抗艰难梭菌毒素抗体及其用途的制作方法

专利名称：抗艰难梭菌毒素抗体及其用途的制作方法
相关信息本申请要求2004年2月6日提交的美国临时专利申请号60/542,357和2004年9月28日提交的美国临时专利申请号60/613,854的优先权，这两份专利申请的全部内容在此引用作为参考。
在本说明书全文中引用的任何专利、专利申请和参考文献的内容均在此全文引用作为参考。
背景技术：
艰难梭菌(C.difficile)是一种革兰氏阳性菌，它在人类中引起胃肠疾病。艰难梭菌是医院患者中传染性腹泻的最常见的原因，并且是最常见的医院感染之一(Kelly等，New Eng.J.Med.，330257-62，1994)。事实上，与该病原体有关的疾病在美国每年可能折磨多达300万住院患者(McFarland等，New Eng.J.Med.，320204-10，1989；Johnson等，Lancet，33697-100，1990)。
用破坏正常肠内菌群的抗生素如氨苄青霉素、阿莫西林、头孢菌素类和克林霉素治疗能够使肠内聚集艰难梭菌并且引起艰难梭菌病(Kelly和Lamont，Annu.Rev.Med.，49375-90，1998)。艰难梭菌病的发作一般在抗生素治疗开始4至9天后发生，但是也可能在中断抗生素治疗后发生。艰难梭菌能够引起从中度到重度腹泻和结肠炎的症状，包括假膜性结肠炎(PMC)，PMC是一种严重的结肠炎类型，其特征在于腹痛、水泻和全身疾病(例如发热、恶心)。在对第一次疾病发作进行治疗的患者中最多有20％可能发生疾病复发，而且复发者具有较高的再次复发的危险(Kelly和Lamont，Annu.Rev.Med.，49375-90，1998)。
艰难梭菌病被认为是由两种外毒素即毒素A和毒素B作用于肠上皮引起的。这两种毒素都是高分子量蛋白质(280-300 kDa)，在宿主细胞中催化Rho蛋白的共价修饰，Rho蛋白是参与肌动蛋白聚合的小GTP-结合蛋白。这些毒素修饰Rho蛋白使它们灭活，导致肌动蛋白丝的解聚和细胞死亡。这两种毒素当肠胃外注射时对于小鼠是致死性的(Kelly和Lamont，Annu.Rev.Med.，49375-90，1998)。
艰难梭菌病可以通过检测粪便标本中毒素A或毒素B的存在或活性的测定法例如酶免疫测定法来诊断。细胞毒素测定法可以用来检测毒素活性。为了进行细胞毒素测定，过滤粪便以除去细菌，并且检测毒素对培养细胞的细胞致病作用(Merz等，J.Clin.Microbiol.，321142-47，1994)。
艰难梭菌治疗因抗生素引发艰难梭菌相关疾病的事实而复杂化。但是，抗生素是目前的首要治疗选择。常常使用引起艰难梭菌相关疾病可能性最小的抗生素，如万古霉素和甲硝唑。可能在其他微生物中产生对万古霉素的抗性是对使用该抗生素进行治疗的顾虑的一个原因，因为这是对其他微生物感染的唯一有效的治疗方法(Gerding，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，250127-39，2000)。也采用益生(probiotic)方法，其中向受试者施用可能与致病菌竞争生活环境的非致病性微生物。例如，曾经报道了万古霉素和Saccharomyces boulardii的联合治疗(McFarland等，JAMA.，271(24)1913-8，1994.Erratum inJAMA，272(7)518，1994)。
已经开发了在疾病感染模型中保护动物免遭致死性攻击的疫苗(Torres等，Infect.Immun.63(12)4619-27，1995)。另外，多克隆抗体显示当通过注射或摄食施用时可保护仓鼠不患疾病(Giannasca等，Infect.Immun.67(2)527-38，1999；Kink和Williams，Infect.Immun.，66(5)2018-25，1998)。已经分离了在体内和体外可与艰难梭菌毒素结合并中和其活性的鼠单克隆抗体(Corthier等，Infect.Immun.，59(3)1192-5，1991)。有一些报道是关于含有毒素中和抗体的人多克隆抗体能够预防艰难梭菌的复发(Salcedo等，Gut.，41(3)366-70，1997)。对抗毒素A的抗体应答已经与疾病结果相关联，指示了体液应答在控制感染中的效能。与具有低毒素A抗体水平的个体相比，具有强毒素A ELISA反应的个体患有严重性较低的疾病(Kyne等，Lancet，357(9251)189-93，2001)。
毒素A和毒素B在疾病发病机理中的各自的作用，以及抗毒素抗体在对抗艰难梭菌病的保护中的作用，存在争议，并且可能取决于宿主。在人类中，抗毒素A抗体应答与疾病结果有关，提示保护需要抗毒素A应答。这一发现与只表达毒素B的致病艰难梭菌生物的报道相反，暗示毒素B可能引起人类疾病。这些毒素A阴性的菌株也可以在仓鼠中引起疾病(Sambol等，J.Infect.Dis.，183(12)1760-6，2001)。
发明概述本发明部分地基于以下发现向受试者施用抗艰难梭菌毒素A抗体能够在体内保护该受试者不会复发艰难梭菌介导的疾病。施用抗毒素A和毒素B中之一或两者的抗体能够预防主要的艰难梭菌介导的疾病。例如，在小鼠中，例如在表达人免疫球蛋白基因区段的转基因小鼠中，可以产生抗艰难梭菌毒素的高亲和力抗体。这些抗体能够在体外中和毒素细胞毒性，并且在体内中和毒素的肠毒性。识别毒素A和/或毒素B的抗体能够在体内抑制及保护不患疾病。
一方面，本发明提供了与艰难梭菌外毒素特异性结合的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分。在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分与艰难梭菌毒素A(毒素A)特异性结合。在另外一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分与艰难梭菌毒素B(毒素B)特异性结合。在另外一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分与毒素A和毒素B均特异性结合。
在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分在体外中和毒素A，抑制毒素A与哺乳动物细胞的结合，和/或在体内抑制艰难梭菌介导的疾病。
在多个实施方案中，该抗体或其抗原结合部分具有下列一个或多个特征当施用于小鼠时，它们能够保护被施以可使未施用抗体的对照小鼠致死量的艰难梭菌毒素的小鼠；在受试者中防止或抑制艰难梭菌介导的结肠炎、抗体相关的结肠炎或假膜性结肠炎(PMC)；在受试者中防止或抑制腹泻；和/或抑制艰难梭菌介导的疾病的复发。
该抗体或其抗原结合部分能够特异性结合毒素A的N端一半内的表位，例如毒素A的氨基酸1-1256之间的表位。在另外一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分特异性结合毒素A的C末端受体结合结构域内的表位，例如毒素A的氨基酸1852-2710之间的表位，或者毒素A的氨基酸659-1852之间的表位，例如氨基酸残基900-1852、900-1200或920-1033之间的表位。在另外一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分特异性结合毒素A的氨基酸1-600、400-600或415-540之间的表位。其他特定抗体或其抗原结合部分能够特异性结合毒素A的氨基酸残基1-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、900-1000、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1800-1900、1900-200、2100-2200或2200-2300、2300-2400、2400-2500、2500-2600、2600-2710或其任意间隔、部分或范围内的表位。
在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分以低于约20×10-6M的KD与毒素A特异性结合。在一个具体实施方案中，该抗体或其抗原结合部分以低于约10×10-7M、低于约10×10-8M、低于约10×10-9M或低于约10×10-10M的KD与毒素A特异性结合。在另外的具体实施方案中，该抗体或其抗原结合部分以低于约50×10-10M、低于约20×10-10M、低于约15×10-10M、低于约8×10-10M或低于约5×10-10M的KD与毒素A特异性结合。
