艰难梭菌毒素作为粘膜佐剂的制作方法

专利名称：艰难梭菌毒素作为粘膜佐剂的制作方法
背景技术：
本发明涉及粘膜佐剂艰难梭菌是一种产芽孢、产毒素的革兰氏阳性细菌、可导致与抗生素相关的腹泻，能进一步发展成严重的和有时为致命的结肠炎。通过例如抗菌或抗肿瘤治疗一旦破坏正常肠内菌群，艰难梭菌在结肠中定居并产生两种高分子量毒素，毒素A和毒素B。这两种多肽都是细胞毒素，但毒素B比毒素A强效1000倍。毒素A也是一种肠毒素，可导致已结扎的动物肠绊内的体液积累。发明概况我们已证明，当鼻内施用一种抗原时〔例如，幽门螺杆菌脲酶，卵白蛋白(OVA)，或钥孔血蓝蛋白(KLH)〕，艰难梭菌可以有效诱导对抗原的粘膜免疫应答。例如通过鼻内脲酶和一种艰难梭菌而诱导的对幽门螺杆菌的免疫应答是保护性的，防止螺杆菌感染。我们也证明，用一种艰难梭菌毒素A的非毒性衍生物与抗原进行鼻内给药，此毒素A包含构成碳水化合物连接区域的羧基末端重复，所产生一种粘膜免疫应答。此外，我们已证明直肠和阴道的免疫途径均为有效。因此，艰难梭菌毒素及其片段是有效的粘膜佐剂，可用于接种方法中。
因此，本发明以在哺乳动物中诱导对抗原的免疫应答(例如，一种粘膜免疫应答)的方法为特征。在此方法中，对哺乳动物施用抗原和来源于梭菌属细菌的具有佐剂活性(例如艰难梭菌，诺氏梭菌，索氏梭菌，产气荚膜梭菌，破伤风梭菌和肉毒梭菌)的毒素(例如艰难梭菌毒素A或B)，或其片段或衍生物〔例如，含部分或全部重复的一段羧基末端片段，此重复构成毒素A碳水化合物的结合区(ARll；见下面)〕。这些毒素可单抗与抗原施用或结合施用(例如抗原+毒素A+毒素B)。本发明方法可用来防止或减少未来感染的机会(例如诱导一种保护性免疫应答)和/或治疗已进行的感染(例如诱导一种治疗性的免疫应答)。
此处使用的一种“佐剂”，是一种与抗原一起进行施用时能增加对抗原的免疫应答的物质。此处所用的一种“毒素”，是一种毒性的或有毒的物质(例如细胞毒素)，在特定微生物和高等动植物的代谢和生长时期，以细胞或组织的组成部分(内毒素)，或细胞外产物(外毒素)或结合形式形成或修饰。
本发明所用的毒素可从细菌培养物(例如艰难梭菌培养物，见例如Lyerly等，FEMS Microbio.Lett. 3331-35，1986)中纯化，或用标准重组或化学合成方法生产制得。如果用重组DNA技术生产多肽，例如在异源的细菌、酵母或哺乳动物细胞中表达编码多肽的核酸，多肽描述为“重组体”。编码多肽的核酸包含在一个载体中，或整合到表达它的细胞染色体中(例如，Ausubel等，编，分子生物学现行方法，JohnWiley&Sons，Inc.，1994)。如果在体外用化学方法例如标准固相肽合成法生产蛋白质，蛋白质描述为“化学合成物”。用例如重组、合成或蛋白水解方法生产毒素片段。对于肽毒素，片段长度通常为至少20个氨基酸。特别有用的片段可能包含全部或部分羧基末端重复，此重复构成毒素A的碳水化合物的结合区。除保留佐剂活性外，本发明包括的毒素衍生物可能包含野生型毒素序列的突变，插入和/或缺失。
本领域技术人员容易理解，在生产用于本发明方法和组合物的毒素片段或衍生物时，保持佐剂活性的要求不如保持生物活性的要求严格。事实上，在生产本发明毒素片段或衍生物中，不需要保持毒素的生物活性(例如毒性)。
本发明所用毒素也能以融合蛋白的形式产生。融合蛋白是一种多肽，含相应两种或多种蛋白(或相应片段)的氨基酸序列，这些通常独立的蛋白通过肽键相连。融合蛋白通常由杂合基因表达而合成，杂合基因包含编码构成融合蛋白的每个单独多肽的核苷酸。本发明包括的一个融合蛋白实例是含与抗原，例如幽门螺杆菌脲酶融合的梭菌(例如艰难梭菌)毒素(例如艰难梭菌毒素A或B；或有佐剂活性的片段或衍生物)的蛋白。本发明包括的另一种融合蛋白类型包含与一个利于融合蛋白纯化的多肽〔例如谷胱甘肽S-转移酶(GST)〕融合的艰难梭菌毒素。本发明所用毒素也可以使用标准方法与抗原共价偶联或化学交联。
本发明也可以利用梭菌属类毒素作为佐剂。这种类毒素是经过处理的毒素(或毒素混合物，例如艰难梭菌毒素A和毒素B)，以便破坏或降低毒素的毒性特征，但保留抗原性。可通过标准方法生产本发明包括的类毒素，包括，但不限于，化学处理(例如甲醛或戊二醛)，蛋白酶分解和重组方法〔例如，生产毒素的片段或突变(例如点突变)〕。
