专利名称：肉毒梭菌环介导等温扩增快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方 法，具体是一种A型肉毒梭菌环介导等温扩增快速检测方法。
背景技术：
肉毒梭菌(Clostridium botulinum)属于厌氧性梭状芽胞杆菌属，具有该菌的 基本特性，即厌氧性的杆状菌，形成芽胞，芽胞比繁殖体宽，呈梭状，革兰氏染 色为阳性，产生剧烈细菌外毒素，即肉毒毒素。肉毒毒素能引起人和动物的肉毒 中毒，根据肉毒毒素的抗原性，肉毒梭菌至今已有A、 B、 C (1、 2)、 D、 E、 F、 G 七个型。引起人群中毒的，主要有A、 B、 E三型；C、 D二型毒素主要是畜、禽肉毒 中毒的病原；F、 G型肉毒梭菌极少分离，未见G型菌引起人群的中毒报道。肉毒梭 菌广泛存在于自然界，引起中毒的食品有腊肠、火腿、鱼及鱼制品和罐头食品等。 在美国以罐头发生中毒较多，日本以鱼制品较多，在我国主要以发酵食品为主， 如臭豆腐、豆瓣酱、面酱、豆豉等，其它也引起中毒的食品还有熏制未去内脏 的鱼、填馅茄子、油浸大蒜、烤土豆、炒洋葱、蜂蜜制品等。肉毒梭菌是致死性 最高的病原体之一，感染剂量极低，每个人都易感。摄食18-36小时后发病为典型 病症，但不典型的可在4小时至8天不等，症状为虚弱、眩晕、伴随视觉成双、渐 进性说话障碍、呼吸和吞咽困难，最终引起麻痹、死亡。据统计，1899年至1990 年，在美国共有2305人中毒，经检测，303人感染A型毒素，92人感染B型毒，3人 感染E型毒素，2人感染F型毒素，有2起中毒事件是由A、 B二种毒素引起。而在我 国，各地发生的肉毒中毒事件也主要是A型和B型。
现有肉毒梭菌及肉毒毒素的检测方法有血清学实验、小白鼠腹腔注射及中和试 验、ELISA多用双抗体夹心法、PCR方法等，这些方法各有优势，但也有不足，或
所需时间过长、或步骤繁琐、或成本较高。而环介导等温扩增方法方便、快速、 成本低，适于现场检测，有较好的应用性，目前尚未见用环介导等温扩增方法检 测肉毒梭菌的报道。
发明内容
本发明的目的是提供一种A型肉毒梭菌环介导等温核酸扩增方法，以克服现有 技术的缺点，从而为水产养殖和食品安全提供科学的依据和指导作用。
本发明的主要原理为(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个 内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)，
内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和耙DNA杂交，随 后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由 一个外弓I物启 动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动 的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA; (3)内引物以原始茎环DNA做模板，启 动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环 DNA; (4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有耙 DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到109拷贝，可通过 荧光染料来观察扩增结果。
本发明涉及的A型肉毒梭菌环介导等温扩增快速检测方法中，其中包括的试剂 如下(1) - (4):
(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液 其中包括10XThermopol反应缓冲液、1.0 — 1.4 mmol/L dNTP、 4一8mmol/L 硫酸镁(MgS04)、 0.8 —1.6nmol/L上游引内物(FIP)、 0. 8 — 1. 6iJmol/L下游内引 物(BIP)、 0.2—0. 3nmol/L上游外引物(F3)、 0. 2—0. 3iJmol/L下游外引物(B3) 和l一1.5mol/L甜菜碱；
上游内引物
5- GAGCCATAACCATTTCGCGTA-AGTTTGAATGTAAAAGCTTTGG -3、
下游内引物
5-GCCCAGATTTTACATTTGGTTTTGA-GTAGCAAATTTGCCTGCA -3 、 上游外引物5-AGTAATAATAGGACCCTCAGC-3 、 下游外引物5-TCATGTGCTAATGTTACTGC-3 、
其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP 二2:1:1:1。
其中所述的10XThermopol反应缓冲液中含有200 mmol pH8.8的三羟基甲基氨 基甲烷一盐酸(Tris—HCl)、 100咖ol/L氯化钾(KC1)、 100 mmol/L硫酸铵((NHJ 2S04)、 20咖ol/L硫酸镁(MgS04)和1^曲拉通X—100 (Triton X—100);
(2) 跳酶1 U/pL;
(3) Bst DNA聚合酶8 U /yL;
(4) 显色剂为10X的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面所述环介导等温扩增反应液每管共有22iJL，其最佳组成为2.5JJL 10 X
Thermopol反应缓冲液、1. 4|jL 25mmol/L dNTP(四种脱氧核糖核酸的混合物)、4. 0|jL 10nmol/L上游内引物(FIP)、 4.0ijLl(Hjmol/L下游内引物(BIP)、 0. 5pL 10|jmol/L 上游外引物(F3)、 0.5pL10iJniol/L下游外引物(B3)、 2|jL 100 mmol/L MgS04、 5jjL
5M甜菜碱和2. 1|JL ddH20 (灭菌双蒸水)。
