν)，其中具有较高可变性的残基表示为 Xaa(Bhugaloo-Vial，et al.，1996)。在论证细菌素抗微生物性质的实例中，Piscicolin 126，当其被注入小鼠体内时，已经证实表现出体内抗微生物活性，并显著降低了肝脏和脾 中的李斯特负载(listerial load) (Ingham et al.，2003)。可替代地，生物活性肽能够是酶。酶能够是任何具有所需活性的酶。例如，递送在 改善食物消化能力或去除抗营养化合物中起作用的酶，是合乎需要的。例如，多糖降解和 纤维蛋白溶解的酶如木聚糖酶(Liu et al.，2005)、葡聚糖酶(Cho et al.，2000)、纤维素 酶(Liuet al.，2005)、淀粉酶、果聚糖蔗糖酶、和菊粉蔗糖酶都可以被递送而增加食物的消 化能力。蛋白酶、肽酶、和脂肪酶也可以被递送而增加被消化食物的营养价值。植酸酶(或 肌醇六磷酸酶)(Vohra andSatyanarayana, 2003 ；Nahashon et al.，1994)和酸性磷酸酶 (Palacioset al. ,2005)也可以被递送而降低在植物种子中发现的肌醇六磷酸(盐/酯) 的抗营养效应。 在另一实施方式中，本发明的减毒细菌病原体可以表达抗原体。如果抗原是例 如来自细菌、真菌、寄生生物或病毒性致病剂(viraldisease agent)，则减毒细菌菌株 就能够用于对受试者接种而对抗由这种致病剂导致的疾病。例如，减毒细菌菌株能够用 于递送来自禽类病原微生物的抗原。这种微生物包括但不限于以下这些物种棒状杆菌 (Corynebacteria),支原体(Mycoplasma)，李斯特氏杆菌(Listeria)，包柔氏螺旋体菌 (Borrelia)，衣原体(Chlamydia)，梭状芽胞杆菌(Clostridia)，科克斯菌属(Coxiella)， 丹毒丝状菌(Eysipelothrix),黄杆菌(Flavobacteria),葡萄球菌(Staphylococcus), 埃希氏菌(Escherichia)，沙门氏菌(Salmonella)，弯曲杆菌(Campylobacter)和链球 菌(Streptococcus)。已知感染家禽的真菌和寄生性禽类病原体的实例有以下物种变 带缘虫属(Amoebotaenia), Aproctella,虫回虫属(Ascaridia),曲霄菌(Aspergillus), 念珠菌(Candida)，毛细线虫属(Capillaria)，隐孢子虫属(Cryptosporidium)，杯 冠木属(Cyathostroma)，咽饰带线虫属(Dispharynx)，艾美耳球虫属(Eimeria)，皱 褶属(Fimbriaria)，筒线虫属(Gongylonemia)，异刺线虫属(Heterakis)，组织滴 虫属(Histomonas)，尖旋尾属(Oxyspirura),疱原虫属(Plasmodium)，瑞立绦虫属 (Raillietina)，类圆线虫属(Strongyloides)，锥尾属(Subulura)，比翼属(Syngamus)， 四棱属(Tetrameres)和毛圆线虫属(Trichostrongylus)。感染家禽的已知病毒包括腺 病毒(adenoviruses)(例如，出血性肠炎病毒(hemorrhagic enteritisvirus)),星状病 毒(astroviruses)，冠形病毒(coronaviruses)(例如，传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus)),畐Ij 粘病毒(paramyxoviruses)(例如，新城疫病毒(Newcastledisease virus))、微小核糖核酸病毒(picornaviruses)(例如，禽类脑脊髓炎病毒 (encephalomyelitis virus)),痘病毒(pox viruses),逆转录病毒(retroviruses)(例如， 禽类白血病/肉瘤病毒(leukosis/sarcomaviruses))，呼吸道肠道孤病毒(reoviruses)和 轮状病毒(rotaviruses)。具体实例包括禽流感病毒、马立克氏病病毒(Marek’ s Disease Virus)和鸡贫血病毒(Chicken Anaemia Virus)。用作抗原的优选基因产物是多肽和肽， 包括糖蛋白和脂蛋白。来自这些原核和真核生物的抗原编码的基因能够进行克隆，并采用 标准技术在减毒细菌中表达。组合物和给药“免疫原组合物”是指含有提高所需免疫应答的物质的组合物，包括“疫苗”。术语 “疫苗”涵盖了任何诱导抗靶向病原体的至少部分保护性免疫应答或其有效保护对抗病原 体的组合物；例如，在给予或注射到动物(例如，禽类如家鸡或猪类家畜如猪)体内之后，诱 发对抗靶向病原体的至少部分保护性免疫应答或提供对抗病原体(如产气荚膜梭菌)的有 效保护。病原体的子单元例如从病原体分离出的抗原或免疫原或抗原决定基，和子单元组 合物，含有或基本由一种或多种从病原体中分离出的抗原、免疫原或抗原决定基组成。对于 诱发“至少部分保护性的”免疫应答，意指疫苗降低由表达本发明多肽的细菌产生的感染和 /或群集(或殖民化)或者降低由表达本发明多肽的细菌感染而产生的至少一种症状。免疫原的组合物可以选择、活化或扩展包括记忆B细胞和T细胞在内的免疫系统 细胞，而例如使之能够消除传染性致病物，如表达含有SEQ ID N0:2和/或SEQ ID N0:3氨 基酸序列、或其抗原片段的多肽的细菌病原体。在一些实施方式中，免疫原的组合物包括合适的载体，如佐剂，其是这样的一种试 剂，其以非特异性方式作用而增加对特异性抗原、或抗原组的免疫应答，而能够以既定剂量 降低抗原数量，或者降低产生所需的免疫应答而需要的剂量频率。例如，在接种动物中所 需的免疫应答相对于未接种动物可以包括10%至100%之间的任何值，例如10%、20%、 30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%对抗细菌病原体散发或群集的保护。佐剂对于改善免疫应答和/或增加疫苗制剂的稳定性是有用的。佐剂典型地描 述为免疫系统的非特异性刺激物，而且对于靶向免疫系统的特异性分支也是有用的。一 种或多种具有这种活性的化合物可以加入到疫苗中。因此，本发明的具体疫苗另外含有一 种佐剂。能够用作佐剂的化学化合物的实例包括但不限于，铝化合物(例如，氢氧化铝)， 可代谢的和不可代谢的油，矿物油包括矿物油溶液中的油酸二缩甘露醇酯衍生物(例如， 购自Seppic SA, France的MONTANIDE ISA 70)和轻矿物油如DRAKE0L 6VR、嵌段共聚物、 ISCOM' s (免疫刺激络合物)、维生素和矿物质(包括但不限于维生素E、维生素A、硒和 维生素 B12)和CARBOPOL 。其它合适的佐剂，有时候也称之为免疫刺激剂，包括但不限于细胞因子、生长因 子、趋化因子、淋巴细胞的细胞培养基的上清液、单核细胞、来自淋巴器官的细胞、来自植 物、细菌或寄生生物的细胞制剂和/或提取物(金黄色葡萄球菌或脂多糖制剂)或促细胞 分裂剂。一般而言，佐剂随本发明的抗原同时给药。然而，佐剂也能，或可替代地在疫苗给 药之前2个星期的时间内给药、和/或疫苗给药之后一定时间内给药，即只要抗原，例如含 有按照SEQ ID NO :2或SEQ ID NO :3提供的氨基酸序列的多肽或其抗原片段，存留于组织