保护性和/或治疗性免疫应答所需的任何抗原可与本发明佐剂进行施用。所获得抗原(可能是，例如亚基抗原，死亡的整个细胞，或细胞溶解产物)的微生物实例包括，但不限于，螺杆菌(例如幽门螺杆菌，猫螺杆菌，H.heilmanii)，弯曲杆菌(例如空肠弯曲杆菌)，梭菌(艰难梭菌)，白喉棒杆菌，百日咳杆菌，流感病毒，副流感病毒，呼吸道合胞体病毒，布氏疏螺旋体，疟原虫，单纯性疱疹病毒，人类免疫缺陷型病毒，乳头状病毒，霍乱病毒，大肠杆菌，麻疹病毒，风疹病毒，水痘-带状疱疹病毒，流行性腮腺炎，轮状病毒，志贺氏杆菌属，伤寒杆菌，淋病奈瑟氏菌，耶尔森氏菌，梅毒螺旋体，肝炎病毒和衣原体。此外，抗非微生物病原体的疫苗可与本发明佐剂同时施用，例如包含杀伤的肿瘤细胞或肿瘤细胞特异的或丰富的抗原。
本发明佐剂(与抗原一起)通过标准方法施用给病人。例如，给药到病人粘膜表面(例如鼻内，口，眼，胃，直肠，阴道，肠和尿道)。本发明组合物也可经非肠道途径施用(例如静脉内的，皮下的，腹膜内或肌内)。用本发明方法治疗的病人包括，但不限于哺乳动物如人、奶牛、马、猪、狗、猫、绵羊和山羊。
本发明也以一种组合物为特征，包含抗原和梭菌属的一种毒素(或多种毒素)(例如艰难梭菌，诺氏梭菌、索氏梭菌、产气荚膜梭菌、破伤风梭菌、肉毒梭菌)，或具佐剂活性的片段或衍生物，以药学上可接受的载体存在〔例如依据选择的免疫途径，可有水，盐溶液(例如磷酸缓冲盐溶液)，碳酸氢盐溶液(例如0.24M NaHCO3)，或以栓剂形式存在〕。以上描述了本发明组合物可能包含的毒素，并且毒素包括，例如艰难梭菌毒素A，艰难梭菌毒素B，艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B，或片段〔例如含重复片段的羧基末端片段，此重复构成毒素A(ARU)的碳水化合物结合区〕或具佐剂活性的衍生物。毒素可以是重组的，合成的，融合蛋白的一部分〔包括例如抗原(例如，幽门螺杆菌脲酶)或一个利于融合蛋白纯化的多肽(例如GST)〕，与抗原共价偶联，与抗原化学交联或类毒素性的(例如，产生较少毒性的，见上面)。上面已列举了本发明组合物所包含的与佐剂一起的抗原实例。
细菌毒素作为粘膜佐剂用途的普通概念并不新鲜。然而，过去报导的具佐剂活性的细菌毒素代表了密切相关的一类单一毒素，每个毒素包含多个结合区的多肽和具ADP-核糖转移酶酶活性的单一肽。这些毒素的毒性机理包含腺苷酸环化酶的糖基化作用，最终引起感染细胞内cAMP水平的升高。霍乱毒素(CT)和大肠杆菌不耐热毒素(LT)是这类佐剂的典型实例(Spangler等，微生物综述56(4)622-647，1992)，但这类群体也包括百日咳毒素。艰难梭菌毒素A和B的特征不如ADP核糖化毒素熟悉，但根据毒性机理〔例如当CT和LT促进ADP糖基化(见，例Spanger等，上文)时，艰难梭菌毒素诱导细胞骨架变化(见例如Siffert等，感染和免疫61(3)1082-1090，1993)〕，酶活性(艰难梭菌毒素不具有ADP-核糖转移酶活性)，和整体结构(艰难梭菌是单肽链，而LT和CT各含多链)而言，它们明确地代表了完全不同的一类毒素。这些差异对辅佐性机理是重要的，并可能影响粘膜应答的关键方面。粘膜应答中的变量包括，但不限于，佐剂的有效剂量，与效应物位置相关的诱导位置，参与的T协助因子亚型，抗体应答持续时间以及免疫应答记忆。
通常认为抗原的鼻内给药增加上呼吸道粘膜免疫应答(URT，见，例如McGhee等，感染剂和疾病，255-73，Raven Press，Ltd，New York)。我们已证明，除URT外，艰难梭菌佐剂(例如艰难梭菌毒素A和B)与抗原进行鼻内给药也能增加胃肠道和生殖-尿道中对抗原的粘膜免疫应答。因此，本发明佐剂的一个优点是，不像传统粘膜佐剂〔例如霍乱毒素(CT)〕，本发明佐剂经鼻内给药，能诱导肠和生殖-尿道中免疫应答。由此，当这些区域的应答主要防护或治疗感染疾病时，可以使用本发明佐剂。除鼻内途径外，也可用直肠或阴道途径。例如，本发明佐剂与合适的疫苗可以用于性传播感染疾病的预防和治疗(例如获得性免疫缺陷综合症、淋病和衣原体属)。
从下面优选实施方案和权利要求中可看出，本发明的其它特征和优点是显而易见的。
详细描述首先描述附图附1A和1B表示用卵白蛋白(OVA，

图1A)或钥孔血蓝蛋白(KLH，图1B)，结合艰难梭菌毒素A，大肠杆菌不耐热毒素(LT)或如图所示无佐剂进行鼻内免疫的小鼠样品中，抗原特异性血清IgG、血清IgA，唾液IgA、粪便IgA和阴道IgA水平。