使用上述试剂检测A型肉毒梭菌的方法，依次包括下列步骤(1) - (3):
(1) 待检样品或细菌DNA的提取
提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA 0D26。/0D28。在1.6-2.0范围内，浓度 在IO-IOO ng/ijL范围内;
(2) 进行A型肉毒梭菌的环介导等温扩增反应
A. 在装有22jjL LAMP反应液的反应管中加入2pL待检模板DNA,和O. 5ijL的UNG 酶，于恒温水浴上5(TC放置3 min， 95。C放置3—5 min，立即置于冰上1一3 min;
B. 在反应管中加入lpL Bst DNA聚合酶，并于水浴锅中恒温水浴上60—65。C 扩增反应45—90 min;
C. 将水浴调到80—85"C终止反应，3—5min后取出待检；
(3) 显色检测
在待检的每个反应管中加入lpL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜 色变为绿色，说明待检样品含有或为A型肉毒梭菌。
本发明是根据A型肉毒梭菌保守区的六个序列设计了两个特异性内引物和两个 特异性外引物，该保守基因序列为A型肉毒梭菌所共有，以保证检测不同来源的A 型肉毒梭菌的可靠性。本发明采用环介导等温扩增技术，该技术特异性强，与PCR 检测方法有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只需普通的水浴锅即可，且 结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察即可，简单而快速，特别 适用于基层医疗机构。
具体实施例方式
下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。 实施例l
按下列配方制作A型肉毒梭菌的环介导等温扩增反应液
(1) LAMP反应液
含有2. 5pL 10XThermopol反应缓冲液、1. 4pL 25mmol/L dNTP (四种脱氧核 糖核酸的混合物)、4.0|JL 10iJmol/L上游内引物(FIP)、 4. 0yL 10ymol/L下游内引 物(BIP)、 0.5|JL 10iJmol/L上游外引物(F3)、 0. 5pL 10iJmol/L下游外引物(B3)、 2|jL 100 mmol/L MgS04、 5|jL 5M甜菜碱和2. l|jL ddH20 (灭菌双蒸水)。
其中，所述的上游内引物
5- gagccataaccatttcgcgta-agtttgaatgtaaaagctttgg -3、
下游内引物
5- gcccagattttacatttggttttga-gtagcaaatttgcctgca -3 、
上游外引物5- AGTAATAATAGGACCCTCAGC -3 、 下游外引物5-TCATGTGCTAATGTTACTGC-3 ;
其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP二 2:1:1:1。
(2) 謠酶1 U/pL;
(3) Bst DNA聚合酶:8U /jjL;
(4) 显色剂为10X的荧光染料SYBR GREEN I。 按照以下(1) - (3)程序进行检测
(1) 样品DNA的提取
检测菌种A型肉毒梭菌(Clostridium botulinum A)，菌种来源中国人民解放 军军事医学科学院微生物流行病研究所，编号62A。
使用北京天根生物工程公司的细菌核酸提取试剂盒提取样品DNA， DNA 0D26。/ 0D娜能够达到1.8，浓度达到20 ng/|jL0
(2) 进行A型肉毒梭菌的环介导等温扩增反应
A. 在装有22lJL LAMP反应液的反应管中加入2jjL待检模板DNA，和O. 5nL的UNG 酶，于恒温水浴上5(TC放置3 min， 95。C放置5 min,立即置于冰上l min;
B. 在各反应管中加入l |jL Bst DNA聚合酶，并于恒温水浴上65 。C扩增反应l 小时；
C. 将水浴调到80 'C终止反应，3 min后取出待检；
(3) 显色检测
在待检的每个反应管中加入l pL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜 色变为绿色，说明待检样品为A型肉毒梭菌。 实施例2
按下列配方制作A型肉毒梭菌的环介导等温扩增反应液 (1) LAMP反应液
含有2. 5pL 10XThermopol反应缓冲液、1. 4|jL 25mmol/L dNTP、4. 0 JJL 10|jmol/L 上游内引物(FIP)、 4.0 yL 10 口mol/L下游内引物(BIP)、 0.5 |JL 10jJmol/L上游 外引物(F3)、 0.5 口L 10 pmol/L下游外引物(B3)、 2 |JL 100 mmol/L MgS04、 5pL 5mol/L甜菜碱和2. lyL ddH20 (灭菌双蒸水)。
其中所述的上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物同上。 上述混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP二 2:1:1:1。
(2) UNG酶1 U/|JL;
(3) Bst DNA聚合酶8U /pL;
(4) 显色剂为10X的荧光染料DNAGreen。 按照以下(1) - (3)程序进行检测
(1) 样品DNA的获得
检测菌种A型肉毒梭菌(Clostridium botulinum A)，菌种来源山东省疾病预 防控制中心，编号SDCDC9501。
使用大连宝生物工程公司的植物核酸提取试剂盒提取样品DNA， DNA 0D260/ 0D280能够达到1.8，浓度达到20 ng/fjL。
(2) 进行A型肉毒梭菌的环介导等温扩增反应
A. 在装有22ijL LAMP反应液的反应管中加入2口L待检模板DNA，禾ao. 5ijL的UNG 酶，于恒温水浴上50。C放置3 min， 95。C放置5min，立即置于冰上l min;