在各种其他实施方案中，该抗体或其抗原结合部分包含可变重链区，该可变重链区包含与克隆3D8(SEQ ID NO1)、1B11(SEQ ID NO2)或3H2(SEQ ID NO3)产生的抗体的可变重链区氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或以上相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分包含可变轻链区，该可变轻链区包含与克隆3D8(SEQ ID NO4)、1B11(SEQ ID NO5)或3H2(SEQ ID NO6)产生的抗体的可变轻链区氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或以上相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分包含可变重链区和可变轻链区，该可变重链区包含与克隆3D8(SEQ ID NO1)、1B11(SEQ IDNO2)或3H2(SEQ ID NO3)产生的抗体的可变重链区氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或以上相同的氨基酸序列，该可变轻链区包含与克隆3D8(SEQ ID NO4)、1B11(SEQ ID NO5)或3H2(SEQID NO6)产生的抗体的可变轻链区氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或以上相同的氨基酸序列。
在多个实施方案中，该抗体或其抗原结合部分与一个表位特异性结合，该表位与被克隆3D8、1B11或3H2产生的抗体结合的表位重叠，和/或与克隆3D8、1B11或3H2产生的抗体竞争结合毒素A。
该抗体或其抗原结合部分的可变重链区可以包括一个或多个互补决定区(CDR)，该CDR与克隆3D8(SEQ ID NOs7-9)、1B11(SEQ IDNOs10-12)或3H2(SEQ ID NOs13-15)产生的抗体的CDR至少80％、85％、90％、95％或99％或以上相同(也示于表1中)。
该抗体或其抗原结合部分的可变轻链区可以包括一个或多个CDR，该CDR与克隆3D8(SEQ ID NOs16-18)、1B11(SEQ ID NOs19-21)或3H2(SEQ ID NOs22-24)产生的抗体的CDR至少80％、85％、90％、95％或99％或以上相同(也示于表2中)。
该抗体或其抗原结合部分的可变重链区可以包括一个或多个互补决定区(CDR)，该CDR与克隆3D8(SEQ ID NOs7-9)、1B11(SEQ IDNOs10-12)或3H2(SEQ ID NOs13-15)产生的抗体的CDR至少80％、85％、90％、95％或99％或以上相同，并且该抗体或其抗原结合部分的可变轻链区可以包括一个或多个CDRs，该CDR与克隆3D8(SEQ IDNOs16-18)、1B11(SEQ ID NOs19-21)或3H2(SEQ ID NOs22-24)产生的抗体的CDR至少80％、85％、90％、95％或99％或以上相同。
该抗体或其抗原结合部分的可变重链区可以包括三个CDR，该CDR与克隆3D8(SEQ ID NOs7-9)、1B11(SEQ ID NOs10-12)或3H2(SEQ IDNOs13-15)产生的抗体的可变重链区的CDR至少80％、85％、90％、95％或99％或以上相同。
在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分的可变轻链区包括三个CDR，该CDR与克隆3D8(SEQ ID NOs16-18)、1B11(SEQ IDNOs19-21)或3H2(SEQ ID NOs22-24)产生的抗体的可变轻链区的CDR至少80％、85％、90％、95％或99％或以上相同。
在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分的可变轻链区包括一个或多个CDR，该CDR与克隆3D8(SEQ ID NOs16-18)、1B11(SEQ IDNOs19-21)或3H2(SEQ ID NOs22-24)产生的抗体的可变轻链区的CDR至少80％、85％、90％、95％或99％或以上相同，并且该抗体或其抗原结合部分的可变重链区包括三个CDR，该CDR与克隆3D8(SEQ IDNOs7-9)、1B11(SEQ ID NOs10-12)或3H2(SEQ ID NOs13-15)产生的抗体的可变重链区的CDR至少80％、85％、90％、95％或99％或以上相同。该可变轻链区可包括三个CDR，该CDR与克隆3D8(SEQ IDNOs16-18)、1B11(SEQ ID NOs19-21)或3H2(SEQ ID NOs22-24)产生的抗体的可变轻链区的CDR至少80％、85％、90％、95％或99％或以上相同。
在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分的可变重链区包括三个CDR，该CDR与克隆3D8(SEQ ID NOs7-9)、1B11(SEQ ID NOs10-12)或3H2(SEQ ID NOs13-15)产生的抗体的可变重链区的CDR相同，并且该抗体或其抗原结合部分的可变轻链区包括三个CDR，该CDR与克隆3D8(SEQ ID NOs16-18)、1B11(SEQ ID NOs19-21)或3H2(SEQ IDNOs22-24)产生的抗体的可变轻链区的CDR相同，例如，该抗体或其抗原结合部分的可变轻链区和可变重链区与克隆3D8(SEQ ID NO1，SEQID NO4)、1B11(SEQ ID NO2，SEQ ID NO5)或3H2(SEQ ID NO3，SEQID NO6)产生的抗体的可变轻链区和可变重链区相同在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分在体外中和毒素B，抑制毒素B与哺乳动物细胞的结合，和/或在体内中和毒素B。
在一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分与毒素B的C末端部分中的表位(例如在毒素B的氨基酸1777-2366之间)特异性结合。其他特定抗体或其抗原结合部分能够与毒素B的氨基酸残基1-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800、900-1000、1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1800-1900、1900-200、2100-2200或2200-2366或其任意间隔、部分或范围内的表位特异性结合。
在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分以低于约20×10-6M的KD与毒素B特异性结合。在一个具体实施方案中，该抗体或其抗原结合部分以低于约10×10-7M、低于约10×10-8M、低于约10×10-9M或低于约10×10-10M的KD与毒素B特异性结合。在另外的具体实施方案中，该抗体或其抗原结合部分以低于约50×10-10M、低于约20×10-10M、低于约15×10-10M、低于约8×10-10M或低于约5×10-10M的KD与毒素B特异性结合。
在各种其他实施方案中，该抗体或其抗原结合部分包含可变重链区，该可变重链区包含与克隆124-152(即SEQ ID NO54所示的氨基酸序列)、2A11或1G10产生的抗体的可变重链区氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或以上相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分包含可变轻链区，该可变轻链区包含与克隆124-152(即SEQ ID NO58所示的氨基酸序列)、2A11或1G10产生的抗体的可变重链区氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或以上相同的氨基酸序列。
在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分包含可变重链区和可变轻链区，该可变重链区包含与克隆124-152(即SEQ ID NO54所示的氨基酸序列)、2A11或1G10产生的抗体的可变重链区氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或以上相同的氨基酸序列，该可变轻链区与克隆124-152(即SEQ ID NO58所示的氨基酸序列)、2A11或1G10产生的抗体的可变轻链区氨基酸序列至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或以上相同的氨基酸序列。
在多个实施方案中，该抗体或其抗原结合部分与一个表位特异性结合，该表位与克隆124-152、2A11或1G10产生的抗体所结合的表位重叠，和/或与克隆124-152、2A11或1G10产生的抗体竞争结合毒素B。
该抗体或其抗原结合部分的可变重链区可包括一个或多个互补决定区(CDR)，该CDR与克隆124-152(SEQ ID NOs62、64或66)、2A11或1G10产生的抗体的CDR(表3)至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或以上相同。
该抗体或其抗原结合部分的可变轻链区可包括一个或多个互补决定区(CDR)，该CDR与克隆124-152(SEQ ID NOs68、70或72)、2A11或1G10产生的抗体的CDR(表4)至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或以上相同。
