专利名称：产毒素b艰难梭菌环介导等温扩增快速检测方法
技术领域：
本发明涉及一种利用环介导等温扩增(LAMP)技术进行菌样的快速检测的方 法，具体是一种产毒素B艰难梭菌环介导等温扩增快速检测方法。
技术背景艰难梭菌(Clostridium difficile)是梭菌属的一个成员，二十世纪九十年代以 来成为最重要的医院感染的病原之一。艰难梭菌属厌氧性细菌，就是指那些在无 氧条件下要比在有氧环境中生长好的细菌，而人的肠道正好是一个相对无氧的环 境。艰难梭菌广泛分布于自然生境中，如土壤、干草、沙、 一些大型动物(牛、 驴和马)的粪便，及狗、猫、啮齿动物和人的粪便，婴儿的粪便中常含有艰难梭 菌，大约50%12月龄婴儿的肠道中有艰难梭菌，2岁以上儿童的带菌率大约为3%， 但此菌在健康成人中出现频率较低，无症状带菌的成人在瑞典是1.9%，在日本为 15.4%。艰难梭菌芽孢菌的细菌平时寄生在人类肠道中，如果过量服用抗生素致 使菌群增长速度过快，就会引发严重的炎症。 一份报告以加拿大魁北克地区举例， 12家医院中1703名病人的病历都显示这种病菌具有高致命性。近期的研究表明，艰 难梭菌是肠道感染中第二位常见致病菌,仅次于弯曲菌属，易引起以发热、腹痛、 水样泻及伪膜性肠炎。艰难梭菌之所以能够致病，是因为它具有3种毒力因子毒 素A、毒素B和一种能够抑制肠道蠕动的物质。毒素A有肠毒性，毒素B有细胞毒性。 毒素A也有一定的细胞毒性作用，但比毒素B小。毒素A和B是艰难梭菌的主要致病 因子，可干扰肠道上皮细胞的肌动蛋白骨架，使细胞丧失功能。现有艰难梭菌及其毒素的检测方法主要有毒素检测、培养细胞的毒素中和试 验、PCR等，培养细胞的毒素中和试验可能会有假阴性，使病人因治疗不当而死亡。 目前尚未见用环介导等温扩增方法检测艰难梭菌的报道。 发明内容本发明的目的是提供一种产毒素B艰难梭菌环介导等温扩增快速检测方法，以 克服现有技术的缺点，从而为食品安全提供科学的依据和指导作用。本发明的主要原理为(1)特殊设计一组可以识别靶DNA六个不同序列的两个 内引物(上游内引物和下游内引物)和两个外引物(上游外引物和下游外引物)， 内引物包含靶DNA的正义链和反义链；(2)其中一个内引物首先和靶DNA杂交，随 后的链置换DNA合成在具有高度链置换活性的DNA聚合酶的参与下由一个外引物启 动，释放出单链DNA，并作为由杂交到靶的另一端的一个内引物和一个外引物启动的DNA合成模板，产生一个原始的茎环DNA; (3)内引物以原始茎环DNA做模板，启 动链置换DNA的合成，产生一个原始的茎环DNA和一个新的由两倍茎长度的茎环 DNA; (4)在等温条件下，内引物以茎环DNA为模板，通过链置换形成多个含有靶 DNA重复序列的茎环DNA，在一小时内该循环反应可使靶DNA累积到109拷贝，可通过 荧光染料来观察扩增结果。本发明涉及的产毒素B艰难梭菌环介导等温扩增快速检测方法中，包括的试剂 如下(1) — (4):(1)环介导等温扩增(LAMP)反应液其中包括10XThermopol反应缓冲液、1.0 — 1.4鹏ol/L dNTP、 4—8mmol/L 硫酸镁(MgS04)、 0.8 —1.6jjmol/L上游引内物(FIP)、 0. 8 — 1. 6iJmol/L下游内引 物(BIP)、 0.2—0.3iJmol/L上游外引物(F3)、 0. 2—0. 3nmol/L下游外引物(B3) 和l — 1.5mol/L甜菜碱； 上游内引物5-AGGAGAAGCAATTGATTTTACTGGA-TACAGCTCCTCTATAATTATCTTCA-3、下游内引物5-AAGTGTATTAGCTGGGGCAAAATAT-TATTTCAACCAAAGTGGAGTGT誦3、 上游外引物5-TTCACCATCTAATTCTTTCCATTC画3、 下游外引物5-CAATTGGAGAGACAATAATTGATG-3 、其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP =2:1:1:1。