图2是一系列附图，表示用脲酶(5μg)和指明的佐剂〔(PBS＝磷酸缓冲盐溶液)(无佐剂)，脲酶(无佐剂)；+CT＝脲酶+5μgCT(霍乱毒素)；+txd＝脲酶+15μgtxd(类毒素)；+toxA＝脲酶+0.2μg毒素A(艰难梭菌毒素A)；+toxb＝脲酶+1μgtoxB(艰难梭菌毒素B)；CT/CTB＝脲酶+5ng CT(霍乱毒素)和5μg CTB(霍乱毒素B亚单位)〕鼻内免疫的小鼠，其血清中脲酶特异性IgG水平和其血清、唾液、粪便和阴道分泌物中的脲酶特异性IgA水平。图中表示的平均重复读数(OD405)用最初抗体的单一稀释法(血清1∶100；粘膜样品1∶20)。抗体水平是每组5只动物的平均值。
图3表示鼻内施用脲酶(5μg)，结合用指明的佐剂，以及随后用毒性猫螺杆菌激发产生免疫的小鼠胃组织中脲酶活性(见上面图2描述)。在猫螺杆菌攻击后两周取胃组织样品。
图4A-4B表示根据表4中所列图解，用含毒素A(GST-ARU)羧基末端区域的融合蛋白免疫接种小鼠，用ELISA法测其血清(图4a)和唾液，粪便及阴道样品中抗艰难梭菌毒素A的IgG和IgA水平。
图5A-5B表示用指明的卵白蛋白+GST/ARU和/或毒素A鼻内免疫接种的小鼠中血清抗卵白蛋白IgA水平和血清IgG水平。棒表示每组5个小鼠的平均抗体水平，注明了标准误差(SD)。
图6A-6B表示用指明的卵白蛋白+GST/ARU和/或毒素A鼻内免疫接种的小鼠中唾液抗卵白蛋白IgA(图6A)水平和粪便IgA水平。棒表示每组5个小鼠的平均抗体水平，注明了标准误差(SD)。
图7A-7B表示用指明的卵白蛋白+GST/ARU和/或毒素A鼻内免疫接种的小鼠中阴道抗卵白蛋白IgA水平和阴道IgG水平。棒表示每组5个小鼠的平均抗体水平，注明了标准误差(SD)。
图8是一系列图，表示用指明的卵白蛋白，卵白蛋白+毒素A，或卵白蛋白+LT进行直肠(Rec)或阴道(Vag)免疫接种的小鼠，其抗卵白蛋白血清IgG水平，血清IgA水平，唾液IgA水平，直肠IgA水平，阴道IgA水平和阴道IgG水平。棒表示每组5个小鼠的平均抗体水平，注明了标准误差(SD)。艰难梭菌毒素作为粘膜佐剂的用途本发明提供了诱导对抗原的保护性和/或治疗性免疫应答的方法和组合物，包括用一种梭菌(例如，艰难梭菌)毒素多肽(例如艰难梭菌毒素A或B)，具佐剂活性的片段或衍生物〔例如毒素A的ARU片段，或其衍生物(见下面)〕，或一种艰难梭菌类毒素作为佐剂。下面描述集中在艰难梭菌毒素A，艰难梭菌毒素B和艰难梭菌类毒素作为本发明所包括佐剂的具体实例。同时下面描述也包括来自其它梭菌例如诺氏梭菌(例如诺氏梭菌α-毒素；Bette等，Toxicon 29(7)877-887，1991)和索氏梭菌(例如索氏梭菌致死毒素，Bette等；Supra)的毒素和类毒素。
用几种标准方法中任何一种可制备本发明方法和组合物中所用的毒素多肽。例如从细菌培养滤液中纯化毒素(例如艰难梭菌毒素A和/或艰难梭菌毒素B)(见例如Lyerly等，FEMS Microbio，Lett.3331-35，1986，和Kim等，感染和免疫552984-2992，1987从艰难梭菌滤液中制备毒素的方法)。也可用标准重组DNA方法生产毒素多肽。在这些方法中，用含全部或部分编码毒素核苷酸片段的合适表达载体来转化合适的宿主细胞(见Dove等，感染和免疫58488，1990，和Barroso等，核酸研究184004，1990，分别为艰难梭菌毒素A的核苷酸序列和推断的氨基酸序列，及艰难梭菌毒素B的核苷酸序列)。一个范围较宽的表达系统中任一个都可以用于生产重组毒素。在原核宿主(例如细菌，如大肠杆菌)或真核宿主中〔例如酵母细胞，例如啤酒酵母，哺乳动物细胞(例如COSI，NIH3T3或JEG3细胞)或节肢动物细胞(例如草地夜蛾(SF9)细胞)〕可以生产毒素多肽。这些细胞来源范围较广例如，美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Rockland，MD(也见例Ausubel等，上文)。转染方法和表达载体的选择根据所选的宿主系统而决定。例如Ausubel等，上文描述了转化和转染方法。表达载体(例如质粒和病毒载体)可以从《克隆载体实验手册》(Pouwels等，1985，补刊，1987)中描述的那些载体中挑选。毒素多肽，特别是短片段，也可以用化学合成方法，例如固相多肽合成法，1984，第二版.，Stewart and Young；Eds.，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL或通过标准的体外翻译方法生产制得。