25内。根据本发明的免疫原的组合物可以包括本文中所描述的多肽和核酸分子、或其免 疫原片段，并且可以采用本领域已知的或本文中描述的任何给药形式进行给药。在本发明 一些实施方式中，免疫原组合物或疫苗可以包括活体细菌病原体、杀灭的细菌病原体，或其 组分。活体细菌病原体可以以口服疫苗的形式给药，可以进行减毒而使之降低细菌病原体 的毒性，而不是其免疫应答的诱导。活体疫苗可以能够群集于接种动物如禽类的肠内。在一些实施方式中，本文中描述的多肽和核酸分子，或其抗原片段，或本文中描述 的变异细菌(例如，减毒细菌)可以给予家禽，例如家鸡、鸭、火鸡等，而诱发家禽内的免疫 应答，例如，产生抗体。由这种家禽获得的蛋，或其产品，表现出对抗本文中描述的多肽和 核酸分子、或其免疫原片段的免疫应答的，可以给予动物，如人、牛、山羊、绵羊等，而在动物 内诱发对本文中描述的多肽和核酸分子、或其免疫原片段的免疫应答。在家禽中产生抗 体的方法，以及给予这种抗体的方法，描述于例如美国专利US 5，750，113和美国专利US 6，730，822 中。根据本发明的免疫原组合物和疫苗可以进一步通过加入其它的当给予动物受试 者时可以导致产生各种特异性抗体的重组或纯化抗原而进行补充。并非所有的这些抗体都 需要是保护性地对抗疾病。在这种类型的具体实施方式
中，这样的抗原也来自产气荚膜梭 菌。因此，本发明的疫苗可以与本发明的多肽一起含有各种其它活性的或失活的病原因子。 因此，根据本发明，本发明的多肽能够与其它的梭菌和非梭菌细胞、类毒素和提取物一起组
I=I O其它抗原可以包括病毒抗原体和/或细菌抗原体和/或寄生生物抗原体。例 如，抗原体可以衍生于微生物，包括但不限于以下物种棒状杆菌(Corynebacteria)， 支原体(Mycoplasma)，李斯特氏杆菌(Listeria)，包柔氏螺旋体菌(Borrelia)，衣 原体(Chlamydia)，梭状芽胞杆菌(Clostridia)，科克斯菌属(Coxiel la)，丹毒丝状 菌(Eysipelothrix),黄杆菌(Flavobacteria)，葡萄球菌(Staphylococcus),埃希氏 菌(Escherichia)，沙门氏菌(Salmonella),弯曲杆菌(Campylobacter)、和链球菌 (Streptococcus) 0已知感染家禽的真菌和寄生性禽类病原体的实例有以下物种变 带缘虫属(Amoebotaenia), Aproctella,虫回虫属(Ascaridia),曲霄菌(Aspergillus), 念珠菌(Candida)，毛细线虫属(Capillaria)，隐孢子虫属(Cryptosporidium)，杯 冠木属(Cyathostroma)，咽饰带线虫属(Dispharynx)，艾美耳球虫属(Eimeria)，皱 褶属(Fimbriaria)，筒线虫属(Gongylonemia)，异刺线虫属(Heterakis)，组织滴 虫属(Histomonas)，尖旋尾属(Oxyspirura),疱原虫属(Plasmodium)，瑞立绦虫属 (Raillietina)，类圆线虫属(Strongyloides)，锥尾属(Subulura)，比翼属(Syngamus)，四 棱属(Tetrameres)和毛圆线虫属(Trichostrongylus)。已知的感染家禽的病毒包括腺 病毒(adenoviruses)(例如，出血性肠炎病毒(hemorrhagic enteritisvirus)),星状病 毒(astroviruses)，冠形病毒(coronaviruses)(例如，传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus)),畐Ij 粘病毒(paramyxoviruses)(例如，新城疫病毒(Newcastle disease virus))、微小核糖核酸病毒(picornaviruses)(例如，禽类脑脊髓炎病毒 (encephalomyelitis virus)),痘病毒(pox viruses),逆转录病毒(retroviruses)(例如， 禽类白血病/肉瘤病毒(leukosis/sarcomaviruses))，呼吸道肠道孤病毒(reoviruses)和轮状病毒(rotaviruses)。本发明的多价疫苗还能够含有一种或多种以下抗原体产气荚膜梭菌β毒素， 产气荚膜梭菌β 2毒素，产气荚膜梭菌肠毒素，产气荚膜梭菌ε毒素，产气荚膜梭菌t毒 素，产气荚膜梭菌κ毒素，产气荚膜梭菌λ毒素，产气荚膜梭菌θ毒素，索氏梭菌失血性 (C. sordellii hemorrhagic)毒素，索氏梭菌致命毒素，艰难梭菌(C. difficile)A毒素，艰 难梭菌B毒素，败毒梭菌(C. septicum) α毒素，诺维梭菌(C. novyi) α毒素和诺维梭菌β本发明的免疫原组合物和疫苗可以作为液体、乳液、干粉给药，和/或以雾剂通过 任何肠道外途径、静脉内、腹膜内、皮内，通过破皮，皮下、肌肉内给药，或通过粘膜途径，例 如口服、作为气溶胶鼻吸，通过眼滴，通过卵内注射给药，或作为冻干粉末灌输给药。本文中描述的多肽和核酸分子，或其免疫原片段，变异细菌(例如减毒细菌)和/ 或本文中描述的免疫原组合物的给药，可以通过向禽类(例如家禽)的蛋内注射和注射到 气囊中而很方便实现。尽管气囊是卵内注射给药的优选途径，但是其它区域如卵黄囊或绒 毛膜尿囊液也可以通过注射接种。当气囊不是用于给药的靶标时尽管没有必要是不可接受 的商业水平，但是孵化能力比率或许会稍微降低。注射的机理并不严格限于本发明的实施 内容，但是优选的是针不会导致对蛋或胚胎发育的组织和器官或胚胎周围的外胚膜造成不 合宜的损害。一般而言，配备约22号针的皮下注射器是合适的。本发明的方法尤其适用于 自动注射系统，如描述于美国专利US 4，903，635、US 5，056，464、US 5，136，979和US 20060075973中的那些系统。本发明还提供了对雌性动物(例如，怀孕母畜)后代提供被动免疫的方法，包括 在其后代出生之前向该雌性动物(例如，母体)给予本发明的疫苗。“被动免疫”是指将免 疫性从母体转移到后代并能够尤其是通过初乳消化来完成，正如在哺乳动物中所发生的那 样，或将抗体从蛋卵黄吸收到血流中，正如在家禽中所发生的那样。在一个实施方式中，雌性动物是禽类，而疫苗在其产下含有后代的蛋之前向禽类 母体给药。以这种方式，其后代就被提供了被动免疫。在一个这种实施方式中，禽类是家禽。 优选地，家禽是家鸡、火鸡或鸭子。本发明的免疫原组合物和疫苗可以含有药用载体。药用载体包括兽医药可接受的 载体。在一个具体实施方式