其中所述的10XThermopol反应缓冲液中含有200 mmol pH8.8的三羟基甲基氨 基甲烷一盐酸(Tris—HCl)、 100咖ol/L氯化钾(KC1)、 100 mmol/L硫酸铵((NH4) 2S04)、 20腿ol/L硫酸镁(MgS04)和1X曲拉通X—100 (Triton X—100);(2) UNG酶1 U/|JL;(3) Bst DNA聚合酶8 U /pL;(4) 显色剂为10X的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。 上面所述环介导等温扩增(LAMP)反应液每管共有22iJL，其最佳组成为2. 5[JL10XThermopol反应缓冲液、1. 4|jL 25mmol/L dNTP (四种脱氧核糖核酸的混合物)、 4萃10iJmol/L上游内引物(FIP)、 4萃10jjmol/L下游内引物(BIP)、 0. 5jjL 10pmol/L上游外引物(F3)、 0.5|JL 10(Jmol/L下游外引物(B3)、 2pL 100腿ol/L MgS04、 5|JL 5M甜菜碱和2. lpL ddH20 (灭菌双蒸水)。使用上述方法检测产毒素B艰难梭菌，依次包括下列步骤(1) _ (3):(1) 待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA 0d26。/0d，在1.6-2.0范围内，浓度 在10-100 ng/nL范围内。(2) 进行产毒素B艰难梭菌的环介导等温扩增反应A. 在装有22ijL LAMP反应液的反应管中加入2iJL待检模板DNA，和O. 5pL的UNG 酶，于恒温水浴上50。C放置3 min， 95。C放置3—5 min,立即置于冰上1一3 min;B. 在反应管中加入liJL Bst DNA聚合酶，并于水浴锅中恒温水浴上60—65'C 扩增反应45—90 min;C. 将水浴调到80—85。C终止反应，3 —5min后取出待检；(3) 显色检测在待检的每个反应管中加入lpL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜 色变为绿色，说明待检样品含有或为产毒素B艰难梭菌。本发明是根据产毒素B艰难梭菌的tcdB基因的六个序列设计了两个特异性内引 物和两个特异性外引物，该保守基因序列为产毒素B艰难梭菌所共有，以保证检测 不同来源的产毒素B艰难梭菌的可靠性。本发明采用环介导等温扩增(LAMP)技术， 该技术特异性强，与PCR检测方法有相同的高灵敏度，但不需要昂贵的PCR仪，只 需普通的水浴锅即可，且结果不必用凝胶电泳方法来观察，使用荧光染料来观察 即可，简单而快速，特别适用于基层医疗机构。
具体实施方式
下列实施例进一步说明本发明，但不应当作对本发明的限制。 实施例l按下列配方制作产毒素B艰难梭菌的环介导等温扩增反应液 (1) LAMP反应液含有2. 5yL 10XThermopol反应缓冲液、1. 4|jL 25mmol/L dNTP (四种脱氧核 糖核酸的混合物)、4.0yL 10iJmol/L上游内引物(FIP)、 4. 0|jL 10iJmol/L下游内引 物(BIP)、 0.5|JL 10iJmol/L上游外引物(F3)、 0. 5|jL 10nmol/L下游外引物(B3)、 2|JL 100腿ol/L MgS04、 5|JL 5M甜菜碱和2. 1|JL ddH20 (灭菌双蒸水)。其中所述的上游内引物 5-AGGAGAAGCAATTGATTTTACTGGA-TACAGCTCCTCTATAATTATCTTCA-3、下游内引物5-AAGTGTATTAGCTGGGGCAAAATAT-TATTTCAACCAAAGTGGAGTGT誦3 、 上游外引物5- TTCACCATCTAATTCTTTCCATTC-3 、 下游外引物5-CAATTGGAGAGACAATAATTGATG-3 ;其中混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP= 2:1:1:1。(2) UNG酶1 U/|JL;(3) Bst DNA聚合酶8U /pL;(4) 显色剂为10X的荧光染料SYBR GREEN I。 