类毒素(例如艰难梭菌类毒素)也可以用在本发明的方法和组合物中。类毒素是为消除或减轻毒素毒性而经过处理的毒素，但保持了佐剂活性。可用标准方法制备类毒素，例如通过化学(例如戊二醛或甲醛)处理(见例Libby等，感染和免疫36822-829，1982)。也可以用标准重组DNA方法制备类毒素。例如在编码毒素基因中造成突变，并在一个如上所述的表达系统中生产突变基因编码的突变毒素。艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B中可能突变的区域包括，例如保守的半胱氨酸残基，核苷酸结合区域、内部疏水区域，和/或羧基末端重复区域。例如Barroso等，微生物病理16297-303，1990描述了本发明可能使用的艰难梭菌毒素中突变的具体实例。
生产本发明所用类毒素的其它方法包括对毒性起关键作用的氨基酸化学修饰，但与辅佐性无关。例如，本发明所用的并为本领域已知的化学试剂，可特异修饰赖氨酸，酪氨酸，色氨酸，组氨酸或含SH-氨基酸(见例如Cohen等，生物化学年评，37683-695，1986)。此外，可用标准光亲和标记方法生产本发明所用的类毒素，此方法利用例如叠氮相连底物衍生物，通过紫外辐射而将其共价连接到毒素活性位置。本发明也包括毒素和类毒素的混合物作为佐剂的用途。例如，一种艰难梭菌类毒素可以与痕量毒素A或毒素B一起施用(见例如Tamura等，疫苗12(12)1083-1089，1994)。
只要保留了佐剂活性，除天然全长的艰难梭菌毒素外，毒素多肽片段或含突变(可能是或不是类毒素)的毒素(毒素多肽片段)可以用于本发明。例如艰难梭菌毒素片段的例子，见例如Price等，当代微生物学1655-60，1987；Lyerly等，感染和免疫602488-2492，1992。所以用标准方法(见例如Ausubel等，上文)制备编码艰难梭菌毒素片段和/或含突变的毒素的基因。用本领域标准方法筛选本发明所包括的片段，衍生物和类毒素的佐剂活性，例如通过测粘膜免疫应答的诱发或保护性和/或治疗性免疫的诱发(见下面)。如下面所述，艰难梭菌毒素A的ARU片段是一种有效的粘膜佐剂。
本发明也包括融合蛋白，其含有与病原体(例如幽门螺杆菌脲酶)的抗原相融合的梭菌属(例如艰难梭菌)毒素(或具佐剂活性的片段或衍生物)，并用标准方法(见例Ausubel等，上文)制备此蛋白。此外，本发明的毒素佐剂可与抗原共价偶联或交联(见例Cryz等，疫苗1367-71，1994；Liang等，免疫学杂志1411495-1501，1988；和Czerkinsky等，感染和免疫571072-1077，1989)。
本发明的佐剂/疫苗组合物可以施用到粘膜表面(例如鼻内、口、眼、胃肠、直肠、阴道、或生殖-尿道)。另外，也可用非肠道给药方式(例如，静脉内，皮下，腹膜内或肌肉内)。佐剂和疫苗的施用量依据具体的疫苗抗原和佐剂，给药方式和频率，和所需效果(例如保护和/或治疗)而由本领域技术人员决定。通常，本发明佐剂施用量范围从1μg到1mg，抗原范围在1μg到100mg。由本领域技术人员决定重复给药。例如，一份引发剂量可以以周为间隔跟随3个增强剂量。
本发明佐剂(与抗原结合)以药学上接受的载体或稀释液〔例如水、盐水溶液(例如磷酸缓冲盐溶液)，碳酸氢盐溶液(例如0.24MNaHCO3)，栓剂，油膏或凝胶〕形式施用，可根据给药方式和途径，及标准药物的医疗而选择。Remingtons药物科学(Alfonso Gennaro等，编，第17版，Mack publishing Co.，Easton PA，1985)，在此领域，USP/NF中所用的标准参考书，和Lachman等写的(工业药学理论和实践，2nd edn，Lea&Fabiger，Philadelphia PA，1976)描述了药物制剂中的合适药物载体和稀释液，以及药物调用辅助剂。在直肠和阴道给药情况中，使用将药物施用到区域的标准方法和载体施用疫苗。例如，栓剂，油膏(例如可可油)或凝胶，以及标准阴道涂药器，滴剂、注射剂、或可能用的灌肠剂。由本领域技术人员决定合适的方法。
下面的实施例意味着阐明，但不限制，本发明的方法和组合物。下文所引出的一些对于本领域的技术人员显而易见的条件和参数的修饰也包括在本发明中。
