专利名称：艰难梭菌肠毒素a、b双重荧光定量pcr检测方法及检测用试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物医学领域，特别是涉及艰难梭菌肠毒素A、B的检测方法及检测用试剂盒。
背景技术：
艰难梭菌(Clostridium difficile)是具有芽胞结构的革兰氏阳性厌氧杆菌,是公认的院内感染和抗生素相关性腹泻最重要的病原体，通过释放细胞毒素可引起伪膜性肠炎，甚至可致死。艰难梭菌可释放多种毒素，其中以A、B两种毒素为主，这两种毒素是导致腹泻与肠炎症的主要原因。艰难梭菌实验诊断方法主要依靠传统的厌氧培养、细胞毒性试验、菌体及毒素抗 原检测。其中，细菌厌氧培养和细胞毒素中和实验是目前实验室检测艰难梭菌的“金标准”。细菌培养是传统检测方法中最灵敏的方法，但是必须进行二次检测以判断产物毒素是否存在，并且需要进行细胞毒素试验以验证是否为产毒艰难梭菌。该试验的特异性和灵敏性较好，但是条件设备要求高，还需要专业的细胞培养技术和连续的组织培养，仅培养时间至少需要24h以上，影响临床做出及时诊断和治疗。因此传统方法在日常监控、暴发事件病原体确定和溯源追踪等方面存在着瓶颈。随着免疫学和分子生物学的发展，近二十年来一系列的快速检测方法被应用到微生物的检测和鉴定中。这些快速检测方法能够在48小时内得到结果。现阶段研究较为深入的快速检测方法包括酶联免疫吸附(ELISA)。谷氨酸脱氢酶(GDH)为艰难梭菌表面大量表达的抗原性酶蛋白，但免疫酶学试验无法区分艰难梭菌产毒株与非产毒菌株。另外，目前商品化免疫学的艰难梭菌毒素诊断产品只能检测A毒素，这导致临床A-B+艰难梭菌引发的许多患者漏诊，使A-B+型艰难梭菌引起的严重感染和爆发报道增多。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一是提供一种艰难梭菌肠毒素A、B双重荧光定量PCR检测方法，它可以快速、简便地检测艰难梭菌，且检测的灵敏性和特异性高。为解决上述技术问题，本发明的艰难梭菌肠毒素A、B双重荧光定量PCR检测方法，步骤包括I)提取待测样品DNA ；2)以待测样品DNA为模板，进行荧光定量PCR反应；3)对PCR反应中每个循环产物的荧光进行检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度，判断待测样品中是否含有艰难梭菌肠毒素A、B。本发明要解决的技术问题之二是提供用于上述方法的特异性扩增艰难梭菌肠毒素A基因的引物对。该引物对的上游引物具有如SEQ ID No: I所示的序列或其互补序列，下游引物具有如SEQ ID No:2所示的序列或其互补序列。
本发明要解决的技术问题之三是提供用于上述方法的特异性扩增艰难梭菌肠毒素B基因的引物对。该引物对的上游引物具有如SEQ ID No:4所示的序列或其互补序列，下游引物具有如SEQ ID No:5所示的序列或其互补序列。本发明要解决的技术问题之四是提供用于上述方法的特异性检测艰难梭菌肠毒素A的荧光探针。该探针具有如SEQ ID N0:3所示的序列，序列的两端分别带荧光基团和淬灭基团。本发明要解决的技术问题之五是提供用于上述方法的特异性检测艰难梭菌肠毒素B的突光探针。该探针具有如SEQ ID N0:6所不的序列,序列的两端分别带突光基团和淬灭基团。本发明要解决的技术问题之六是提供用于上述检测方法的试剂盒。该试剂盒包括有上述特异扩增艰难梭菌肠毒素A、B基因的引物对和特异检测艰难梭菌肠毒素A、B的荧光探针。与现有检测方法相比，本发明的双重荧光定量PCR检测方法，不仅能检测艰难梭菌肠毒素A，而且能同时检测艰难梭菌肠毒素B，从而有助于临床对由A-B+艰难梭菌引发的患者的及时诊断，减少A-B+型艰难梭菌引起的严重感染。另外，本发明的检测方法不仅操作简便、快速，而且检测的灵敏性和特异性高，可应用于艰难梭菌引起突发疫情的实验室应 急检测。
图I是艰难梭菌肠毒素A的荧光qPCR扩增曲线图。曲线I至5依次为100000、10000、1000、100、10 拷贝数。图2是艰难梭菌肠毒素A的荧光qPCR定量标准曲线。图3是艰难梭菌肠毒素B的荧光qPCR扩增曲线图。曲线I至5依次为100000、10000、1000、100、10 拷贝数。图4是艰难梭菌肠毒素B的荧光qPCR定量标准曲线。