按照以下(1) - (3)程序进行检测(1) 样品DNA的提取检测菌种艰难梭菌(Clostridium difficile),菌种来源美国典型培养物保藏 中心，编号ATCC43593。使用北京天根生物工程公司的细菌核酸提取试剂盒提取样品DNA, DNA 0D26。/ OD挪能够达到l. 8，浓度达到20 ng/(jL。(2) 进行产毒素B艰难梭菌的环介导等温扩增反应A. 在装有22ijL LAMP反应液的反应管中加入2ijL待检模板DNA，和O. 5pL的UNG 酶，于恒温水浴上50。C放置3 min， 95。C放置5 min，立即置于冰上l min;B. 在各反应管中加入l |JL Bst DNA聚合酶，并于恒温水浴上65 'C扩增反应1 小时；C. 将水浴调到80 。C终止反应，3 min后取出待检；(3) 显色检测在待检的每个反应管中加入l pL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜 色变为绿色，说明待检样品为产毒素B艰难梭菌。 实施例2按下列配方制作产毒素B艰难梭菌的环介导等温扩增反应液 (1) LAMP反应液含有2. 5|JL 10XThermopol反应缓冲液、1. 4jjL 25mmol/L dNTP、4. 0 |JL 10|Jmol/L 上游内引物(FIP)、 4.0 |JL 10 nmol/L下游内引物(BIP)、 0.5 |jL 10ymol/L上游 外引物(F3)、 0.5 |JL 10 iJmol/L下游外引物(B3)、 2|jL 100 mmol/L MgS04、 5 pL 5mol/L甜菜碱和2. lpL ddH20 (灭菌双蒸水)。其中所述的上游内引物、下游内引物、上游外引物、下游外引物同上。 上述混合物dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP: dATP: dGTP: dCTP= 2:1:1:1。(2)UNG酶1 U/|JL;(3) Bst DNA聚合酶8U /|jL;(4) 显色剂为10X的荧光染料DNAGreen。 按照以下(1) - (3)程序进行检测-(1) 样品DNA的提取检测菌种艰难梭菌(Clostridium difficile),菌种来源美国典型培养物保藏 中心，编号ATCC9689。使用大连宝生物工程公司的植物核酸提取试剂盒提取样品DNA， DNA 0D260/ 0D280能够达到1.8，浓度达到20 ng/|jL。(2) 进行产毒素B艰难梭菌的环介导等温扩增反应-A. 在装有22pL LAMP反应液的反应管中加入2IJL待检模板DNA，和O. 5pL的UNG 酶，于恒温水浴上50。C放置3 min， 95。C放置5min，立即置于冰上l min;B. 在各反应管中加入llJLBstDNA聚合酶，并于恒温水浴上65'C扩增反应1 h;C. 将水浴调到8(TC终止反应，3 min后取出待检；(3) 显色检测在待检的每个反应管中加入1IJL显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液颜 色变为绿色，则待检样品也为产毒素B艰难梭菌。核苷酸序列表〈110>山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心〈120〉产毒素B艰难梭菌环介导等温扩增快速检测方法〈歸4〈210〉 1〈211> 50<212〉 DNA〈213〉人工序列〈221> prim一bind〈222〉 (l)... (50)〈400> 1AGGAGMGCAATTGATTTTACTGGA-TACAGCTCCTCTATMTTATCTTCA 50<210〉 2 〈211> 47 〈212〉 DNA 〈213〉人工序列 〈221〉 prim一bind 〈222> (1)…(47) 〈400〉 2AAGTGTATTAGCTGGGGCAAAATAT-TATTTCAACCAMGTGGAGTGT 47<210> 3 〈211〉 24 〈212>歸 〈213〉人工序列 〈221〉 prim—bind 〈222> (1)…(24) <400〉 3TTCACCATCTMTTCTTTCCATTC 24〈210> 4 〈211〉 24 <212> DNA 〈213〉人工序列 <221〉 prim—bind 〈222〉 (1)…(24) 〈400> 4CAATTGGAGAGACAATAATTGATG 2权利要求