实施例实施例1与卵白蛋白(OVA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)一起施用的艰难梭菌毒素的佐剂活性为了分析艰难梭菌毒素A的佐剂活性，对雌性瑞士Webster小鼠(Tacohic Farms，Germantoun，NY)进行鼻内免疫接种抗原，单独用抗原〔50μg卵白蛋白(OVA)或钥孔血蓝蛋白(KLH)〕或与毒素A(40ng)结合。作为一个对照组，疫苗抗原与大肠杆菌不耐热毒素(LT；5μg)共同施用，已知此毒素有粘膜佐剂活性。免疫接种方法为每周给药一次，连续四周。在最后一次给药一周后取动物样品。
与只施用OVA而无佐剂的相似动物组织相比，用OVA和毒素或LT鼻内免疫接种的动物血清、唾液、粪便和阴道样品中具有明显比较高的OVA-特异性IgA抗体应答(图1A)。甚至无佐剂时，血清中OVA-特异性IgG水平普遍比血清和粘膜样品中OVA-特异IgA水平较高，但佐剂存在时水平提高(图1A)。仅在佐剂和抗原一起施用的动物中能明显观察到OVA-特异性粘膜IgA(图1A)。
同样地，与只施用KLH无佐剂的小鼠相比，用KLH+毒素A或LT鼻内施用的小鼠，其KLH-特异性粘膜免疫应答(IgG和IgA)都增加了(图1B)。
下面表1中总结了在佐剂是否存在情况下对抗原(OVA和KLH)产生的免疫应答的统计对照。表1与毒素A一起施用的OVA和KLH的Wilcoxon秩量和(RanKedSums)分析按处理组对比免疫应答，在OVA/KLH+ToxinA(毒素A)和OVA/KLH+LT处理组中未观察到统计差异秩量和p值(OVA)OVA+毒素A(40ng)处理与OVA单独处理比较血清IgA唾液IgA粪便IgA阴道IgAp值0.1172 0.009 0.009 0.009血清IgG唾液IgG粪便IgG阴道IgGp值0.0758 0.1172 0.009 0.0163OVA+LT(5μg)处理与OVA单独处理比较血清IgA唾液IgA粪便IgA阴道IgAp值0.1172 0.1172 0.0283 0.0361血清IgG唾液IgG粪便IgG阴道IgGp值0.1172 0.009 0.009 0.758秩量和p值(KLH)KLH+毒素A(40ng)处理与KLH单独处理比较血清IgA唾液IgA粪便IgA阴道IgAp值0.0283 0.009 0.1425 0.009血清IgG唾液IgG粪便IgG阴道IgGp值0.3472 0.009 0.0163 0.0283KLH+LT(5μg)处理与KLH单独处理比较血清IgA唾液IgA粪便IgA阴道IgAp值0.6015 0.009 0.009 0.016
血清IgG唾液IgG粪便IgG阴道IgGp值0.6015 0.009 0.009 0.009方法抗原与佐剂的制备卵白蛋白(OVA；Turkey，Sigma Chemical Co.，St.Louis.MO)或钥孔血蓝蛋白在磷酸缓冲盐溶液(PBS)中稀释到终浓度为5mg/ml。通过裂解、超滤、DEAE琼脂糖层析和Q-琼脂糖层析，从重组的大肠杆菌中制备重组脲酶(rllrease)(Lee等，传染病杂志172161-172，1995)。冷冻干燥的纯化脲酶重新溶在PBS中浓度为4mg/ml。冷冻干燥的大肠杆菌不耐热肠毒素(LT；Berna，CoralGables，FL)重新溶在PBS中浓度为lmg/ml。
通过硫酸铵沉淀DEAE层析和酸沉淀从艰难梭菌培养物滤液中纯化毒素A。通过DEAE层析(Lyerly等，上文，1986)从艰难梭菌培养物滤液中纯化毒素B。免疫应答的ELISA分析对相应抗原(OVA或KLH)的抗体，用ELISA分析血清(IgG和IgA)，唾液(IgA)，粪便(IgA)和阴道(IgA)样品，可测免疫接种小鼠的免疫应答。在异荧烷麻醉情况下通过眶后取血获得血清样品。在毛果芸香碱处理后获得唾液样品。为获得阴道样品，将预先浸过蛋白酶抑制剂的湿纱布条放在动物体内〔200μM氨乙基苯磺酰氟化物(AEBSF)，0.1％抑蛋白酶肽，0.01μM亮肽素和3.25μM贝他定〕。含阴道样品的粪便和纱布条在分析前重新悬浮在蛋白酶抑制剂溶液，2.5％非脂干性脱脂乳中。
对ELISA分析，96孔板包被在碳酸盐包被缓冲液中(0.1M碳酸盐pH 9.6)，与浓度为10μg/ml的抗原在4℃温育过夜，接着用2％Tween20(Sigma Chemical Co.，St.Louis.MO)与PBS中2.5％非脂干性脱脂乳在37℃封闭1小时。血清抗体在封闭溶液中以1∶100比例稀释检测，粘膜样品按1∶10稀释检测。用羊抗鼠IgG碱性磷酸酶结合物检测特异性IgG抗体。用羊抗鼠IgG碱性磷酸酶结合物检测特异性IgA抗体。图1A和1B中结果以每个处理组中OD405平均读数来表示。实施例II与幽门螺杆菌一起施用的艰难梭菌毒素的佐剂活性下面实验证明，当抗原与低毒，无毒剂量的艰难梭菌毒素A或艰难梭菌毒素B鼻内施用时，对幽门螺杆菌脲酶的粘膜免疫应答提高，并且进一步证明这种免疫应答是保护性的，防止随后的螺杆菌攻击。