该抗体或其抗原结合部分的可变重链区可包括一个或多个互补决定区(CDR)，该CDR与克隆124-152(SEQ ID NOs62、64或66)、2A11或1G10产生的抗体的CDR至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或以上相同，并且该抗体或其抗原结合部分的可变轻链区可包括一个或多个互补决定区(CDR)，该CDR与克隆124-152(SEQ ID NOs68、70或72)、2A11或1G10产生的抗体的CDR至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或以上相同。
该抗体或其抗原结合部分的可变重链区可包括三个CDR，该CDR与克隆124-152(SEQ ID NOs62、64或66)、2A11或1G10产生的抗体的可变重链区的CDR至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或以上相同。
在某些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分的可变轻链区包括三个CDR，该CDR与克隆124-152(SEQ ID NOs68、70或72)、2A11或1G10产生的抗体的可变轻链区的CDR至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或以上相同。
在其他实施方案中，该抗体或其抗原结合部分的可变轻链区包括一个或多个CDR，该CDR与克隆124-152(SEQ ID NOs68、70或72)、2A11或1G10产生的抗体的可变轻链区的CDR至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或以上相同，并且该抗体或其抗原结合部分的可变重链区包括三个CDR，该CDR与克隆124-152(SEQ ID NOs62、64或66)、2A11或1G10产生的抗体的可变重链区的CDR至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或以上相同。该可变轻链区可包括三个CDR，该CDR与克隆124-152(SEQ ID NOs68、70或72)、2A11或1G10产生的抗体的可变轻链区的CDR至少80％、85％、90％、95％、98％或99％或以上相同。
在另外一些实施方案中，该抗体或其抗原结合部分的可变重链区包括三个CDR，该CDR与克隆124-152(SEQ ID NOs62、64或66)、2A11或1G10产生的抗体的可变重链区的CDR相同，并且该抗体或其抗原结合部分的可变轻链区包括三个CDR，该CDR与克隆124-152(SEQ IDNOs68、70或72)、2A11或1G10产生的抗体的可变轻链区的CDR相同，例如该抗体或其抗原结合部分的可变轻链区和可变重链区与克隆124-152(SEQ ID NOs62、64或66)、2A11或1G10产生的抗体的可变轻链区和可变重链区相同。
该抗体或其抗原结合部分可以是全长抗体，可以包含效应结构域，例如Fc结构域，可以是免疫球蛋白γ同种型抗体、单链抗体或Fab片段。该抗体或其抗原结合部分还可包括药物可接受的载体和/或标记物。
在多个实施方案中，包含该抗体或其抗原结合部分的组合物不含其他人多肽(例如，它们含有少于5％的该抗体或其抗原结合部分以外的人多肽)。
在又另一方面，本发明提供了包含以下组分的组合物(a)与艰难梭菌外毒素特异性结合的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，和(b)与艰难梭菌外毒素特异性结合的多克隆抗体或其抗原结合部分。
在一个实施方案中，所述人单克隆抗体或其抗原结合部分与艰难梭菌毒素A特异性结合，所述多克隆抗体或其抗原结合部分与艰难梭菌毒素B特异性结合。在一个实施方案中，所述人单克隆抗体或其抗原结合部分与艰难梭菌毒素B特异性结合，所述多克隆抗体或其抗原结合部分与艰难梭菌毒素A特异性结合。这些抗体可包括此处所述的其他特征。
在另一方面，本发明提供了与艰难梭菌外毒素特异性结合的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体(a)包括产生自或来源于人VH 3-33基因的重链可变区；和/或(b)包括产生自或来源于人Vκ基因的轻链可变区，该人Vκ基因选自VκL19、VκL6和VκL15。该抗体或其抗原结合部分可包括此处所述的其他特征。
在另一方面，本发明提供了与艰难梭菌外毒素特异性结合的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中该抗体(a)包括产生自或来源于人VH 5-51基因的重链可变区；和/或(b)包括产生自或来源于人VκA27基因的轻链可变区。该抗体或其抗原结合部分也可包括此处所述的其他特征。
在另一方面，本发明提供了包含杂交瘤克隆3D8、1B11或3H2产生的抗体(在此也称作“3D8”、“1B11”和“3H2”)的抗原结合部分的分离的多肽。
在另一方面，本发明提供了包含杂交瘤克隆124-152，2A11或1G10产生的抗体(在此也称作“124-152”、“2A11”和“1G10”)的抗原结合部分的分离的多肽。
在另一方面，本发明提供了与艰难梭菌外毒素特异性结合、中和该毒素、抑制和/或防止艰难梭菌介导的疾病的分离的单克隆抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，该抗体或其抗原结合部分是哺乳动物(例如人)抗体或其抗原结合部分。该抗体或其抗原结合部分可包括此处所述的其他特征。
在另一方面，本发明提供了包含以下组分的组合物(a)与艰难梭菌毒素A特异性结合的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分；和(b)与艰难梭菌毒素B特异性结合的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分。
在另一方面，本发明提供了分离的核酸，其包括编码与SEQ IDNOs1、2、3、4、5或6至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或以上相同的多肽的序列；例如，其中该核酸序列与SEQ ID NOs38、39、40、35、36或37至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或以上相同。本发明也提供了表达载体，其包括编码与SEQ ID NOs1、2、3、4、5或6至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或以上相同的多肽的核酸；例如，其中该核酸序列与SEQ ID NOs38、39、40、35、36或37至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或以上相同，以及宿主细胞，例如细菌细胞，例如大肠杆菌细胞，其包含编码与SEQ ID NOs1、2、3、4、5或6至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或以上相同的多肽的核酸；例如，其中该核酸序列与SEQ ID NOs38、39、40、35、36或37至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或以上相同。
在另一方面，本发明提供了分离的核酸，其包括编码与SEQ ID NOs54、56、58或60至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或以上相同的多肽的序列；例如，其中该核酸序列与SEQ ID NOs55、57、59或61至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或以上相同。本发明也提供了表达载体，其包括编码与SEQ ID NOs54、56、58或60至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或以上相同的多肽的核酸；例如，其中该核酸序列与SEQ ID NOs55、57、59或61至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或以上相同。本发明也提供宿主细胞，例如细菌细胞，例如大肠杆菌细胞，其包含编码与SEQ ID NOs54，56，58或60至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或以上相同的多肽的核酸；例如，其中该核酸序列与SEQ ID NOs55、57、59或61至少75％、80％、85％、90％、95％、99％或以上相同。
该宿主细胞也可以是真核细胞，例如酵母细胞、哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NSO细胞或骨髓瘤细胞。
在另一方面，本发明提供了试剂盒，其包括与艰难梭菌外毒素特异性结合的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，例如此处所述的抗体或其抗原结合部分。该试剂盒可包括用于预防或治疗艰难梭菌介导的疾病的说明。