中，术语“药用的”是指由联邦或州政府管理机构批准的或在适 用于动物，而尤其是人类的美国药典或其它一般认知的药典中所列出的。术语“载体”是指 治疗给药所用的稀释剂、赋形剂或媒介物。这种药物载体能够是无菌液体，如水和油，包括 石油、动物、植物或合成源的油，如花生油、大豆油、矿物油、芝麻油等。一般而言，本发明的制剂成分要么独立地要么在单位剂量形式中一起混合供给， 例如，作为冻干粉或无水浓缩物储存于气密性密封容器如指示活性剂的量的安瓿瓶或粉囊 中。本发明还提供了含有本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体和/或宿 主细胞的组合物。对于本领域技术人员应该理解到该组合物可以含有合适的载体或赋形 剂。DNA 疫苗
DNA接种涉及将DNA编码抗原直接体内引入受试者的细胞和/或组织而由受试者 组织的细胞表达抗原。这种疫苗在本文中称之为“DNA疫苗”或“核酸基疫苗”。DNA疫苗的 实例描述于美国专利 US 5，939，400，美国专利 US 6, 110, 898, WO 95/20660 和 WO 93/19183 中。直接注射编码抗原而诱发保护性免疫应答的DNA的能力已经在各种实验系统中得以证 实(参见,例如，Conry et al. , 1994 ；Cardosoet al. , 1996 ；Montgomery et al. , 1993 ；Yang et al.，1997)。已知的影响由DNA免疫诱发的免疫应答的因素是DNA递送的方法，例如，肠道外 途径能够产生的基因转移速率低，而产生的基因表达的可变性很大(Montgomery et al., 1993)。采用基因枪的高速接种质粒，能够增强小鼠的免疫应答(Fynan et al.，1993)，大概 是因为DNA转染效率更大，而抗原通过树突细胞渗透更有效。含有本发明核酸基疫苗的载 体也可以通过其它本领域已知的方法如转染、电穿孔、微量注射、转导、细胞融合、DEAE葡萄 糖、磷酸钙沉淀、脂质体转染(溶酶体融合)、或DNA载体转运子而引入到所需宿主中。衍牛于转基因棺物的疫苗术语“植物”是指整个植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞等。可 设想用于本发明的实施中的植物包括单子叶植物和双子叶植物。典型的双子叶植物包括玉 米、土豆、西红柿、菜豆、大豆等。典型的转基因植物常规上都作为用于农场动物，尤其是家 鸡的食物(或饲料)来源而进行使用。转基因植物，正如在本发明上下文中所定义的，包括植物(以及所述植物的部分 和细胞)及其后代，这种后代已采用重组DNA技术遗传修饰而在所需植物或植物器官内导 致或增强了本发明的至少一种多肽的生产。现有的几种技术能够将外源遗传物质引入到植物细胞中，而获得稳定维持和表达 所引入基因的植物。这样的技术包括加速涂覆到微粒上的遗传物质直接进入细胞中(参 见，例如，美国专利US4, 945，050和US 5，141，131)。植物可以采用土壤杆菌技术(或农杆 菌技术，Agrobacterium technology)进行转化(参见，例如，US5, 177，010、US 5，104,310、 US 5,004, 863,US 5，159，135)。电穿孔技术也用于植物转化(参见，例如，WO 87/06614,US 5, 472, 869, US 5, 384, 253, WO 92/09696 和 WO 93/21335)。除了用于转化植物的各种技术 外，与外源基因相接触的组织类型也可以进行变化。这种组织可以包括但不限于，胚胎发生 组织、胼胝体I型和II型、胚轴、分生组织等。几乎所有的植物组织在发育和/分化期间采 用本文中描述的合适技术就可以被转化。适合稳定转染植物细胞或转基因植物的建立的许多载体已经描述于例如文献 Pouwels et al. ,Cloning Vectors :A LaboratoryManual,1985,supp. 1987 ；Weissbach and ffeissbach, Methods forPlant Molecular Biology, Academic Press, 1989 ；禾口 Gelvin et al. ,Plant Molecular Biology Manual,Kluwer Academic Publishers, 1990 中。典型地， 植物表达载体包括，例如，一种或多种在5'和3'调节序列和显性选择标记的转染控制下 克隆的植物基因。这种植物表达载体还能够含有启动子调节区(例如，控制可诱导的或组 成型的、环境或发育调节的、或细胞或组织特异性表达的调节区)，转染开始的始发位点，核 糖体结合位点，RNA处理信号、转染终止位点，和/或多腺苷酸化信号。植物启动子的实例包括但不限于，核酮糖-1，6- 二磷酸羧化酶小子单元、β -伴大 豆球蛋白(conglycinin))启动子、菜豆蛋白启动子、ADH启动子、热冲击启动子和组织特异
28性启动子。启动子也可以含有某些可以改善转录效率的增强子序列元件。典型的增强子包 括但不限于Adh-内含子1和Adh-内含子6。组成型启动子引导所有细胞型中在所有时间的连续基因表达(例如，肌动蛋白、 泛素、CaMV 35S)。组织特异性启动子负责在特异性细胞和组织类型如叶子或种子(例如， 玉米蛋白、油质蛋白、油菜籽蛋白(或种子储藏蛋白，napin)、ACP、球蛋白等)中的基因表 达，而这些启动子也可以使用。启动子也可以在植物发育的某些阶段是活性的，以及在植物 组织和器官中也是活性的。这种启动子的实例包括但不限于，花粉特异性的、胚胎特异性 的、玉米穗丝特异性的、棉纤维特异性的、根特异性的、种子胚乳特异性的启动子等。在某些情况下，采用可诱导的启动子或许是合乎需要的。可诱导的启动子负责响 应特异性信号如物理刺激(热冲击基因)；光(RUBP羧化酶)；激素(Em)；代谢物；和应力， 而用于进行基因表达。其它在植物中发挥功能的所需的转录和翻译元件也可以使用。除了植物启动子之外，各种来源的启动子都能在植物细胞中有效使用而表达外源 基因。例如，细菌源的启动子，如章鱼碱合酶(或真蛸碱合成酶，octopine synthase)启动 子、胭脂氨酸合成酶启动子、甘露碱合酶启动子；病毒源的启动子，如花椰菜花叶病毒(35S 和19S)等，都可以使用。许多植物衍生的可食用疫苗目前已经发展为用于动物和人的病原体(Hood and Jilka,1999)。免疫应答也已经用以下物质口服免疫化而产生产生类病毒粒子(VLP)的转 基因植物、或显示抗原决定基的嵌合植物病毒(Modelska et al.，1998 ；Kapustra et al.