具体实施例方式为对本发明的技术内容、特点与功效有更具体的了解，现结合附图，详述如下实施例II.实验材料I. I细菌株与待测样品肠道腺病毒40/41、星状病毒和札如病毒的阳性核酸(均通过基因测序鉴定)来源于江苏省疾病控制预防中心。待测样品来源于近期江苏省患者的粪便样本，样本采集后带冰运送到实验室。I. 2引物与探针从美国的NCBI基因库上下载世界各地的艰难梭菌肠毒素A、B基因序列，对其进行同源性比较，在对应病毒基因组的保守基因区设计特异性引物与Taqman荧光探针，具体序列如下针对肠毒素A基因的特异性引物和探针
上游引物Toxa-FP :TTTTATGCCAGAAGCTCGCT (SEQ ID No: I)下游引物Toxa-RP :AATCTGATGCTTTTAAAGTTTTTTC (SEQ ID No:2)特异性探针Toxa-P :FAM-AGTGGTCCAGGAGCTTATGCATCAGC-BHQ1 (SEQ ID No:3)针对肠毒素B基因的特异性引物和探针上游引物Toxb-FP :ACTTTGGAATGATGGTATCTGGA (SEQ ID No:4)
下游引物Toxb-RP :AATTGAAGCAGCTCCACCAT (SEQ ID No:5)特异性探针Toxb-P :HEX-CTGGATTTGTGACTGTAGGCGATGA-BHQ1 (SEQ ID No:6)上述弓I物和探针由上海辉睿生物科技有限公司合成。2.实验方法2. I提取待测样品DNA采用上海辉睿生物科技有限公司的DNA Mini KU，按试剂盒说明书提取待测样品的DNA，得到102ng/ μ L细菌DNA，储以备用。2. 2 荧光 qPCR 反应以待测样品DNA为模板，选用上海辉睿生物科技有限公司的HR qPCR Master Mix(Code =HR-RTO 1-50)为缓冲液，进行qPCR (实时荧光定量聚合酶链式扩增反应)反应，分别对艰难梭菌肠毒素A、B的基因进行扩增。PCR 反应体系为 25 μ 1，其中2XHR qPCR Master Mix 12. 5 μ 1，上、下游引物(lOymol/L)各 I μ l,10ymol/L 探针 O. 5 μ 1，DNA 模板 2-3 μ 1，DEPC 水补足 25 μ I。PCR反应条件为95°C 5min ;然后95°C 10s，55°C 40s，共进行40个循环。在PCR反应中每个循环的55°C用ABI7500荧光检测系统对qPCR反应产物进行双重荧光检测。荧光检测模式选择FAM、VIC，荧光基线调整取3-15个循环的荧光信号平均值，阈值设定以阈值线刚好超过正常阴性对照品的最高点。2. 3结果判定根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度，判断待测样品是否含有艰难梭菌肠毒素A、B。若荧光检测结果呈典型的扩增曲线，如图1、3所示，判断为阳性，所测样品含有对应的肠毒素；若没有典型的扩增曲线，判断为阴性，所测样品不含对应的肠毒素。3.荧光qPCR特异性、敏感性和重复性试验3. I特异性实验选择肠道腺病毒、星状病毒和札如病毒的阳性核酸(均通过基因测序鉴定)和来源于近期江苏省腹泻患者的临床粪便标本，对上述样本提取核酸，用本发明的双重荧光qPCR方法进行检测，验证方法的特异性。结果显示，近期采集的腹泻患者的粪便标本检测出阳性反应，而其他肠道细菌则没有交叉反应，表明本发明建立的双重荧光qPCR方法对艰难梭菌肠毒素A、B具有较好的特异性。3. 2敏感性实验用梯度浓度的标准品DNA溶液，在相同条件下进行PCR扩增反应，以标准品DNA溶液拷贝浓度的对数值为横坐标，标准品Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。根据样品DNA测得的Ct值，对照标准曲线，获得样品DNA的拷贝浓度。标准品的序列如下Toxa