该试剂盒还可包括与艰难梭菌外毒素特异性结合的多克隆抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，所述人单克隆抗体或其抗原结合部分与艰难梭菌毒素A特异性结合。在一个实施方案中，该多克隆抗体或其抗原结合部分与艰难梭菌毒素B特异性结合。
在另一方面，本发明提供了包括下列组分的试剂盒(a)与艰难梭菌毒素A特异性结合的分离的人单克隆抗体；和(b)与艰难梭菌毒素B特异性结合的分离的人单克隆抗体。
本发明还提供了治疗受试者的艰难梭菌病的方法，是通过以有效抑制艰难梭菌病，例如艰难梭菌介导的结肠炎、抗生素相关的结肠炎、艰难梭菌介导的假膜性结肠炎(PMC)或腹泻或艰难梭菌介导的疾病复发的量，向该受试者施用与艰难梭菌外毒素特异性结合的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分。该抗体或其抗原结合部分可以向受试者例如静脉内、肌肉内或皮下施用。
该抗体或其抗原结合部分可以单独施用或与另外一种治疗剂例如第二种人单克隆抗体或其抗原结合部分联合施用。在一个实施例中，该抗体或其抗原结合部分与艰难梭菌毒素A特异性结合，而第二种人单克隆抗体或其抗原结合部分与艰难梭菌毒素B特异性结合。在另一实施例中，该第二种药物是一种抗生素，例如万古霉素或甲硝唑。该第二种药物可以是多克隆γ-球蛋白(例如人γ-球蛋白)。
在一个具体实施方案中，施用一种抗体或其抗原结合部分，其包括与克隆3D8产生的抗体的可变轻链区和可变重链区相同的可变轻链区和可变重链区(即包含与SEQ ID NO4相同的可变轻链区序列和与SEQ IDNO1相同的可变重链区序列)。
在另一个实施方案中，该抗体或其抗原结合部分与一种抗体或其抗原结合部分联合施用，后者包含与克隆124-152产生的抗体的可变轻链区和可变重链区相同的可变轻链区和可变重链区(即包含与SEQ IDNO58相同的可变轻链区序列和与SEQ ID NO54相同的可变重链区序列)。
在又另一个实施方案中，克隆3D8产生的抗体或其抗原结合部分(即包含与SEQ ID NO4相同的可变轻链区序列和与SEQ ID NO1相同的可变重链区序列)与克隆124-152产生的抗体或其抗原结合部分(即包含与SEQ ID NO58相同的可变轻链区序列和与SEQ ID NO54相同的可变重链区序列)联合施用。
在另一方面，本发明提供了制备与艰难梭菌外毒素特异性结合的抗体或其抗原结合部分的方法，是通过用包含灭活的外毒素的组合物免疫具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因非人动物，以及从该动物中分离抗体。该外毒素可以通过例如用UDP-二醛处理或者突变(例如利用重组方法)灭活。该方法还可包括评价该抗体与该外毒素的结合。
本发明也提供了制备人单克隆抗体或其抗原结合部分的方法，是通过提供编码与艰难梭菌外毒素特异性结合的人单克隆抗体或其抗原结合部分的核酸，以及在宿主细胞中表达该核酸。
在又另一方面，本发明提供了杂交瘤或转染瘤，其包含编码克隆3D8、1B11或3H2产生的抗体的抗原结合部分(例如CDR或可变区)的核酸。
在又另一方面，本发明提供了杂交瘤或转染瘤，其包含编码克隆124-152、2A11或1G10产生的抗体的抗原结合部分(例如CDR或可变区)的核酸。
另外，本发明提供了一种制备杂交瘤的方法，该杂交瘤表达与艰难梭菌外毒素特异性结合的抗体，是通过用包含该外毒素的组合物免疫具有包含人重链转基因和人轻链转基因的基因组的转基因非人动物，其中该毒素被灭活；从动物中分离脾细胞；由该脾细胞产生杂交瘤；以及选择产生与该外毒素特异性结合的抗体的杂交瘤。
用人单克隆抗体对人进行治疗具有几个优点。例如，这些抗体在人体中比非人抗体免疫原性更低。治疗迅速；该抗体一到达感染部位并直接中和致病毒素，即可发生毒素灭活。人抗体比非人抗体更有效地定位于人体内的适当部位。此外，与传统的抗生素治疗不同，该治疗是艰难梭菌特异性的，不破坏正常的肠菌群。
通过下面的详述和权利要求书，本发明的其他特征和优点将是显而易见的。
附图简述

图1是一张表，列出了来自每个克隆的mRNA序列编码的VH和VL链的氨基酸序列。小写字母代表前导肽的氨基酸。CDR以下划线标出。表达6个独特的轻链V区的克隆3D8只表达I组氨基酸序列。
图2A表示克隆3D8表达的VL链的氨基酸和核酸序列。V区段和J区段基因在氨基酸和核酸序列上方列出。CDR在上方划线。
图2B表示克隆3D8表达的VH链的氨基酸和核酸序列。V区段、D区段和J区段基因在氨基酸和核酸序列上方列出。CDR在上方划线。
图3A表示克隆1B11表达的VL链的氨基酸和核酸序列。V区段和J区段基因在氨基酸和核酸序列上方列出。CDR在上方划线。
图3B表示克隆1B11表达的VH链的氨基酸和核酸序列。V区段、D区段和J区段基因在氨基酸和核酸序列上方列出。CDR在上方划线。
图4A表示克隆33.3H2(在此称为3H2；33.3H2和3H2在此可互换使用)表达的VL链的氨基酸和核酸序列。V区段和J区段基因在氨基酸和核酸序列上方列出。CDR在上方划线。
图4B表示克隆33.3H2表达的VH链的氨基酸和核酸序列。V区段和J区段基因在氨基酸和核酸序列上方列出。CDR在上方划线。
图5是显示ELISA试验结果的图，该试验测定抗毒素A单克隆抗体与毒素A的结合。
图6A-B是显示在存在和不存在抗毒素A单克隆抗体的情况下体外中和试验结果的一组图。图6A显示用IMR-90细胞进行的试验的结果。图6B显示用T-84细胞进行的试验的结果。
图7是毒素A多肽的图示，标出了为了表位作图研究而分析的片段。
图8A-B是为了表位作图研究而被分析的毒素A片段的图示。
图9是一张表，列出了测定抗毒素A单克隆抗体保护小鼠免遭毒素A致死性攻击的体内试验的结果。
图10表示用于测定抗毒素抗体的体内中和效能的小鼠回肠袢液体积累测定的结果。
图11A是在仓鼠复发模型中对仓鼠施用各种药剂的时间线的图示。
图11B表示测定结果，表示为克林霉素处理后进行艰难梭菌攻击后存活的仓鼠的百分数。
图12表示仓鼠复发试验的结果，表示为克林霉素处理后进行艰难梭菌攻击后存活的仓鼠的百分数。
图13表示在存在和不存在来自类毒素B免疫的山羊的多克隆抗血清的情况下测定毒素A和毒素B体外中和的试验的结果。“G330”是指检测来自山羊#330的血清的样品。“G331”是指检测来自山羊#331的血清的样品。
图14是在仓鼠复发模型中对仓鼠施用各种药剂的时间线的图示。
图15表示仓鼠复发试验的结果，表示为克林霉素处理后进行艰难梭菌攻击后存活的仓鼠的百分数。仓鼠用万古霉素，万古霉素和3D8，万古霉素和来自山羊#331的抗血清，或万古霉素、3D8和来自山羊#331的抗血清处理。
图16表示仓鼠复发试验的结果，表示为克林霉素处理后进行艰难梭菌攻击后健康动物的百分数。“山羊331”是指来自山羊#331的抗血清。
图17表示仓鼠复发试验的结果，表示为克林霉素处理后进行艰难梭菌攻击后存活的仓鼠的百分数。仓鼠在克林霉素处理前用毒素B的片段免疫。仓鼠用万古霉素、万古霉素和3D8处理，或者不接受处理。
图18表示仓鼠复发试验的结果，表示为克林霉素处理后进行艰难梭菌攻击后健康动物的百分数。仓鼠在克林霉素处理前用毒素B的片段免疫。
图19是在艰难梭菌直接攻击模型中对仓鼠施用各种药剂的时间线的图示。“331”是指来自山羊#331的抗血清。“Clinda”是指用克林霉素处理。
图20表示直接攻击试验的结果，表示为直接艰难梭菌攻击后存活的仓鼠的百分数。
图21表示直接攻击试验的结果，表示为直接艰难梭菌攻击后健康动物的百分数。
图22表示艰难梭菌毒素A的氨基酸序列。
图23表示艰难梭菌毒素B的氨基酸序列。
图24表示初次攻击试验的结果，表示为直接艰难梭菌攻击后存活的仓鼠的百分数。
图25表示初次攻击试验的结果，表示为直接艰难梭菌攻击后存活的仓鼠的百分数。
图26表示初次攻击试验的结果，表示为直接艰难梭菌攻击后存活的仓鼠的百分数。
图27表示在抗毒素B的单克隆抗体或抗毒素B的山羊多克隆血清的存在下测定毒素A和毒素B体外中和的试验的结果。
图28表示克隆124-152表达的VH链的氨基酸和核酸序列。V区段、D区段和J区段基因在氨基酸和核酸序列上方列出。CDR在上方划线。
图29表示克隆124-152表达的VL链的氨基酸和核酸序列。V区段和J区段基因在氨基酸和核酸序列上方列出。CDR在上方划线。
图30表示克隆124-152表达的VH链的氨基酸和相关种系序列。V区段、D区段和J区段基因在氨基酸序列上方列出。CDR在上方划线。
图31表示克隆124-152表达的VL链的氨基酸和相关种系序列。V区段和J区段基因在氨基酸序列上方列出。CDR在上方划线。
图32是毒素B多肽的图示，标出了为表位作图研究而分析的片段。
在各个附图中同样的符号代表同样的成分。
发明详述为了清楚地理解说明书和权利要求书，下面提供了下列定义。
定义术语“毒素A”是指艰难梭菌编码的毒素A蛋白质。艰难梭菌毒素A的氨基酸序列(SEQ ID NO41)在GenBank中提供，登记号为A37052，版本GI 98593(参见图22)。“毒素B”是指艰难梭菌编码的毒素B蛋白质。艰难梭菌毒素B的氨基酸序列(SEQ ID NO42)在GenBank中提供，登记号为S70172，版本GI 7476000(参见图23)。“蛋白质”与“多肽”可互换使用。
“抗艰难梭菌抗体”是与艰难梭菌产生的蛋白质或其他成分相互作用(例如结合)的抗体。“抗毒素抗体”是与艰难梭菌产生的毒素(例如毒素A或毒素B)相互作用的抗体。抗毒素蛋白质抗体可以结合表位，例如构象或线性表位，或者结合全长毒素蛋白质的片段。