， 1999)。由之启示如下这些VLP或嵌合病毒的粒子形式可以导致抗原在胃中更大的稳定 性，有效地提高了在内脏中吸收的可利用的抗原的量(Modelska et al. 1998)。食物在一个实施方式中，本发明的组合物是食物或食料。为本发明之目的，“食物”或 “食料”包括人或动物(如，牛、马、山羊和绵羊)消耗的任何食物或制剂(包括肠或肠胃外 的消耗)，当吸收到身体内之后，(a)起到供给营养或构建组织或供给能量；和/或(b)维 持、储存或支持足够的营养状态或代谢功能。食物包括对于具体用途所需的用量的营养物质如可食用常量营养物、维生素，和/ 或矿物质。这些成分的量将会根据组合物是否打算用于正常个体还是具有专用需求的个体 所用，如患有代谢障碍等的个体，而进行变化。具有营养价值的物质的实例包括但不限于，常量营养物如可食用脂肪、碳水化合 物和蛋白质。这样的可食用脂肪的实例包括但不限于，椰子油、琉璃苣油、真菌油、黑加伦 油、豆油、和酸-和二酸-甘油酯。这样的碳水化合物的实例包括(但不限于)葡萄糖、可 食用乳糖、和水解淀粉。另外，在本发明的营养组合物中可以使用的蛋白质的实例包括(但 不限于)大豆蛋白、电渗析乳清、电渗析脱脂乳、乳清、或这些蛋白的水解产物。关于维生素和矿物质，以下可以添加到本发明的食物组合物中钙、磷、钾、钠、氯、 镁、锰、铁、铜、锌、硒、碘，以及维生素A、E、D、C、和B族复合物。也可以添加其它的这样的维 生素和矿物质。在本发明的食物组合物中可以利用的组分能够是半纯化的或纯化的来源。对于半 纯化或纯化的物质，意指通过营养物质的纯化或通过从头合成(novo synthesis)制备的物 质。
在一个实施方式中，本发明的多肽用于食物的生产中。例如含有本发明多肽的食 物能够用于动物接种而通过细菌病原体表达具有毒素活性的多肽以提供对感染和/或群 集的至少部分的保护作用。优选地，细菌病原体表达的多肽含有至少40%相同于SEQ ID N0:2和/或SEQ ID NO :3的氨基酸序列。在一个实施方式中，细菌病原体来自于梭状芽孢 杆菌属，例如，细菌病原体是产气荚膜梭菌。在另一实施方式中，食物含有本发明的转基因植物，和/或所述植物的部分，和/ 或所述植物的提取物。激动剂和拮抗剂_试验分析(或测定)和分子本发明的多肽可以应用于该多肽的毒素活性的活化(激动剂)或抑制(拮抗剂) 的化合物的筛选过程中。潜在的拮抗剂的实例包括抗体、寡糖及其衍生物。潜在的拮抗剂包括结合于本发 明的多肽使之无法接近该多肽的底物的小分子。小分子的实例包括但不限于，小肽或类肽 分子。小分子可以模拟根据本发明多肽的底物的结构。本发明还包括识别与具有毒素活性的多肽相互作用或抑制其生物活性(即，影响 酶活性)的化合物的高通量筛选(HTS)分析法。HTS分析法容许以有效的方式筛选大量化 合物。HTS分析法经设计而识别具有所需性能的“命中化合物”或“先导化合物”，这种先导 化合物能够经过设计而改善所需的性能。对于“命中化合物”或“先导化合物”的化学改性 (或修饰)经常基于“命中化合物”和毒素多肽之间的可识别结构/活性关系。本发明多肽的拮抗剂通过将其添加到动物食物或饮料中可以用于保护动物免于 生病。这种处理能够降低该动物暴露的活性环境衍生生物的负载。因此，本发明提供的食 物和/或饮料含有本发明多肽的拮抗剂。拮抗剂可以是例如，结合本发明多肽的抗体。本 发明还提供了含有这样的拮抗剂的食物和/或饮料用于降低动物被表达本发明多肽的细 菌感染和/或群集的用途。实施例实施例1.产气荚膜梭菌NetB毒素编码NetB基因的测序将10 μ g从产气荚膜梭菌菌株EHE-NE18分离出来的染色体组DNA用于获得序列 读取、重叠群和序列质量得分。氨基酸序列由核苷酸序列推断。信号肽的预测采用SignalP ν 3.0程序实施(Bendtsen et al.，2004)。与所推断的氨基酸序列同源的序列采用gapped BLAST 程序搜索(Altschul et al.，1997)。编码NetB的基因的核苷酸序列按照SEQ ID NO :1提供，而包括信号序列的NetB 的氨基酸序列按照SEQ ID NO :3提供。信号肽序列从成熟分泌的蛋白(SEQ ID NO 2)中切 取。当与NetB共享同一性低于39%时，BLAST搜索识别产气荚膜梭菌β _毒素(图1)。重组NetB的纯化和兔抗-rNetB抗血清的产生将netB基因进行PCR扩增并克隆入pENTR/SD/D-T0P0，并从框架中亚克隆入表达 载体pDest41BA。蛋白在镍亲合柱上接着通过凝胶过滤(S200)而进行纯化。将峰组分汇集 并进行TEV裂解，而重新载入到镍柱上以除去未裂解的蛋白和TEV。将重组蛋白( 1. 3mg) 送入Chemicon而进行抗体生产(Chemicon-Millipore，CA, USA)。将抗-rNetB抗血清用于 产气荚膜梭菌菌株的免疫印迹分析(或蛋白质印迹分析)和中和研究中。
天然NetB纯化产气荚膜梭菌EHE-NE18在TPG汤内生长直至0D600nm为0. 6。通过以18000g的 转速在4°C下离心15min而获取培养基上清液(3L)。采用超滤(Amicon 8400)通过IOkDa 膜(DIAFLO YM10-76mm，Amicon)将上清液浓缩X 5倍，接着在4°C下用40% (w/v)的 (NH4)2SO4沉淀过夜，并通过以ISOOOg转速在4°C下离心2h来分离。将含有毒素的沉淀物 浓缩20倍(总共100倍)并在48h内于4°C下用pH 7. 2的IOmM Tris-HCl透析。将蛋白 在琼脂糖S印harose Q FF(GE)阴离子交换树脂中用Tris缓冲液(pH8. 5)进行色谱分离， 并流过收集。实施例2.缺乏毒素的产气荚膜梭菌突变菌株的产生根据标准技术实施DNA操作。在自杀质粒的构建中所使用的寡核苷酸是 AKP60 (SEQ ID NO :7)、AKP61 (SEQ ID NO :8)、AKP58 (SEQ ID NO 9)和 AKP59 (SEQ ID NO 1 0)。将所有的扩增产物都克隆入克隆载体pGEM -T Easy载体系统(Promega)，随后按 需进行亚克隆。标记的、部分删除(或缺失)、自杀质粒，PALK16，通过在pALKl内catP盒的 任意一侧上克隆netB基因区域的片段进行构建。首先，将采用AKP60和AKP61扩增的1490 bp MfeI-SpeI片段定向克隆入pALKl的EcoRI-SpeI位点，接着，将采用AKP58和AKP59扩 增的1937 bp BamHI-NheI片段克隆入所得质粒的BamHI-NheI位点。最后，将由pJIR1457 扩增的ermB和oriT钝端(blunt end)克隆入SmaI位点。将最终的自杀质粒pALK16如先 前所描述地引入到产气荚膜梭菌菌株EHE-NE18中(Scott and Rood, (1989))。在37°C下 于用甲砜霉素补充的TSC上生长后，将菌落交叉贴到用红霉素补充的TSC上而证实双交叉 事件已经发生。