对雌性瑞士Webster小鼠(5小鼠/佐剂)鼻内施用幽门螺杆菌脲酶脱辅基酶蛋白(5μg)，此蛋白从表达脲酶结构亚基的重组大肠杆菌中纯化(Lee等，上文)，每周一次连续四周，并结合艰难梭菌毒素A(0.2μg)，艰难梭菌毒素B(1μg)，艰难梭菌类毒素培养物滤出液(各含用1％福尔马林灭活的15μg毒素A和毒素B)，CT(5μg)，CT的B亚基(CTB；5μg)+CT(10ng)，或无佐剂。确定毒素辅佐性<1>测定脲酶-特异性粘膜IgA诱发和<2>观察保护性免疫诱发。粘膜IgA的诱发最后一次脲酶免疫接种后一周，从小鼠中取粪便、唾液和阴道样品来分析抗脲酶IgA粘膜免疫应答。通过在蛋白酶抑制剂溶液(200μMAEBSF，0.1％抑蛋白酶肽，0.01μM亮肽素，3.25M贝他定)中匀浆几个粪便颗粒来制备粪便样品。在氯胺酮麻醉情况下，毛果芸香碱诱发获得唾液样品；在非荧烷麻醉情况下，将预先浸湿了蛋白酶抑制剂溶液(见上面)的可吸收性纱布条插入动物体内，可获得阴道样品。
通过ELISA可测样品中抗脲酶IgA水平。用有脲酶(0.5μg/孔)的碳酸盐包被缓冲液包被96孔板(见上面)，用2.5％非脂干性脱脂乳封闭，并与小鼠样品接触。通过将碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgA抗体放入孔中，并测定405纳米可见光吸收值，来确定抗脲酶IgA水平(图2)。
通过Wilcoxon秩量和检验比较每个处理组中抗体水平(表格2)。在鼻内施用脲酶的所有组中血清抗-脲酶IgG水平提高，在不同处理组中无明显差异。与单独施用脲酶，或脲酶和CT相比，当毒素A或毒素B与脲酶共同施用时，粪便的抗脲酶IgA水平明显提高。施用脲酶和毒素A或B的动物与施用脲酶结合CTB和CT的动物相比，粪便的抗脲酶IgA无差异。毒素A与脲酶共同施用的阴道抗脲酶IgA水平明显高于其它处理组。与单独施用脲酶或与其它任何一种佐剂结合施用的试验相比，这种差异在统计学上是显著的。表2经佐剂处理的对脲酶的粘膜应答统计分析。显示了在单独施用脲酶、脲酶和CT，或脲酶和CTB+CT；以及脲酶和毒素A，脲酶和毒素B，或脲酶和类毒素的处理组中，粪便、唾液和阴道分泌物中抗体应答的差异(Wilcoxon秩量和)p值(Wilcoxon)粪便IgA处理 CT CTR+CT脲酶毒素A 0.0119 0.11720.009毒素B 0.0163 0.91660.0163类毒素 未做 未做 0.4647唾液IgA处理 CT CTB+CT脲酶毒素A 0.8345 0.21010.2087毒素B 0.6752 0.91680.4647类毒素 未做 未做 0.0749阴道IgA处理 CT CTB+CT 脲酶毒素A 0.0283 0.0283 0.009毒素B 0.1745 0.1172 0.0937类毒素未做未做 0.472因此，当鼻内给药时，艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B能在不同部位对异源抗原明显地提高粘膜免疫应答。特别是，当毒素A施用到上呼吸道时诱发强烈的生殖-尿道和肠道应答。与其它已知粘膜佐剂施用相比，这种增强作用更强烈。当鼻内施用抗原时，其它佐剂(例CT，LT和CT+CTB)主要刺激呼吸道免疫。保护性免疫的诱发为确定艰难梭菌毒素诱发的免疫应答是否与防护激发有关，用猫螺杆菌激发已免疫接种的动物。在最后一次脲酶免疫14天后，对麻醉的雌性瑞士Webster小鼠鼻内施用猫螺杆菌(1×107)。14天后杀死动物，分析胃活体组织检查(窦)的脲酶液体培养基(加入酚红pH指示剂的脲缓冲液)温育活体组织检查样品4个小时。离心去除胃物质并测定OD550。由OD550测量值(胃中脲酶活性的定量)反映细菌菌落密度，并与通过组织病理观察的细菌密度相关。吸收值高于背景2倍的小鼠被认为已受感染。部分保护定义为OD550水平高于背景并低于感染对照组(PBS组)的2倍SD。