“人抗体”是具有来源于人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。此处所述的人抗体可以包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如，通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。
抗毒素抗体或其抗原结合部分可以单独施用或与第二种药剂联合施用。受试者可以是感染艰难梭菌或具有艰难梭菌相关疾病(“CDAD”；例如腹泻、结肠炎、腹痛)症状或易患艰难梭菌相关疾病(例如经历抗生素治疗，或曾患艰难梭菌相关疾病，以及具有该疾病复发的危险)的患者。这种治疗可以治愈、康复、减轻、缓解、改变、矫正、改善、缓和、好转或影响感染和与感染有关的疾病、疾病的症状或患该病的可能性。
有效治疗CDAD的抗毒素抗体的量或“治疗有效量”是在单剂量或多剂量施用于受试者后有效抑制受试者的CDAD的抗体量。抗体或抗体片段的治疗有效量可能根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重以及该抗体或抗体部分在个体中引发所需应答的能力等因素而不同。治疗有效量也是抗体或抗体部分的治疗有益作用超过毒性或不利作用的量。抗体抑制可测量参数的能力可以在预测人体效能的动物模型系统中评价。例如，抗毒素抗体保护小鼠免遭艰难梭菌致死性攻击的能力可以预测在人体中的效能。此处描述了其他预测效能的动物模型，如实施例中所述的肠结扎模型。或者，抗体或抗体组合物的这种性质也可以通过技术人员公知的试验在体外检测该化合物的调节能力来评价。体外试验包括结合试验如ELISA和中和试验。
抗毒素抗体有效预防疾病的量或该抗体的“预防有效量”是在单剂量或多剂量施用于受试者后有效预防或延缓CDAD发病或复发或抑制其症状的量。但是，如果需要较长的保护时间间隔，可以施用增加的剂量。
例如表示两种状态之间定量差异的术语“激发”、“诱发”、“抑制”、“提高”、“增加”、“降低”等是指两种状态之间的差异，例如统计学或临床显著的差异。
如此处所用的，“特异性结合”是指抗体的如下能力(1)与艰难梭菌毒素以至少1×107M-1的亲和力结合，以及(2)与艰难梭菌毒素以至少两倍于对非特异性抗原的亲和力的亲和力结合。
“抗体”是包含至少一个或两个重(H)链可变区(在此缩写为VHC)和至少一个或两个轻(L)链可变区(在此缩写为VLC)的蛋白质。VHC和VLC区可以进一步再分为高变区，称为“互补决定区”(″CDR″)，高变区散布在被称为“构架区”(FR)的更加保守的区域中。构架区和CDR的范围已经精确定义(参见，Kabat，E.A.等，Sequences ofProteins of Immunological Interest，Fifth Edition，U.S.Department of Healthand Human Services，NIH Publication No.91-3242，1991，和Chothia，C.等，J.Mol.Biol.196901-917，1987，在此引用作为参考)。优选地，每个VHC和VLC由三个CDR和四个FR组成，它们从氨基端到羧基端以如下顺序排列FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。
抗体的VHC或VLC链还可包括全部或部分重链或轻链恒定区。在一个实施方案中，该抗体是两条免疫球蛋白重链和两条免疫球蛋白轻链的四聚体，其中免疫球蛋白重链和轻链例如通过二硫键链间连接。重链恒定区包括三个结构域，CH1、CH2和CH3。轻链恒定区由一个结构域CL组成。重链和轻链的可变区包含与抗体相互作用的结合结构域。抗体的恒定区一般介导该抗体与宿主组织或因子包括免疫系统的各种细胞(例如效应细胞)和经典补体系统第一成分(Clq)的结合。术语“抗体”包括IgA、IgG、IgE、IgD、IgM型(以及它们的亚型)的完整免疫球蛋白，其中免疫球蛋白的轻链可以是κ或λ型。
“免疫球蛋白”是指由基本由免疫球蛋白基因编码的一个或多个多肽组成的蛋白质。公认的人免疫球蛋白基因包括κ、λ、α(IgA1和IgA2)、γ(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、δ、ε和μ恒定区基因，以及众多的免疫球蛋白可变区基因。全长免疫球蛋白“轻链”(约25 KD和214个氨基酸)的NH2-末端(约110个氨基酸)由可变区基因编码，COOH-末端由κ或λ恒定区基因编码。全长免疫球蛋白“重链”(约50 KD和446个氨基酸)类似地由可变区基因(约116个氨基酸)和上述其他恒定区基因之一如γ(编码约330个氨基酸)编码。术语“免疫球蛋白”包括具有来自人或非人来源的CDR的免疫球蛋白。免疫球蛋白的构架可以是人、人源化或非人的，例如经修饰降低了在人体中的抗原性的鼠构架，或合成构架例如共有序列。
如此处所用的，术语“同种型”是指由重链恒定区基因编码的抗体类别(例如IgM或IgG1)。
如此处所用的，术语抗体的“抗原结合部分”(或简称为“抗体部分”或“部分”)是指与艰难梭菌毒素(例如毒素A)特异性结合的抗体的一部分，例如一条或多条免疫球蛋白链不是全长，但是与毒素特异性结合的分子。术语抗体的“抗原结合部分”中所包括的结合部分的例子包括(i)Fab片段，即由VLC、VHC、CL和CH1结构域组成的单价片段；(ii)F(ab’)2片段，即包含在铰链区通过二硫键连接的两条Fab片段的双价片段；(iii)由VHC和CH1结构域组成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VLC和VHC结构域组成的Fv片段；(v)由VHC结构域组成的dAb片段(Ward等(1989)Nature 341544-546，1989)；和(vi)具有足以特异性结合的构架的分离的互补决定区(CDR)，例如可变区的抗原结合部分。轻链可变区的抗原结合部分和重链可变区的抗原结合部分，例如Fv片段的两个结构域VLC和VHC，可以利用重组方法通过合成接头连接在一起，该接头使它们能够制成一条蛋白质链，其中VLC和VHC区配对形成单价分子(称为单链Fv(scFv)；参见，例如Bird等(1988)Science 242423-426；和Huston等(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA855879-5883)。这样的单链抗体也包括在术语抗体的“抗原结合部分”内。这些抗体部分用本领域技术人员公知的常规技术获得，并用如完整抗体相同的方法对这些部分进行实用性筛选。
术语“单特异性抗体”是指对特定靶标例如表位表现出单一结合特异性和亲和力的抗体。该术语包括“单克隆抗体”或“单克隆抗体组合物”，后者在此使用时是指具有单一分子组成的多种抗体或其部分的制剂。
如此处所用的，术语“重组”抗体是指通过重组方法制备、表达、产生或分离的抗体，例如用转染到宿主细胞内的重组表达载体表达的抗体，从重组组合抗体文库分离的抗体，从人免疫球蛋白基因转基因动物(例如小鼠)中分离的抗体，或通过包括将人免疫球蛋白基因序列剪切为其他DNA序列的任何其他方法制备、表达、产生或分离的抗体。这些重组抗体包括人源化、CDR移植的、嵌合、体外产生(例如噬菌体展示)的抗体，并且可以任选地包含来源于人种系免疫球蛋白序列的恒定区。
如此处所用的，术语“基本相同”(或“基本同源”)是指第一个氨基酸或核苷酸序列含有足够数目的与第二个氨基酸或核苷酸序列相同或相当(例如具有相似的侧链，例如保守氨基酸置换)的氨基酸残基或核苷酸，从而该第一个和第二个氨基酸或核苷酸序列具有相似的活性。对于抗体，第二个抗体与第一个抗体具有相同的特异性并且具有第一种抗体的至少50％的亲和力。
两个序列之间“同源性”的计算如下进行。为了最佳比较目的将这些序列进行比对(例如为了最佳比对可以在第一个和第二个氨基酸或核酸序列的一个或两个中引入空位，并且为了比较目的可以忽略非同源序列)。为了比较目的比对的参比序列的长度至少为参比序列长度的50％。然后比较相应氨基酸位点或核苷酸位点处的氨基酸残基或核苷酸。当第一个序列中的位点被与第二个序列中相应位点处相同的氨基酸残基或核苷酸占据时，这些分子在该位点处相同(此处所用的氨基酸或核酸“同一性”相当于氨基酸或核酸“同源性”)。考虑为了两个序列之间进行最佳比对所需要引入的空位的数目和每个空位的长度后，两个序列之间的百分同一性是是这两个序列共有的相同位点的数目的函数。
两个序列之间的序列比较和百分同一性的确定可以用数学算法实现。两个氨基酸序列之间的百分同一性用已经整合入GCG软件包的GAP程序中的Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48444-453，1970的算法进行确定，其中使用Blossum 62评分矩阵，空位罚分为12，空位延伸罚分为4，移码空位罚分为5。