在合适抗生素上生长的菌落经过选择而用于进一步分析。制备染色体DNA 后，采用PCR和DNA印迹分析而证实突变体衍生于netB基因区域中的双交叉事件。将互补 质粒，PALK20，通过将全长netB基因克隆入产气荚膜梭菌穿梭载体pJIR1457而引入到两个 突变体中。采用细胞毒性分析(或测定)中的红霉素选择和试验来证实互补。NElS-AnetB 染色体区域的示意图如图2所示。实施例3. NetB活性分析细胞毒性分析在产气荚膜梭菌EHE-NE18培养基上清液上实施。将LMH细胞培养 直至在0. 2%白明胶涂覆并在37°C下于EMEM介质中生长的24孔板中达到70%汇合。将培 养基上清液加入到整个孔板用2倍稀释的介质中高达1 32，并在37°C下孵育达16h。将 LMH细胞在纯的TPG培养介质(图3a)；产气荚膜梭菌EHE-NE18培养基上清液，1 16稀释 (图3b)；产气荚膜梭菌JIR325非-坏疽肠炎菌株13培养基上清液，1 2稀释(图3c)； 或产气荚膜梭菌NE18-M1 (pic突变体不表达α-毒素)培养基上清液，1 16稀释(图3d) 存在下培养。在100Χ放大倍数的光学显微镜下观察细胞变性效应(CPE)。正常细胞(图3a)看起来是健康的，然而，添加产生NetB的菌株的培养基上清液 导致细胞圆形收拢(round-up)而死亡(图3b)。并不表达NetB的菌株的上清液不感染细 胞(图3c)。删除(或缺失)α -毒素基因并未影响培养基上清液杀死细胞的能力(图3d)。实施例4.产气荚膜梭菌NetB毒素突变体的互补NE18-缺失(或删除)的netBl菌株(netB阴性菌株)用pALK20netB互补质粒 补充。然后对互补的产气荚膜梭菌菌株测试毒素活性。对于细胞毒性分析，将LMH细胞培 养直至在以0. 2%白明胶涂覆并在37°C下于EMEM介质中生长的24孔板中达到70%汇合。将培养基上清液加入到整个孔板用2倍稀释的介质中高达1 32，并在37°C下孵育达16h。 将LMH细胞用以下培养液的任一种孵育EHE-NE18培养基上清液，1 16稀释(图4a)； NE18-缺失的netBl培养基上清液，1 2稀释(图4b) ；NE18-缺失的netBl+pJIR1457 (穿 梭质粒)培养基上清液，1 2稀释(图4c) ；NE18-缺失netBl+pALK20 (netB互补质粒)培 养基上清液，1 16稀释(图4d)；纯TPG培养基介质(图4e)；或柱纯化重组NetB，1 8 稀释(图4d)。netB基因的缺失(或删除)消除了在细胞培养基分析中的杀灭活性。具有克隆到 质粒上的基因的突变体的互补作用恢复了杀灭活性。重组NetB蛋白杀死了培养的细胞。实施例5.由毒素蛋白杀死的细胞的定量分析为了测定NetB杀死细胞的能力，在用NetB处理的LMH细胞上实施乳酸脱氢酶细 胞毒性分析。将LMH细胞培养直至在以0. 2%白明胶涂覆并在37°C下于EMEM介质中生长 的96孔板中达到70%汇合。将来自NE18-M1的半纯化NetB加入到整个孔板用2倍稀释的 介质中高达1 128，并在37°C下孵育4h。将在上清液中释放的LDH作为细胞溶解的指示 剂(或指征)采用Cyto-ToHPromega)试剂盒进行测定，而以细胞毒性百分数给出。每次 稀释按一式三份完成，对每次稀释计算SEM (图5)。实施例6.在家鸡疾病模型中的netB突变菌株将20和2 1天龄的11只鸟组用产气荚膜梭菌(NE18)野生型菌株或netB缺失的 菌株的突变体(NE18-NetB-Ml和NE18-NetB-M2)进行免疫性试验(challenge)。在24天龄， 将鸟尸体解剖而对肠道中的坏疽病变打分。将测定的约2 4cm的回肠或空肠的片段收集 到10%中性磷酸钠缓冲的福尔马林中。将小肠样品以4mm的间隔截取(cross-sectioned)， 并将片段加工处理成石蜡嵌埋块用于常规组织学分析，并以4 5 μ m切割并用苏木精和署 红(HE)染色。将组织学载玻片通过光学显微镜检测。对肠道根据坏疽病变的数目进行评 分0_没有病变，1-薄壁化和易碎肠，2-病灶性坏死或溃疡(1 5个病灶)，3-病灶性坏 死或溃疡(6 15个病灶)，4-病灶性坏死或溃疡(16或更多个病灶)，5-坏疽块2 3cm 长，6-弥漫性坏死典型现场病例。野生型菌株显示出显著的致病水平，而独立地分离突变体 二者都未显示出任何致病迹象。我们推断，NetB是疾病发病机理中必要的关键毒性因子。表2 NetB突变体菌株在家鸡疾病模型中具有下降的毒性 实施例7.产气荚膜梭菌菌株中毒素的观测X仔一气ι·草纏纖PCR MHI通过PCR研究了 netB基因在产气荚膜梭菌的NE和非-NE菌株中的存在。对于试 验的每一产气荚膜梭菌菌株，将单菌落悬浮于0. ImL蒸馏水中并煮沸lOmin，然后以IOOOOg 离心lOmin。收集上清液并用作PCR中的模板DNA。PCR在含有以下物质的总量为25 μ L反 应混合物中实施1 XPCR缓冲液(无Mg2+) ；2. 5mM MgCl2 ；0. 2mM dNTP混合物；2. 5单位的 Go Taq DNA聚合物酶(Promega) ；50Pm的引物AKP78和AKP79 ；以及5 μ L模板溶液。以下 条件用于PCR中在94°C下变性2min ；在94°C下变性30s的35个循环；在55°C下退火30s ； 和在72°C下延伸Imin ；在72°C下最后延伸12min。将PCR产物通过在如图6所示的1.5% 琼脂糖凝胶上进行电泳分离而进行分析a. NE菌株；b. Non-NE菌株。在从坏疽肠炎病家鸡 中分离出来的大多数产气荚膜梭菌菌株中都看到了 384bpnetB片段。在任何其它菌株中都 没有观察到netB特异性PCR片段。这表明netB基因的存在是家鸡中产气荚膜梭菌毒性的 良好指示剂(或指征)，而这种分析法能够用于检测潜在的毒性菌株。X寸輔一气ι·草纏纖迹删产气荚膜梭菌菌株在预煮沸的TPG汤内生长直至0D600nm为 0. 6。培养基上清液 通过以18000g离心IOmin后获得。将上清液通过SDS-PAGE ( NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris gel, Invitrogen)在 MES SDS 工作缓冲液(NuPAGE MES SDS Running Buffer, Invitrogen)中分离。将蛋白转移到PDVF(Millipore)膜上并用兔多克隆抗-rNetB 抗体(Chemicon，USA)探测。将印迹用ECL蛋白质印迹试剂盒(Amersham Biosciences,NJ, USA)显影，如图7所示将结果记录于自体放射照相胶片上。括号表示NE和非-NE产气荚膜 梭菌菌株。蛋白质印迹试验结果证明了 PCR观测结果-基因和蛋白出现在大多数NE衍生 菌株而不是非-NE菌株中。这种基于抗体的检测方法是检测潜在毒性菌株的另一途径。实施例8.重组NetB子单元疫苗的保护效能