1.环介导等温扩增检测产毒素B艰难梭菌的试剂，其特征是该试剂包括(1)-(4)(1)环介导等温扩增反应液包括10×Thermopol反应缓冲液、1.0-1.4mmol/L dNTP、4-8mmol/L硫酸镁(MgSO4)、0.8-1.6μmol/L上游引内物(FIP)、0.8-1.6μmol/L下游内引物(BIP)、0.2-0.3μmol/L上游外引物(F3)、0.2-0.3μmol/L下游外引物(B3)和1-1.5mol/L甜菜碱；其中10×Thermopol反应缓冲液含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸、100mmol/L氯化钾、100mmol/L硫酸铵、20mmol/L硫酸镁和1％曲拉通X-100；其中，上游内引物5-AGGAGAAGCAATTGATTTTACTGGA-TACAGCTCCTCTATAATTATCTTCA-3；下游内引物5-AAGTGTATTAGCTGGGGCAAAATAT-TATTTCAACCAAAGTGGAGTGT-3；上游外引物5-TTCACCATCTAATTCTTTCCATTC-3；下游外引物5-CAATTGGAGAGACAATAATTGATG-3；(2) UNG酶1U/μL；(3)Bst DNA聚合酶8U/μL；(4)显色剂为10％的荧光染料SYBR GREEN I或者DNAGreen。
2. 环介导等温扩增检测产毒素B艰难梭菌的试剂，其特征是上述的 dNTP内的四种脱氧核糖核酸的质量比为dUTP:dATP:dGTP:dCTP =2:1:1:1。
3. 利用权利要求1中所述的试剂进行等温快速检测产毒素B艰难梭菌的方法，其特征是依次包括(1) - (3)下列步骤 (1)待检样品或细菌DNA的提取提取待检样品核酸，其中提取的样品DNA 0D26Q/ OD咖在1. 6-2. 0范围 内，浓度在10-100 ng/nL范围内；(2) 进行产毒素B艰难梭菌的环介导等温扩增反应A. 在装有22uL LAMP反应液的反应管中加入2uL待检样品模板DNA,和 0. 5u丄的丽G酶，于恒温95 。C放置3 —5 min，立即置于冰上1 —3 min;B. 再在反应管中加入luL Bst DNA聚合酶，并于恒温65 。C扩增反应45 —90 min;C. 将温度调到80 。C终止反应，3 — 5 min后取出待检；(3) 显色检测在每个反应管中加入L显色剂，直接用肉眼观察颜色变化，反应液 颜色变为绿色，说明待检样品含有或为产毒素B艰难梭菌。
全文摘要
本发明涉及一种产毒素B艰难梭菌环介导等温扩增快速检测方法。其中的试剂包括环介导等温扩增反应液、Bst DNA聚合酶、显色剂；反应液含有反应缓冲液、dNTP、硫酸镁、上游内引物5-AGGAGAAGCAATTGATTTTACTGGA-TACAGCTCCTCTATAATTATCTTCA-3、下游内引物5-AAGTGTATTAGCTGGGGCAAAATAT-TATTTCAACCAAAGTGGAGTGT-3、上游外引物5-TTCACCATCTAATTCTTTCCATTC-3、下游外引物5-CAATTGGAGAGACAATAATTGATG-3和甜菜碱；检测产毒素B艰难梭菌的方法包括细菌DNA的提取、产毒素B 艰难梭菌的环介导等温扩增、显色检测。其优点是快速、特异性强、灵敏度高而且成本低。
文档编号C12Q1/04GK101402998SQ20081015790
公开日2009年4月8日 申请日期2008年10月15日 优先权日2008年10月15日
发明者刘云国, 静 唐, 姜英辉, 健 张, 房保海, 李正义, 祝素珍, 楠 贺, 贾俊涛, 赵丽青, 雷质文, 马维兴 申请人:山东出入境检验检疫局检验检疫技术中心