图3表示胃脲酶检测结果，表3总结了保护作用的结果。在已激发动物中，单独施用脲酶及施用脲酶和艰难梭菌类毒素对诱发保护性免疫是无效的。施用脲酶和CT或CT+CTB能分别完全保护4/4和5/5动物，然而施用脲酶和毒素A完全保护3/5动物和部分保护5/5动物。Wilcoxon秩量和分析表明，通过测OD550确定感染量，与单独施用脲酶(p0.0122)的动物相比，施用脲酶+毒素A的动物中感染量明显较低。用脲酶+毒素B免疫接种的动物比那些单用脲酶免疫接种的动物感染程度低，并且脲酶+毒素B免疫接种的4/5动物是部分保护。这些数据表明，艰难梭菌毒素A和毒素B与幽门螺杆菌脲酶进行鼻内施用时，能对猫螺杆菌激发诱发保护性免疫。表3脲酶和粘膜佐剂进行鼻内免疫接种后小鼠对猫螺杆菌菌落的防护处理 感染动物/总数PBS 5/5脲酶 5/5脲酶+CT 0/4脲酶+类毒素 5/5脲酶+毒素A1/5*脲酶+毒素B4/5**脲酶+CTB+CT 0/5*1只感染动物的菌落比对照组少**3只感染动物的菌落比对照组少实施例III艰难梭菌毒素A融合蛋白(GST-ARU)的合成艰难梭菌毒素A的羧基末端区域包含一系列重复的氨基酸单位，并认为参与将毒素连接到靶细胞的碳水化合物残基上(见，例如，Lyerly等，当代微生物2129-32，1990；Frey等，感染和免疫602488-2492，1992；及此处所引用的文献)。如下述构建一个融合蛋白，包含与谷胱甘肽S-转移酶融合的艰难梭菌毒素A羧基末端区域。通过标准方法，分离一段Sau 3A片段，包含编码毒素A的794羧基末端氨基酸的核苷酸(见，例如，Dove等，上文，毒素A基因序列)。补平此片段的粘性末端，并且将平端片段接进Sma I-消化的pGEX3X中(Pharmacia，Piscataway，NJ)。包含编码GST-ARU的质粒克隆在大肠杆菌中生长，用谷胱甘肽-琼脂糖亲和柱纯化GST-ARU融合蛋白，用游离的谷胱甘肽从柱上洗脱下来并用标准方法透析除去谷胱甘肽。GST-ARU是无毒的。实施例IV艰难梭菌毒素A融合蛋白(GST-ARU)的佐剂活性A.施用GST-ARU诱发抗-毒素A免疫应答在大肠杆菌中表达GST-ARU，用标准方法亲和纯化，并施用到表4中所说明的实验小鼠。表4用包含艰难梭菌毒素A的羧基末端的融合蛋白免疫接种小鼠后，关于粘膜免疫应答分析的实验图解。GST-ARU＝包含谷胱甘肽S转移酶和毒素A重复单位的融合蛋白；GST＝谷胱甘肽S-转移酶；PBS＝磷酸缓冲盐溶液；IG＝胃内的；IN＝鼻内的；IP＝腹膜内的。在第0、7、14和21天进行免疫接种。在第28天取血清、阴道、粪便和唾液样品。抗原 剂量(μg) 佐剂 途径 #大鼠GST-ARU 100CTIG5GST-ARU 100无IG5GST-ARU 50 CTIN5GST-ARU 50 无IN5GST-ARU 25 RIBI IP5GST-ARU 25 无IP5GST 25 CTIG5GST 25 无IG5GST 12.5 CTIN5GST 12.5 无IN5GST 6.25 RIBI IP5GST 6.25 无IP5PBS 0 CTIG5PBS 0 CTIN5PBS 0 RIBI IP5
通过ELISA测定样品中抗艰难梭菌毒素A IgA和/或IgG水平。96孔板用毒素A在碳酸盐包被缓冲液中包被(见上面)，用2.5％非脂干性脱脂乳封闭，然后接触样品。通过将碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgA(或IgG)抗体放入孔中，并测405纳米可见光吸收值来确定抗脲酶IgA(或IgG)水平。
这些实验结果表示在图4A-4B中。这些数据表明无需用CT来提高诱导的抗毒素A血清IgA或IgG，或抗毒素A粘膜免疫应答。鼻内免疫接种后(图4A-4B)，此效果特别显著。因为毒素A的羧端区域在无异源佐剂(如CT)时能够诱导免疫应答。这些数据表明毒素A的这一区域作为佐剂是有效的。然而，当已知佐剂存在或缺失时进行粘膜或全身给药时，未发现GST单独有抗原性(例如GST不是以有ARU的融合蛋白形式存在)。因此，对于艰难梭菌毒素-抗原融合蛋白，GST不是一种合适的试验抗原。在以下描述实验中，当鼻内施用GST-ARU与卵白蛋白，GST-ARU是一种有效的佐剂。B.GST-ARU+卵白蛋白的鼻内给药产生一种抗卵白蛋白免疫应答通过鼻内免疫接种GST-ARU和/或毒素A与卵白蛋白，检验GST-ARU的佐剂活性。小鼠鼻内给药100μg卵白蛋白，25μg GST-ARU，和毒素A的减少量(200ng，40ng，8ng，1.6ng和0ng)，或100μg卵白蛋白和毒素A的减少量(200ng，40ng，8ng，1.6ng和0ng)，但无GST-ARU，间隔期四周。给药量不超过20μg，并且不施用麻醉药。每个处理组中有5只小鼠。