如此处所用的，术语“在低严格性、中严格性、高严格性或极高严格性条件下杂交”描述了杂交和洗涤的条件。进行杂交反应的指南可见Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley&Sons，N.Y.6.3.1-6.3.6，1989，在此引用作为参考。该文献中描述了水性和非水方法，可以使用任何一种。此处所指的特定杂交条件如下1)低严格性杂交条件约45℃下6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后至少在50℃下用0.2X SSC，0.1％SDS洗涤两次(对于低严格性条件，洗涤温度可以提高至55℃)；2)中严格性杂交条件约45℃下6X SSC，然后在60℃下用0.2X SSC，0.1％SDS洗涤一次或两次；3)高严格性杂交条件约45℃下6X SSC，随后在65℃下用0.2X SSC，0.1％SDS洗涤一次或两次；4)极高严格性杂交条件在65℃下0.5 M磷酸钠，7％SDS，随后在65℃下用0.2X SSC，1％SDS洗涤一次或两次。
应当理解，此处所述的抗体及其抗原结合部分可以具有另外的保守或非必需氨基酸置换，其对多肽功能没有实质性影响。特定置换是否耐受，即是否不利地影响需要的生物学性质，如结合活性，可以如Bowie等，Science，2471306-1310，1990所述测定。“保守氨基酸置换”是指将氨基酸残基替换为一个具有相似侧链的氨基酸残基。具有相似侧链的氨基酸残基家族在本领域中已经定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷极性侧链(例如天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β-分支侧链(例如苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳族侧链(例如酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。
“非必需”氨基酸残基是可以由多肽如结合剂如抗体的野生型序列改变，而基本不改变生物活性的残基，而“必需”氨基酸残基则导致这样的改变。
除非另外定义，此处所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员通常理解的同样的含义。下面描述了合适的方法与材料，但是在本发明的实践或试验中也可以使用与此处所述相似或等同的方法与材料。此处提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都全文引用作为参考。如有冲突，以本说明书包括定义为准。另外，这些材料、方法和实施例都只是说明性的，不是限制性的。
概述艰难梭菌是革兰氏阳性的、产生毒素的细菌，它在人体中引起抗生素相关的腹泻和结肠炎。此处提供了用于治疗和预防艰难梭菌相关疾病(CDAD)的方法和组合物。该组合物包含识别艰难梭菌的蛋白质和其他分子成分(例如脂质、碳水化合物、核酸)的抗体，包括识别艰难梭菌产生的毒素(例如毒素A和毒素B)的抗体。特别是提供了人单克隆抗体。在某些实施方案中，在表达人免疫球蛋白基因区段的小鼠中产生这些人单克隆抗体(下文描述)。也提供了抗毒素抗体的组合。
新方法包括向受试者施用可与艰难梭菌毒素结合的抗体(及其抗原结合部分)，以抑制受试者的CDAD。例如，此处所述的人单克隆抗毒素A抗体能够中和毒素A并且抑制艰难梭菌介导的疾病的复发。在其他实施例中，可以施用抗毒素A抗体(例如抗毒素A单克隆抗体)与抗毒素B抗体的组合，以抑制主要的疾病和减少疾病复发的发生率。人单克隆抗体可以在体内定位于患病部位(例如肠)。
1.抗体的产生免疫原通常，用艰难梭菌表达的抗原免疫动物，以产生抗体。为了产生抗毒素抗体，用灭活的毒素或类毒素免疫动物。例如，通过甲醛、戊二醛、过氧化物或氧处理能够灭活毒素(参见，例如，Relyveld等，Methods inEnzymology，9324，1983；Woodrow和Levine编著，New GenerationVaccines，Marcel Dekker，Inc.，New York，1990)。毒性降低的突变艰难梭菌毒素可以用重组方法产生(参见，例如，美国专利5,085,862；5,221,618；5,244,657；5,332,583；5,358,868；和5,433,945)。例如，可以制备在毒素活性部位含有缺失或点突变的突变体。毒素的重组片段可以用作免疫原。另一种方法是通过用UDP-二醛处理灭活毒素(Genth等，Inf.and Immun.，68(3)1094-1101，2000)。该方法比其他处理更容易保留毒素的天然结构，从而能够诱发对天然毒素更具反应性的抗体。该方法也在下面的实施例1中描述。
结合和中和毒素A的抗毒素抗体能够与毒素A的特定表位相互作用。例如，抗毒素A抗体能够结合毒素A的N末端区(例如在毒素A的氨基酸1-1033之间)或C末端区(例如毒素A的氨基酸1853-2710之间)内的表位。在一个实施例中，结合和中和毒素A的抗体与毒素A的氨基酸1853-2710内的表位结合。
类似地，抗毒素B抗体能够识别毒素B的特定表位，例如N末端表位或C末端表位。在一个实施例中，结合和中和毒素B的抗体与毒素B的氨基酸1777-2366内的表位结合。
在HuMAb小鼠中产生人单克隆抗体可以用无法用于多克隆抗体的方法产生单克隆抗体。多克隆抗血清在动物与动物之间不同，而单克隆制剂表现出均一的抗原特异性。鼠系统可用于产生单克隆抗体，免疫方案、分离和融合脾细胞的技术和产生杂交瘤的方法和试剂众所周知。单克隆抗体可以用多种技术产生，包括常规单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein，Nature，256495，1975的标准体细胞杂交技术。一般参见Harlow，E.和Lane，D.AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold SpringHarbor，NY，1988。
虽然这些标准技术公知，但是希望使用人源化或人抗体而不是鼠抗体来治疗人类受试者，因为人体会对来自小鼠和其他种的抗体产生免疫应答。对鼠抗体的免疫应答被称为人抗鼠抗体或HAMA应答(Schroff R.等，Cancer Res.，45，879-885，1985)，是在人体中引起血清病并且导致鼠抗体从个体循环中快速清除的情况。已经显示人体中的免疫应答是针对鼠免疫球蛋白的可变区和恒定区的。对于人体施用，人单克隆抗体比来源于其他动物的抗体和人多克隆抗体更安全。
产生人单克隆抗体的一种有用的动物是表达人免疫球蛋白基因而不是其自身鼠免疫球蛋白基因的转基因小鼠。这种转基因小鼠，例如“HuMAbTM”小鼠，含有编码非重排的人重链(μ和γ)和κ轻链免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因小基因座(minilocus)，并且具有灭活内源μ和κ链基因座的定向突变(参见，例如，Lonberg，N.等，Nature 368(6474)856-859，1994，和美国专利5,770,429)。因此，该小鼠表现出小鼠IgM或κ表达降低，而响应免疫，引入的人重链和轻链转基因经历类别转换和体细胞突变，产生高亲和力人IgGκ单克隆抗体(Lonberg，N.等，同上文；综述见Lonberg，N.Handbook of Experimental Pharmacology11349-101，1994；Lonberg，N.和Huszar，D.，Intern.Rev.Immunol.，1365-93，1995，和Harding，F.和Lonberg，N.，Ann.N.Y.Acad.Sci.，764536-546，1995)。
该转基因小鼠的制备详细描述于下面的文献中Taylor，L.等，Nucleic Acids Research，206287-6295，1992；Chen，J.等，InternationalImmunology 5647-656，1993；Tuaillon等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA903720-3724，1993；Choi等，Nature Genetics，4117-123，1993；Chen，J.等，EMBO J.，12821-830，1993；Tuaillon等，J.Immunol.，1522912-2920，1994；Taylor，L.等，International Immunology，6579-591，1994；和Fishwild，D.等，Nature Biotechnology，14845-851，1996。进一步参见，美国专利5,545,806；美国专利5,569,825，美国专利5,625,126，美国专利5,633,425，美国专利5,661,016，美国专利5,770,429，美国专利5,789,650，美国专利5,814,318，美国专利5,874,299和美国专利5,877,397，均属于Lonberg和Kay，以及PCT公布号WO 01/14424，WO 98/24884，WO94/25585，WO 93/1227，和WO 92/03918。
为了产生针对抗原的完全人单克隆抗体，可以如Lonberg，N.等Nature，368(6474)856-859，1994；Fishwild，D.等，Nature Biotechnology，14845-851，1996和WO 98/24884所述用免疫原免疫HuMab小鼠。优选地，小鼠在第一次免疫时为6-16周龄。例如，可以用灭活毒素A的纯化制剂腹膜内免疫HuMab小鼠。为了产生针对艰难梭菌蛋白质、脂质和/或碳水化合物分子的抗体，可以用杀死的或不存活的艰难梭菌生物体免疫小鼠。