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重组NetB蛋白(SEQ ID NO 2)的效能当作为子单元疫苗递送时在接种试验中进 行测试。接种试验1193-4将Ross 308肉鸡(Aviagen)用50 μ g作为每剂量抗原的重组NetB/以0. 5mL氢 氧化铝作为佐剂进行接种。这种家禽以7天和14天接种，而以20天和21天用1. 5mL 口服 剂量的产气荚膜梭菌菌株EHE-NE18进行免疫性试验。为了提高这种家禽对坏疽肠炎的易 感性，在免疫性试验期间对其喂食含有鱼肉的高蛋白饮食。在第25天这些家禽进行安乐死 并尸检以对坏疽肠炎肠道病变打分。病变根据以下方案打分0 没有病变1薄壁化易碎肠2病灶性坏死或溃疡(1 5个病灶)3病灶性坏死或溃疡(6 15个病灶)4病灶性坏死或溃疡(16或更多个病灶)5 坏疽块2 3cm长6弥漫性坏死的典型现场病例MM用NetB重组抗原接种的家鸡和佐剂对照家鸡的平均病变得分提供于表3中。表3.用NetB重组抗原接种的家鸡的平均病变得分 采用Marm-Whitney检验进行病变得分的统计分析，表明NetB接种分组和佐剂对 照分组之间的差异在大于95%的置信度下是统计显著性的。实施例9.来自接种家禽血清的蛋白质印迹分析来自接种家鸡的血清通过蛋白质印迹法分析而确定家鸡是否对NetB蛋白产生了 血清抗体。在每孔聚丙烯酰胺凝胶中上样4yg的重组NetB抗原并进行SDS-PAGE。将蛋白 通过蛋白质印迹转移到PVDF膜中。将来自接种家禽的血清在5 %脱脂奶于TBS/0. 5 %吐温 20中稀释1 1000，并用膜在室温下孵育lh。将膜用TBS/0. 5% Tween 20冲洗3次，并随 后用在5%脱脂奶于TBS/0. 5%吐温20中稀释1 10，000的山羊抗家鸡HRP抗体(KPL ； Cat#14-24-06 ；Lot#050860)室温下孵育lh。随后，将孵育的膜用TBS/0. 5%吐温20冲洗3次。用GE Healthcare ECL蛋白质印迹试剂(Cat#RPN2106)根据厂商说明书检测HRP-标 记的二抗。用重组NetB接种的大多数家禽都对NetB蛋白产生了血清抗体(图8)，这表明 所使用的疫苗能够诱发对NetB抗原的显著免疫应答。实施例10.接种和免疫性试验程序的重复接种试验1219-1对在试验1193-4中产生的结果通过采用单独制备的各批重组NetB蛋白重复接种 和免疫性试验程序而测试再现性。将重复试验的结果提供于表4中。表4. NetB接种组对佐剂对照 采用Marm-Whitney检验进行病变得分的统计分析，表明NetB接种分组和佐剂对 照分组之间的差异在大于95%的置信度下是统计显著性的。接种试验1250-1按照前述试验采用相同的接种和免疫性试验方案，在尸检时测定家禽的活体体 重。将每一阴性对照、阳性对照和NetB接种家禽的平均重量提供于表5中。表5. NetB接种家禽的活体体重对阳性对照分组的活体体重
(NE18免 疫性试验)2291485. 7采用家禽重量的未配对t-检验进行统计分析，表明NetB接种分组和阳性对照分 组在大于99%的置信度(P = 0. 0004685)下重量差异是统计学显著性的。接种家禽受到保 护而免于在未受保护、阳性对照免疫性试验家禽中所见的体重增益的限制。
35
实施例11.可替代NetB基疫苗的保护效能在接种试验1250-1中，对许多可替代疫苗进行了试验。可替代疫苗有菌苗 +NetB ；表达NetB的大肠杆菌活体载体；和活体产气荚膜梭菌(netB缺失体)。以下描述可 替代疫苗，而接种家禽的活体体重对阳性对照组的活体体重提供于表6中。菌苗 +NetB制备产气荚膜梭菌菌株EHE_NE18(400ml TPG)的过夜培养基。将培养基离心，并 保留细胞颗粒和上清液部分。将细胞颗粒再悬浮于20M1的磷酸盐缓冲的盐水中，超声破 碎细胞，然后用0. 3%的甲醛处理。将上清液通过超滤浓缩至20mL，然后用0. 3%的甲醛处 理。将所处理的细胞颗粒、上清液和佐剂溶液等体积混合并加入重组NetB蛋白至最终浓度 为100 μ g/mL。采用每只家禽每次接种为皮下接种0. 5mL如此配制的疫苗。表汰NetB的大肠杆菌活体载体将大肠杆菌菌株CCEC31rn (如WO 2007/025333中所描述的)采用表达来自其天 然启动子的netB的质粒来转化。NetB由该质粒组成性地表达。在第2天使每只家禽口服 剂量为0. 5mL的过夜培养基(Luria汤)。活体产气荚膜梭菌(netB缺失体)将产气荚膜梭菌EHE-NE18的netB缺失突变体衍生物在液体巯基醋酸盐 (thoiglylate)汤中生长，并对2天龄家禽口服接种0. 5mL。表6.接种家禽的活体体重对阳性对照分组的活体体重 采用家禽重量的未配对t-检验进行统计分析，表明菌苗+NetB接种分组和阳性对 照分组在大于99%的置信度(P = 0. 003879)下重量差异是统计学显著性的，表达NetB的 大肠杆菌活体载体接种分组和阳性对照分组在大于95%的置信度(P = 0. 0217605)下重量 差异是统计学显著性的，而用缺失netB基因接种的活体产气荚膜梭菌接种分组和阳性对 照分组在大于99%的置信度(P = 0. 0003855)下重量差异是统计学显著性的。这些结果表 明不同的疫苗都能保护家禽免于在未接种的免疫性试验家禽中所见的体重增益的限制。在本领域的技术人员应该理解到，对本发明可以作出如具体实施方式
所示的各种 变化和/或修改，而不偏离广泛描述的本发明的精神或范围。因此，本发明的实施方式应该 被当作各个方面的举例说明，而不是限制性的。本文中所讨论的和/或参考的所有出版物都以其全文结合于此。
本申请要求享有美国专利US 60/942，858的优先权，将其全部内容结合于此作为参考。任何已经包含于本说明书中的文档、行为、物质、设备、制品等的讨论都是作为单 独目的提供于本发明的上下文。这不能以此为允诺，因为这在本申请的每一权利要求的优 先权日之前都业已存在，任何或所有这些物质构成现有技术基础的一部分或在关于本发明 的领域内是常用的一般性知识。