ttttatgccagaagctcgctccacaataagtttaagtggtccaggagcttatgcatcagcttactatgatttcataaatttacaagaaaatactatagaaaaaactttaaaagcatcagatt (SEQ ID No:7)Toxb actttggaatgatggtatctggattaatatatattaatgatteattatattattttaaaccaccagtaaataatttgataactggatttgtgactgtaggcgatgataaatactactttaatccaattaatggtggagctgcttcaatt (SEQ IDNo:8)对已标定拷贝数(2X108COpieS/ml)的肠道腺病毒、星状病毒和札如病毒，分别稀释100000、10000、1000、100、10倍后，平行进行荧光qPCR反应。结果显示，荧光qPCR方法检测敏感性达到2X 10Copies/ml。3.3重复性实验取浓度为2X107Copies/ml的艰难梭菌，按10倍梯度稀释成3个不同的浓度，对 每一个浓度的病毒稀释液作5次重复检测，得到的Ct值计算标准差，验证方法的重复性。结果显示，不同核酸浓度各自的检测Ct值标准差在O. 10 O. 31之间，具有较好的重复性(见表I)。表I荧光RT-PCR法检测艰难梭菌的重复性试验
权利要求
1.艰难梭菌肠毒素A、B双重荧光定量PCR检测方法，其特征在于，包括以下步骤 1)提取待测样品DNA; 2)以待测样品DNA为模板，进行荧光定量PCR反应； 3)对PCR反应中每个循环产物的荧光进行检测，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光強度，判断待测样品中是否含有艰难梭菌肠毒素A、B。
2.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，PCR反应体系为2XHRqPCR MasterMixl2. 5iil，10iimol/L 上、下游引物各 I yl，10 y mol/L 荧光探针 0. 5 yl，DNA 模板2-3 u I, DEPC 水补足 25 u I0
3.根据权利要求I所述的方法，其特征在于，PCR反应条件为95°C5min ;然后95°C10s，55で40s，共40个循环。
4.用于特异扩增艰难梭菌肠毒素A基因的引物对，其特征在于，该引物对的上游引物具有如SEQ ID No: I所示的序列或其互补序列，该引物对的下游引物具有如SEQ ID No:2所示的序列或其互补序列。
5.用于特异扩增艰难梭菌肠毒素B基因的引物对，其特征在于，该引物对的上游引物具有如SEQ ID No:4所示的序列或其互补序列，该引物对的下游引物具有如SEQ ID No:5所示的序列或其互补序列。
6.用于特异检测艰难梭菌肠毒素A基因的荧光探针，其特征在干，该探针具有如SEQIDN0:3所示的序列，序列的两端分别带荧光基团和淬灭基团。
7.用于特异检测艰难梭菌肠毒素B基因的荧光探针，其特征在干，该探针具有如SEQIDN0:6所示的序列，序列的两端分别带荧光基团和淬灭基团。
8.用于权利要求1-3任何ー项所述检测方法的试剂盒，其特征在于，包括权利要求4和5的引物对，以及权利要求6和7的探针。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括用作阳性质控品的艰难梭菌肠毒素A、B基因标准品。
10.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，还包括脱氧三磷酸核苷混合物、氯化镁、DNA聚合酶。
全文摘要
本发明公开了一种艰难梭菌肠毒素A、B双重荧光定量PCR检测方法，步骤包括1)提取待测样品DNA；2)以待测样品DNA为模板，进行荧光定量PCR反应；3)对PCR反应中每个循环产物的荧光进行荧光，根据荧光检测的最低Ct值和最高荧光强度，判断待测样品中是否含有艰难梭菌肠毒素A、B。本发明还公开了用于上述方法的特异引物、荧光探针和检测用试剂盒。本发明的检测方法操作简便、快速，能同时检测艰难梭菌肠毒素A、B，且检测灵敏性和特异性高，可应用于艰难梭菌引起突发疫情的实验室应急检测。
文档编号C12N15/11GK102952886SQ201210496620
公开日2013年3月6日 申请日期2012年11月28日 优先权日2012年11月28日
发明者邵景东, 王毅谦, 李辉, 傅春玲, 吴福平, 郭旸 申请人:中华人民共和国张家港出入境检验检疫局