当最初使用弗氏完全佐剂中的抗原腹膜内(IP)免疫HuMab转基因小鼠，接着隔周用弗氏不完全佐剂中的抗原腹膜内免疫(最多共六次)时，该小鼠产生最佳应答。免疫应答可以在免疫方案进程中用眼眶后取血获得的血浆样品进行监测。例如可以通过ELISA或流式细胞术筛查血浆，具有足够效价的抗毒素人免疫球蛋白的小鼠可用于融合。在处死之前3天用抗原对小鼠静脉内加强免疫并且取出脾脏。预期每种抗原可能需要进行2-3次融合。每种抗原一般免疫数只小鼠。
分离小鼠脾细胞，按照标准程序用PEG将其与小鼠骨髓瘤细胞系融合。然后对得到的杂交瘤进行抗原特异性抗体产生的筛选。例如，使用50％PEG，将来自被免疫小鼠的脾淋巴细胞的单细胞悬液与六分之一数目的P3X63-Ag8.653非分泌小鼠骨髓瘤细胞(ATCC，CRL 1580)融合。细胞以大约2×105接种于平底微量滴定板中，接着在含有20％胎克隆血清，18％“653”条件培养基，5％Origen(IGEN)，4mM L-谷氨酰胺，1mM丙酮酸钠，5mM HEPES，0.055mM 2-巯基乙醇，50单位/毫升青霉素，50mg/ml链霉素，50mg/ml庆大霉素和1×HAT(Sigma；HAT在融合24小时后加入)的选择性培养基中温育两周。两周后，在用HT替换了HAT的培养基中培养细胞。然后通过ELISA对各孔的上清液进行人抗毒素细胞单克隆IgM和IgG抗体的筛选。将分泌抗体的杂交瘤再次平板接种，再次筛选，如果对于人IgG仍然是阳性，则通过限制性稀释将抗毒素单克隆抗体亚克隆至少两次。然后体外培养稳定的亚克隆，在组织培养基中产生少量抗体用于表征。
在一个实施方案中，用来产生抗毒素人抗体的转基因动物含有至少一个，一般2-10个，有时25-50个或更多拷贝的WO 98/24884实施例12所述的转基因(例如pHCl或pHC2)，与含有一个拷贝的WO 98/24884实施例5、6、8或14所述轻链转基因的动物繁殖，其后代与WO 98/24884实施例10所述的JH缺失的动物繁殖，所述专利的内容在此引用作为参考。对于这三种性状中的每一个，这些动物繁殖为纯合的。这些动物具有下列基因型单拷贝(每个染色体单倍体组)的未重排的人重链小基因座(WO 98/24884的实施例12描述)，单拷贝(每个染色体单倍体组)的未重排的人K轻链构建体(WO 98/24884的实施例14描述)，和除去所有功能性JH区段的每个内源小鼠重链基因座处的缺失(WO98/24884的实施例10描述)。这些动物与JH区段缺失纯合的小鼠(WO98/24884的实施例10描述)繁殖，产生JH区段缺失纯合且人重链和轻链构建体半合的后代。向得到的动物注射抗原，用于产生针对这些抗原的人单克隆抗体。
从该动物中分离的B细胞对于人重链和轻链是单特异性的，因为它们只含有一个拷贝的每种基因。此外，它们对于人或小鼠重链是单特异性的，因为由于如WO 98/24884实施例9和12所述引入的跨过JH区的缺失，两个内源小鼠重链基因拷贝都无功能性。而且，大部分B细胞对于人或小鼠轻链是单特异性的，因为一个拷贝的重排人κ轻链基因的表达将等位地和同型地排除大部分B细胞中内源小鼠κ和λ链基因的重排。
在一个实施方案中，转基因小鼠将表现出产生具有重要的谱系(repertoire)的免疫球蛋白，理想地基本类似于原始小鼠。因此，例如，在内源Ig基因已经灭活的实施方案中，总免疫球蛋白水平将为约0.1-10mg/ml血清，例如0.5-5mg/ml或至少约1.0mg/ml。当向转基因小鼠中引入能够实现从IgM到IgG的转换的转基因时，成年小鼠血清IgG与IgM的比例优选地为约10∶1。在未成熟的小鼠中IgG与IgM的比例将更低。通常，高于约10％，例如约40-80％的脾和淋巴结B细胞将只表达人IgG蛋白质。
转基因小鼠中的谱系理想地接近非转基因小鼠中所显示的，通常高达至少约10％，优选25-50％或更高。通常产生至少约一千种不同的免疫球蛋白(理想地为IgG)，优选104-106或更多种，这主要取决于引入小鼠基因组中的不同V、J、D区的数目。一般地，免疫球蛋白对预先选择的抗原表现出至少约107M-1、109M-1、1010M-1、1011M-1、1012M-1或更高、例如可达1013M-1或更高的亲和力。
HuMAb小鼠能够产生通过转基因内转换重组而经历类别转换(顺式转换)并且表达对该毒素具有反应性的免疫球蛋白的B细胞。该免疫球蛋白可以是人序列抗体，其中重链和轻链多肽由人转基因序列编码，该序列可包括通过体细胞突变和V区重组连接衍生的序列，以及种系编码序列。这些人序列免疫球蛋白可以被称为与人VL或VH基因区段和人JL或JL区段编码的多肽序列基本相同，尽管由于体细胞突变和不同的V-J和V-D-J重组连接而可能存在其他非种系序列。对于这些人序列抗体，每条链的可变区一般至少80％由人种系V、J基因区段编码，对于重链，由D基因区段编码。通常，至少85％的可变区由存在于转基因上的人种系序列编码。通常90-95％或更多的可变区序列由存在于该转基因上的人种系序列编码。但是，由于通过体细胞突变和VJ和VDJ连接引入了非种系序列，人序列抗体通常具有一些不由人V、D或J基因区段编码的可变区序列(较不常见地，恒定区序列)，如在小鼠种系中的人转基因中所见。一般地，这些非种系序列(或各个核苷酸位点)将聚集于CDR中或CDR附近，或已知体细胞突变聚集的区域中。
与毒素结合的人序列抗体可以由同种型转换产生，从而产生含有人序列γ链(如γ1、γ2或γ3)和人序列轻链(如κ)的人抗体。这些同种型转换的人序列抗体通常含有一个或多个体细胞突变，一般位于可变区中，通常在CDR的约10个残基之中或之内，这是抗原攻击，特别是接着进行第二(或后续)抗原攻击引起的B细胞亲和成熟和选择的结果。这些高亲和力人序列抗体具有至少约1×109M-1、一般至少5×109M-1、通常高于1×1010M-1、有时为5×1010M-1至1×1011M-1或更高的结合亲和力抗毒素抗体也能够在包括非转基因小鼠、人、兔和山羊的其他哺乳动物中产生。
抗毒素A抗体与毒素A特异性结合的人单克隆抗体包括此处所述的3D8、1B11和3H2克隆产生的抗体。具有与3D8、1B11和3H2的可变重链和轻链区至少80％或以上相同的可变重链和可变轻链区的抗体也可以与毒素A结合。在有关实施方案中，抗毒素A抗体包含，例如，3D8、1B11或3H2的可变重链和/或可变轻链的互补决定区(CDR)。来自这些克隆的可变重链区的CDR在下面的表1中显示。
表1.可变重链CDR氨基酸序列
来自这些克隆的可变轻链区的CDR在下面的表2中显示。
表2.可变轻链CDR氨基酸序列
CDR是免疫球蛋白的部分，其决定对特定抗原的特异性。在某些实施方案中，具有序列变化(例如保守置换)的对应于表1和表2中CDR的CDR可以与毒素A结合。例如，与毒素A结合的抗体(或其抗原结合部分)中存在CDR中的1、2、3、4或5个残基或少于总残基的20％被置换或缺失的CDR。
类似地，抗毒素抗体可以具有含有共有序列的CDR，因为在多种抗体之间保守的基序可能对于结合活性至关重要。例如，抗体或其抗原结合部分的可变轻链区的CDR1可包含氨基酸序列R-A-S-Q-X-X-S-S-X-L-A(SEQ ID NO25)，抗体或其抗原结合部分的可变轻链区的CDR2可包含氨基酸序列A-S-X-X-X-S/T(SEQ ID NO26)，和/或抗体或其抗原结合部分的可变轻链区的CDR3可包含氨基酸序列Q-Q-X-X-S/N-X-P/S(SEQ ID NO27)，其中X是任意氨基酸。
在一些实施方案中，抗体或其抗原结合部分的可变重链区的CDR1包含氨基酸序列Y-G-M-H(SEQ ID NO28)，和/或抗体或其抗原结合部分的可变重链区的CDR2包含氨基酸序列I-W-X-X-G-X-X-X-Y-X-X-S-X-X-G(SEQ ID NO29)，其中X是任意氨基酸。
人抗毒素抗体可包含产生自或来源于特定人免疫球蛋白基因的可变区。例如，该抗体可包含产生自或来源于人VH3-33基因的可变重链区。来源于该基因的抗体的大量序列可在GenBank中获得(参见，例如，登记号AJ555951，GI No29836865；登记号AJ556080，GI No.29837087；登记号AJ556038，GI No.29837012，和GenBank提供的其他人VH3-33重排基因区段)。该抗体也可以或者另外包含产生自或来源于人VκL19基因的轻链可变区(参见，例如，GenBank登记号AJ556049，GINo29837033，关于重排人基因VκL19基因区段的部分序列)。如本领域所知和上文该章节所述，通过体内重组方法衍生重组抗体的可变免疫球蛋白区，在该方法中向编码该区域的基因组区段中引入变异性。因此，来源于人VH-33或VκL19基因的可变区可包含与非淋巴样组织中所见基因不同的核苷酸。这些核苷酸的差异一般集中在CDR中。
抗毒素B抗体与毒素B特异性结合的人单克隆抗体包括此处所述的124-152、2A11和1G10克隆产生的抗体。具有与-152、2A11和1G10的可变重链和轻链区至少80％或以上相同的可变重链和可变轻链区的抗体也能够与毒素B结合。在有关实施方案中，抗毒素B抗体包含，例如，-152、2A11或1G10的可变重链和/或可变轻链的互补决定区(CDR)。来自这些克隆的可变重链区的CDR显示在下面的表3中。
表3.可变重链CDR氨基酸序列