参考文献Altschul, et al. (1997)Nucleic Acids Res，25 :3389_3402·Awad, et al. (1995)Mol Microbiol, 15 191-202.Bendtsen, et al. (2004)J Mol Biol, 340 :783_795·Bhugaloo-Vial，et al. (1996)Appl Environ Microbiol,62 4410-4416.Boman, (1995)Annu Rev Immunol,13 61-92.Boman, (2003) J Intern Med, 254 :197_215·Cardoso, et al. (1996). Virology, 225 :293_9.Cho, et al. (2000)Curr Microbiol,40 :257_263.Conry, et al. (1994). Cancer Research, 54 1164-68.Cowen, et al. (1987)Avian Dis，31 :904_906.Craven, et al. (1999)Avian Dis，43 484-490.Ennahar et al. (2000)FEMS Microbiol Rev,24 :85-106.Fynan, et al. (1993)Proc Natl Acad Sci USA, 90 11478-82.Gabay, et al (1989)Proc Natl Acad Sci USA, 86 10183.Gruber et al. (1994) J Immunol 152:5368.Harayama, (1998)Trends Biotechnol，16 :76_82.Hollinger et al. (1993)Proc Natl Acad Sci USA 90 :6444_6448.Hood and Jilka(1999)Current Opinions in Biotechnology, 10 :382-6.Ingham, et al. (2003)J Antimicrob Chemother,51 :1365—1371.Jack, et al. (1995)Microbiol Rev,59 171-200.Kaldhusdal, (1999) FEMS Immunol Med Microbiol, 24 :337-343.Kapustra, et al. (1999)FASEB Journal, 13 :1796-99.Kozbor et al. (1985)J Immunol Methods,81 :31-42.Liu, et al. (2005)Appl Environ Microbiol,71 :6769_6775.Milstein and Cuello, (1983)Nature,305 :537-539.Modelska, et al. (1998). Proc Natl Acad Sci USA,95 :2481-85.Montgomery, et al. (1993)DNA and Cell Biology, 12 :777_83.Morrison(1994)Nature 368:812-13.Munson and Pollard, (1980)Anal Biochem, 107 -.220.Myers and Miller(1989)CABI0S，4 :11_17.Nahashon，et al. (1994)Poult Sci，73 :1552—1562.Needleman，and Wunsch, (1970) J Mol Biol,48:443—453.
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权利要求
一种基本纯化的和/或重组的多肽，其中所述多肽含有i)按照SEQ ID NO2或SEQ ID NO3提供的氨基酸序列；ii)至少40％相同于SEQ ID NO2和/或SEQ ID NO3的氨基酸序列，和/或iii)i)或ii)的生物活性片段和/或抗原片段。
2.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽具有毒素活性。
3.根据权利要求1所述的多肽，其中所述多肽与由SEQID NO :2和/或SEQ ID NO 3 编码的多肽相比具有降低的毒素活性。
4.根据前述权利要求任一项所述的多肽，其中所述多肽含有至少90%相同于SEQID NO :2和/或SEQ ID NO 3的氨基酸序列。
5.根据前述权利要求任一项所述的多肽，其中所述多肽能够由所述梭状芽孢杆菌属的 细菌进行纯化。
6.权利要求5所述的多肽，其中所述多肽能够由产气荚膜梭菌进行纯化。
7.根据前述权利要求任一项所述的多肽，其中所述多肽是类毒素。
8.根据前述权利要求1至7任一项所述的多肽，其是含有至少一种其它多肽序列的融合蛋白ο
9.一种分离的和/或重组的多核苷酸，含有i)根据SEQID NO 1提供的核苷酸序列，ii)编码根据权利要求1至8任一项的多肽的核苷酸序列，iii)至少40%相同于SEQID NO=I的核苷酸序列，和/或iv)在严格条件下与i)至iii)任意之一杂交的序列或其反相互补序列。
10.一种载体，含有根据权利要求9所述的多核苷酸。
11.根据权利要求10所述的载体，其中所述多核苷酸可操作地连接于启动子。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的载体，其是一种病毒载体或质粒载体。
13.一种宿主细胞，含有根据权利要求1至8任一项所述的多肽、根据权利要求9的多 核苷酸和/或根据权利要求10至12任一项所述的载体。
14.根据权利要求13所述的宿主细胞，其是一种细菌。
15.根据权利要求14的宿主细胞，其中所述细菌是大肠杆菌。
16.一种用于生产根据权利要求1至8任一项所述的多肽的方法，所述方法包括对根据权利要求13至15任一项所述的宿主细胞或编码所述多肽的根据 权利要求10至12任一项所述的载体在容许表达编码所述多肽的所述多核苷酸的条件下进 行培养。
17.根据权利要求16所述的方法，进一步包括分离所述多肽。
18.—种基本纯化的抗体，所述抗体特异性地结合于根据权利要求1至8任一项所述的多肽。
19.一种组合物，含有根据权利要求1至8任一项所述的多肽、根据权利要求10至12 任一项所述的载体、根据权利要求13至15任一项所述的宿主细胞、和/或根据权利要求18 所述的抗体。
20.根据权利要求19所述的组合物，其是一种免疫原的组合物。
21.根据权利要求20所述的免疫原的组合物，进一步含有佐剂和/或药用载体。
22.—种含有抗原的疫苗，其中所述抗原含有根据权利要求1至8任一项所述的多肽。
23.根据权利要求22所述的疫苗，进一步含有佐剂和/或药用载体。
24.根据权利要求23或权利要求24所述的疫苗，进一步含有一种或多种附加抗原。
25.—种DNA疫苗，含有编码根据权利要求1至8任一项所述的多肽的多核苷酸。
26.—种生产含有至少40%相同于SEQ ID NO :2和/或SEQ IDNO :3的氨基酸序列的 减毒细菌，其中与野生型细菌相比所述细菌生产降低量的所述多肽和/或与野生型细菌中 的所述多肽相比具有降低的毒素活性。
27.根据权利要求26所述的减毒细菌，其并不表达所述多肽。
28.根据权利要求26或27任一项所述的减毒细菌，其进一步经过改性而表达异源多肽。
29.根据权利要求28所述的减毒细菌，其中所述异源蛋白是生物活性多肽或抗原。