如上面描述(见图5A-7B)，通过EUSA分析确定血清，唾液，粪便和阴道分泌物中的抗卵白蛋白免疫应答。血清IgA和IgG免疫应答表明动物中抗卵蛋白抗体水平随毒素A剂量的减少而降低。当施用GST时，随着活性毒素的减少剂量，甚至不施用毒素A(图5A和5B)，应答不消失。相似地，不管是否存在活性毒素A，当GST-ARU作为佐剂时，唾液、粪便、和阴道抗卵白蛋白相比，当GST-ARU作为一种佐剂时已分析的所有免疫应答均为显著增加。这些应答与LT用作佐剂所观察的免疫应答的差异程度并不显著(表5)。所以，GST-ARU显著增加对血清和粘膜分泌物中共同施用抗原的免疫应答。此外，这些数据表明能从遗传上去除毒素A的毒性，并不影响佐剂活性。实施例V直肠和阴道免疫接种方法以下调查了直肠和阴道免疫接种途径。小鼠给药200μg卵白蛋白和1μg毒素A，25μgLT，或无佐剂，间隔期四周。每个处理组中有5只小鼠。当小鼠轻微麻醉时，通过喂食时施用总量为15μg的疫苗。
表5
如上面所述，在最后一次免疫接种后，取血清和粘膜分泌物样品通过ELISA测抗卵白蛋白抗体水平。当抗原与毒素A经直肠或阴道途径施用时，血清抗卵白蛋白IgG免疫应答增加，但单独施用抗原时不增加(图8)。当毒素A用作佐剂时，粪便中抗卵白蛋白IgA抗体应答明显提高，血清，唾液和阴道分泌物中轻微增加(图8)。直肠免疫接种卵白蛋白+佐剂后测定的所有免疫应答比单独用卵白蛋白直肠免疫接种后的免疫应答统计值大(表6)。阴道免疫接种是有明显的相似趋势，但需要大量的小鼠来证实统计意义。有趣的是，与单独施用抗原相比，直肠或阴道施用带有佐剂的卵白蛋白时，直肠抗卵白蛋白IgG应答提高。这些数据表明，当给药到直肠或阴道粘膜时，毒素A提高血清和粘膜分泌物中的特异性抗体水平。另一方面支持了直肠途径的功效，使用与上述相似的攻击和鉴定方法，螺杆菌脲酶和毒素A直肠免疫接种的小鼠能防止螺杆菌的激发。
表6直肠免疫接种卵白蛋白+毒素A的Wilcoxon秩量和分析处理 血清IgG 血清IgA 唾液IgA 唾液IgG 粪便IgA 粪便IgG 阴道IgA 阴道IgG直肠毒素A对0.009 0.009 0.009 0.02780.0089 0.0088 0.0088 0.0088卵白蛋白单用直肠毒素A对0.08640.62420.22071 0.6242 0.8065 0.3272 0.3272直肠LT其它一些实施方案在下面的权利要求书中。
权利要求
1.一种在哺乳动物中诱导对抗原的免疫应答的组合物，所说组合物包含所说抗原和一种有佐剂活性的梭菌属细菌毒素或其片段或衍生物组成的佐剂。
2.权利要求1的组合物，其中所说抗原和所说佐剂被制剂化，以便于给药于所说哺乳动物的粘膜表面。
3.权利要求2的组合物，其中所说的粘膜表面是鼻内。
4.权利要求2的组合物，其中所说的粘膜表面是口。
5.权利要求2的组合物，其中所说的粘膜表面是直肠。
6.权利要求2的组合物，其中所说的粘膜表面是在生殖-尿道内。
7.权利要求6的组合物，其中所说的粘膜表面是阴道。
8.权利要求1的组合物，其中所说的细菌选自艰难梭菌，索氏梭菌和诺氏梭菌。
9.权利要求1的组合物，其中所说的细菌是艰难梭菌。
10.权利要求1的组合物，其中所说的佐剂是艰难梭菌毒素A。
11.权利要求1的组合物，其中所说的佐剂是艰难梭菌毒素B。
12.权利要求1的组合物，其中所说的抗原与艰难梭菌毒素A和艰难梭菌毒素B，或其具佐剂活性的片段或衍生物一起给药。
13.权利要求1的组合物，其中所说的佐剂包含艰难梭菌毒素A的碳水化合物的结合区域。
14.权利要求1的组合物，其中所说的毒素被以融合蛋白形式制备。
15.权利要求14的组合物，其中所说的融合蛋白包含所说抗原。
16.权利要求1的组合物，其中所说的抗原是幽门螺杆菌脲酶，或其片段或衍生物。
全文摘要
本发明涉及在哺乳动物中诱导对一种抗原的保护性和/或治疗性免疫应答的方法和组合物。在这些方法中,将该抗原与梭菌属(例如艰难梭菌)的毒素,或其具有佐剂活性的片段或其衍生物一起施用于哺乳动物。
文档编号A61K39/106GK1195297SQ96196777
公开日1998年10月7日 申请日期1996年7月1日 优先权日1995年7月7日
发明者小·W·D·汤马斯, T·P·莫纳思, 张振西, F·J·托雷斯－罗佩兹, 雷文德, D·M·赖尔利, J·S·莫克里夫 申请人:奥拉瓦克斯有限公司