B. 在各反应管中加入liJLBstDNA聚合酶，并于恒温水浴上65。C扩增反应1 h;
C. 将水浴调到8(TC终止反应，3 min后取出待检；
(3) 显色检测
在待检的每个反应管中加入1JJL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜 色变为绿色，则待检样品也为A型肉毒梭菌。
核苷酸序列表
〈110〉山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心
〈120〉肉毒梭菌环介导等温扩增快速检测方法
〈160> 4
〈210〉 1
〈211〉 43
〈212> DNA
〈213〉人工序列
〈221〉 prim一bind
〈222〉 (1)…(43)
<400> 1
GAGCCATAACCATTTCGCGTA-AGTTTGMTGTMMGCTTTGG 43
〈210〉 2 〈211〉 43 <212〉腿 〈213〉人工序列 <221〉 prim—bind 〈222〉 (1)…(43) 〈400> 2
GCCCAGATTTTACATTTGGTTTTGA-GTAGCMATTTGCCTGCA 43
〈210〉 3 <211> 21 〈212〉腿 <213>人工序列 <221> prim_bind <222〉 (1)…(21) 〈400〉 3
AGTAATMTAGGACCCTCAGC 21
<210> 4 <211> 20 〈212〉腿 〈213〉人工序列 〈221> prim—bind 〈222〉 (1)…(20) 〈400〉 4
TCATGTGCTAATGTTACTGC 20
权利要求
1. 环介导等温扩增检测肉毒梭菌的试剂，其特征是该试剂包括(1)-(4)(1)环介导等温扩增反应液包括10×Thermopol反应缓冲液、1.0—1.4mmol/L dNTP、4—8mmol/L硫酸镁(MgSO4)、0.8—1.6μmol/L上游引内物(FIP)、0.8—1.6μmol/L下游内引物(BIP)、0.2—0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2—0.3μmol/L下游外引物(B3)和1—1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷—盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X—100；其中，上游内引物:5-GAGCCATAACCATTTCGCGTA-AGTTTGAATGTAAAAGCTTTGG-3；下游内引物:5-GCCCAGATTTTACATTTGGTTTTGA-GTAGCAAATTTGCCTGCA-3；上游外引物:5-AGTAATAATAGGACCCTCAGC-3；下游外引物:5-TCATGTGCTAATGTTACTGC-3；(2)UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶8U/μL；(4)显色剂为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2. 环介导等温扩增检测肉毒梭菌的试剂，其特征是上述的dNTP内的四种脱 氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP =2:1:1:1 。
3、 利用权利要求1所述的试剂进行等温快速检测肉毒梭菌的方法，其特征 是依次包括(1) - (3)下列步骤(1) 待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA 0D柳/ 0D卿在1.6-2.0范 围内，浓度在10-100 ng/"L范围内；(2) 进行A型肉毒梭菌的环介导等温扩增反应A.在装有22uLLAMP反应液的反应管中加入2uL待检样品模板DNA，和 0. 5uL的UNG酶，于恒温95 。C放置3 —5 min，立即置于冰上1 — 3 min ; B. 再在反应管中加入luL Bst DNA聚合酶，并于恒温65 。C扩增反应45 一90 min;C. 将温度调到80 。C终止反应，3 — 5 min后取出待检；(3)显色检测在每个反应管中加入luL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液 颜色变为绿色，说明待检样品含有或为A型肉毒梭菌。
全文摘要
本发明涉及一种肉毒梭菌环介导等温扩增快速检测方法。其中的试剂包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、显色剂；环介导等温扩增反应液含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5-GAGCCATAACCATTTCGCGTA-AGTTTGAATGTAAAAGCTTTGG-3、下游内引物5-GCCCAGATTTTACATTTGGTTTTGA-GTAGCAAATTTGCCTGCA-3、上游外引物5-AGTAATAATAGGACCCTCAGC-3、下游外引物5-TCATGTGCTAATGTTACTGC-3和甜菜碱；检测A型肉毒梭菌的方法包括细菌DNA的提取、肉毒梭菌A型的环介导等温扩增和显色检测。其优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。
文档编号C12Q1/04GK101381774SQ20081015790
公开日2009年3月11日 申请日期2008年10月15日 优先权日2008年10月15日
发明者刘云国, 静 唐, 姜英辉, 健 张, 房保海, 李正义, 祝素珍, 楠 贺, 贾俊涛, 赵丽青, 雷质文, 马维兴 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心