30.一种削弱表达含有至少40%相同于SEQ ID NO :2和/或SEQ IDNO 3的氨基酸序 列的多肽的细菌毒性的方法，所述方法包括突变多核苷酸序列而降低所述多肽的所述表达 和/或毒素活性，由此所述减毒细菌与未减毒的细菌相比具有降低的毒素活性。
31.一种提高受试者体内免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者给予根据权利 要求1至8任一项所述的多肽、根据权利要求9所述的多核苷酸、根据权利要求10至12任 一项所述的载体、根据权利要求13至15任一项所述的宿主细胞、根据权利要求19至21任 一项所述的组合物、根据权利要求22至25任一项所述的疫苗和/或根据权利要求26至29 任一项所述的细菌。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述宿主细胞或细菌是活的。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中所述多肽、多核苷酸、组合物、载 体、宿主细胞或细菌是在卵内递送的。
34.一种确定受试者是否已经被暴露于表达含有至少40%相同于SEQ ID N0:2和/或 SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多核苷酸的病原体的方法，其中所述方法包括检测从所述受 试者获取的样品中存在或不存在所述多肽，其中所述多肽的所述存在是暴露于所述病原体 的指征。
35.一种检测受试者是否已经被暴露于表达含有至少40%相同于SEQ ID N0:2和/或 SEQ ID NO :3的氨基酸序列的多肽的病原体的方法，其中所述方法包括检测样品中特异性 结合于根据权利要求1至8任一项所述的多肽的抗体存在或不存在，其中所述抗体的所述 存在是暴露于所述病原体的指征。
36.一种检测受试者是否已经被暴露于表达含有至少40%相同于SEQ ID N0:1的核苷 酸序列的多核苷酸的病原体的方法，其中所述方法包括检测由所述受试者获得的样品中存 在不存在所述多核苷酸，其中所述多核苷酸的所述存在是暴露于所述病原体的指征。
37.根据权利要求31至36所述的方法，其中所述受试者是禽类。
38.根据权利要求37所述的方法，其中所述受试者是家禽。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述受试者是家鸡。
40.一种筛选用于调节根据权利要求2的多肽的所述活性的激动剂或拮抗剂的方法， 所述方法包括将根据权利要求1至8任一项所述的多肽与候选化合物接触，并确定所述化 合物是否增加或减少根据权利要求2所述多肽的毒素活性。
41.一种测试样品毒素活性的方法，所述方法包括(a)将疑似含有根据本发明权利要求1至8任一项所述的多肽的样品分成至少第一和第二子样品，(b)将所述第一子样品与根据权利要求1至8任一项所述的多肽的拮抗剂接触，以及(c)检测所述第一和第二子样品是否具有毒素活性，其中在所述第一子样品中缺乏毒 素活性和在所述第二样品中存在毒素活性是至少40%相同于SEQ ID NO :2和/或SEQID NO 3的多肽存在的指征。
42.根据权利要求41所述的方法，其中步骤(c)包括独立地用动物细胞在各种条件下 孵育所述第一和第二子样品一段时间而足以使所述多肽产生细胞病理效应，并检测在所述 细胞上是否存在或不存在细胞病理效应。
43.根据权利要求41或42所述的方法，其中所述拮抗剂是一种抗体。
44.含有根据权利要求1至8任一项所述多肽的拮抗剂的食物和/或饮料。
45.根据权利要求44所述的食物和/或饮料，其中所述拮抗剂是一种根据权利要求18 所述的抗体。
46.根据权利要求44或权利要求45所述的食物和/或饮料降低由表达含有至少40% 相同于SEQ ID NO :2和/或SEQ ID NO 3的氨基酸序列的多肽的细菌对动物发生感染和/ 或群集的用途。
47.一种含有编码根据权利要求1至8任一项所述多肽的外源性多核苷酸的非人基因 转移生物。
48.根据权利要求17所述的非人基因转移生物，其是一种植物。
49.一种含有根据权利要求1至8任一项所述的多肽的食物和/或饮料。
50.一种提高受试者体内对抗根据权利要求1至8任一项所述多肽的免疫应答的方法， 所述方法包括向所述受试者口服给予根据权利要求47或权利要求48的所述非人基因转移 生物和/或根据权利要求49的所述食物或饮料。
51.一种提供雌禽的后代被动免疫的方法，所述方法包括在所述雌禽产下含有所述后 代的卵之前向所述雌禽给予根据权利要求1至8任一项所述的多肽、根据权利要求9所述 的多核苷酸、根据权利要求10至12任一项所述的载体、根据权利要求13至15任一项所述 的宿主细胞、根据权利要求19至21任一项所述的组合物、根据权利要求22至25任一项所 述的疫苗、根据权利要求26至30任一项所述的减毒细菌、根据权利要求47或权利要求48 所述的非人基因转移生物和/或根据权利要求49所述的食物和/或饮料，由此为所述后代 提供对表达含有至少40%相同于SEQ ID NO :2和/或SEQ ID NO 3的氨基酸序列的多肽 的细菌产生被动免疫。
52.根据权利要求1至8任一项所述的多肽、根据权利要求9所述的多核苷酸、根据权 利要求10至12任一项所述的载体、根据权利要求13至15任一项所述的宿主细胞、根据权 利要求19至21任一项所述的组合物、根据权利要求22至25任一项所述的疫苗、根据权利 要求26至30任一项所述的减毒细菌、根据权利要求47或权利要求48所述的非人基因转 移生物和/或根据权利要求49所述的食物和/或饮料在生产用于提高受试者体内免疫应 答的医药中的用途。
53.根据权利要求1至8任一项所述的多肽、根据权利要求9所述的多核苷酸、根据权利要求10至12任一项所述的载体、根据权利要求13至15任一项所述的宿主细胞、根据权 利要求19至21任一项所述的组合物、根据权利要求22至25任一项所述的疫苗、根据权利 要求26至30任一项所述的减毒细菌、根据权利要求47或权利要求48所述的非人基因转 移动物和/或根据权利要求49所述的食物和/或饮料作为用于提高受试者体内免疫应答 的医药中的用途。
全文摘要
本发明涉及一种基于源于产气荚膜梭菌毒素的多肽。本发明进一步涉及含有这种毒素的免疫原组合物以及对动物如家鸡进行接种的方法，使得它们不易于患上梭菌病。本发明还公开了用以检测动物是否被暴露于毒素、编码毒素的多核苷酸以及表达毒素活性降低或毒性更少形式的减毒细菌的方法。
文档编号A61K38/16GK101903399SQ200880019023
公开日2010年12月1日 申请日期2008年6月6日 优先权日2007年6月8日
发明者安东尼·莱斯利·凯伯恩, 朱利安·艾安·鲁德, 罗伯特·约翰·穆尔 申请人:澳大利亚家禽Crc私人有限公司