来自这些克隆的可变轻链区的CDR在下面的表4中显示。
表4.可变轻链CDR氨基酸序列
CDR是免疫球蛋白的部分，其决定对特定抗原的特异性。在某些实施方案中，具有序列变化(例如保守置换)的对应于表3和表4中CDR的CDR可以与毒素B结合。例如，与毒素B结合的抗体(或其抗原结合部分)中存在CDR中的1、2、3、4或5个残基或少于总残基的被置换或缺失的CDR。
人抗毒素B抗体可包含产生自或来源于特定人免疫球蛋白基因的可变区(参见图28-31)。例如，该抗体可包含产生自或来源于人VH5-51基因的可变重链区。该抗体也可以或者另外包含产生自或来源于人VκA27基因和/或JK1基因的轻链可变区。如本领域所知和上文该章节所述，通过体内重组方法衍生重组抗体的可变免疫球蛋白区，在该方法中向编码该区域的基因组区段中引入变异性。因此，来源于人VH-5-51或VκA27/JK1基因的可变区可包含与非淋巴样组织中所见基因不同的核苷酸。这些核苷酸的差异一般集中在CDR中。
2.抗体的产生和修饰抗毒素抗体的许多不同形式可用于抑制CDAD。这些抗体可以是不同的同种型，包括IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)、IgM、IgA1、IgA2、IgD或IgE。优选地，该抗体是IgG同种型，例如IgG1。该抗体分子可以是全长的(例如IgG1或IgG4抗体)，或者可以只包含抗原结合片段(例如Fab、F(ab′)2、Fv或单链Fv片段)。其中包括单克隆抗体(例如人单克隆抗体)、重组抗体、嵌合抗体和人源化抗体，以及这些抗体的抗原结合部分。
在本发明中有用的抗毒素抗体或其部分也可以是用编码所需抗体的免疫球蛋白轻链和重链的DNA转化的宿主细胞产生的重组抗体。重组抗体可以用公知的基因工程技术产生。例如，重组抗体可以如下产生通过克隆编码所需抗体的免疫球蛋白轻链和重链的核苷酸序列，例如cDNA或基因组DNA。然后将编码这些多肽的核苷酸序列插入表达载体中，使这两个基因与它们自已的转录和翻译表达控制序列有效连接。选择表达载体和表达控制序列与使用的表达宿主细胞相匹配。一般地将两个基因插入同一表达载体中。可以使用原核或真核宿主细胞。
优选在真核宿主细胞中表达，因为这些细胞比原核细胞更可能装配并分泌正确折叠的且具有免疫活性的抗体。但是，产生的由于不正确折叠而失活的任何抗体都可以通过公知的方法复性(Kim和Baldwin，Ann.Rev.Biochem.，51459-89，1982)。宿主细胞可能产生完整抗体的部分，如轻链二聚体或重链二聚体，也可以是根据本发明的抗体同系物。
例如应用本领域公知的重组DNA技术与基因转染方法的组合，也可以在宿主细胞转染瘤中产生此处所述的抗体(Morrison，S.，Science，2291202，1985)。例如，在一个实施方案中，可以将目标基因，例如人抗体基因，连接到表达载体如真核表达质粒中，如WO 87/04462、WO89/01036和EP 338 841公开的GS基因表达系统中所用的真核表达质粒，以及本领域公知的其他表达系统。可以将含有克隆的抗体基因的纯化质粒引入真核宿主细胞如CHO细胞或NSO细胞中，或者其他真核细胞如植物来源的细胞、真菌或酵母细胞中。用于引入这些基因的方法可以是本领域所述的任何方法，如电穿孔法、脂转染法、脂转染胺法或轰击转染法，在轰击转染法中用携带目标DNA的微粒轰击细胞(Rodin等，Immunol.Lett.，74(3)197-200，2000)。将这些抗体基因导入宿主细胞中后，可以鉴定和选择表达该抗体的细胞。这些细胞代表转染瘤，然后可以扩增其表达水平，并且放大，以产生抗体。可以利用标准技术从这些培养上清液和/或细胞中分离和纯化重组抗体。
应当理解，在本发明中可以使用上述方法的变化形式。例如，可能需要用编码抗体的轻链或重链(但不是同时编码轻链和重链)的DNA转化宿主细胞。也可以利用重组DNA技术除去编码并非结合所必需的轻链和/或重链的一些或所有DNA，例如，可以通过删除特定氨基酸来修饰恒定区。在此处所述的方法中可以使用由这些截短的DNA分子表达的分子。另外，也可以产生双功能抗体，其中一条重链和一条轻链能够与毒素结合，另一条重链和轻链对于该毒素以外的一种抗原或该毒素的另外一个表位是特异性的。
通过本领域公知的重组DNA技术可以产生嵌合抗体。例如，用限制性内切酶消化编码鼠(或其他种)单克隆抗体分子的Fc恒定区的基因，以除去编码鼠Fc的区域，并将其置换为编码人Fc恒定区的基因的等同部分(参见Robinson等，国际专利申请PCT/US86/02269；Akira等，欧洲专利申请184,187；Taniguchi，M.，欧洲专利申请171,496；Morrison等，欧洲专利申请173,494；Neuberger等，国际申请WO 86/01533；Cabilly等，美国专利4,816,567；Cabilly等，欧洲专利申请125,023；Better等(1988Science，2401041-1043)；Liu等(1987)PNAS，843439-3443；Liu等，1987，J.Immunol.，1393521-3526；Sun等(1987)PNAS 84214-218；Nishimura等，1987，Canc.Res.，47999-1005；Wood等(1985)Nature，314446-449；和Shaw等，1988，J.Natl.Cancer Inst.，801553-1559)。嵌合抗体也可以通过重组DNA技术产生，其中可将编码鼠V区的DNA与编码人恒定区的DNA连接。
可以利用本领域公知的方法将抗体或免疫球蛋白链人源化。例如，一旦获得鼠抗体，即可对可变区进行测序。可以确定CDR和构架区的定位(参见，Kabat，E.A.，等(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，Fifth Edition，U.S.Deoartment of Health and Human Services，NIHPublication No.91-3242，和Chothia，C.等(1987)J.Mol.Biol.，196901-917)。轻链和重链可变区可以任选地与相应的恒定区连接。实际上应当理解，此处所述的任何抗体，包括完全人抗体，可以改变(例如通过突变、置换)为含有取代的恒定区，例如Fc区或其部分，以达到例如需要的抗体结构、功能(例如效应功能)、亚型、同种异型、亚类等。可以用公认的技术对抗毒素抗体测序。移植CDR的抗体分子或免疫球蛋白可以通过CDR移植或CDR置换产生，其中免疫球蛋白链的一个、两个或所有CDR可以被置换。参见，例如，美国专利5,225,539；Jones等，1986，Nature，321552-525；Verhoeyan等，1988，Science，2391534；Beidler等，1988，J.Immunol.，1414053-4060；和Winter，美国专利5,225,539。
Winter描述了CDR移植法，该方法可以用于制备本发明的抗体(英国专利申请GB 2188638A，1987年3月26日提交；Winter，美国专利5,225,539，其内容在此引用作为参考)。例如，可以将特定抗体的所有CDR替换为人CDR的至少一部分(例如来自克隆3D8的CDR，如以上表1和表2所示，和/或来自克隆124-152的CDR，如表3和表4所示)，或者可以只替换某些CDR。只需要置换抗体与预定抗原(例如艰难梭菌的外毒素)结合所需数目的CDR。
可以通过将不直接参与抗原结合的Fv可变区的序列替换为来源于人Fv可变区的等同序列来产生人源化抗体。Morrison，S.L.，1985，Science，2291202-1207，Oi等，1986，BioTechniques，4214，和Queen等，美国专利5,585,089，美国专利5,693,761和美国专利5,693,762提供了产生人源化抗体的常用方法。这些方法包括分离、操作和表达编码来自至少一条重链或轻链的所有或部分免疫球蛋白Fv可变区的核酸序列。这些核酸的来源为本领域技术人员所周知，例如，可以如上所述从产生针对预定靶标的抗体的杂交瘤中获得。然后可以将编码人源化抗体或其片段的重组DNA克隆到合适的表达载体中。其他抗体人源化技术在1992年12月23日公开的Padlan等的EP 519596 A1中有描述。
本发明范围内也包括特定氨基酸已经被置换、缺失或添加的抗体。具体地，优选的抗体在构架区内含有氨基酸置换，例如改善与抗原的结合。例如，可以将选择的免疫球蛋白链的接受体的少量构架残基置换为相应的供体氨基酸。优选的置换位置包括与CDR相邻的或能够与CDR相互作用的氨基酸残基(参见，例如，美国专利5,585,089)。从供体中选择氨基酸的标准在美国专利5,585,089(例如第12-16栏)中描述，该专利的内容在此引用作为参考。接受体构架可以是成熟的人抗体构架序列或共有序列。
“共有序列”是由相关序列家族中最常出现的氨基酸(或核苷酸)组成的序列(参见，例如Winnaker，From Genes to Clones(Verlagsgesellschaft，Weinheim，Germany 1987)。在蛋白质家族中，共有序列中的每个位置都被该家族中该位置处最常出现的氨基酸所占据。如果两个氨基酸出现的频率相等，则共有序列中可以包括其中的任一个。免疫球蛋白的“共有构架”是指共有免疫球蛋白序列中的构架区。
抗毒素抗体或其抗原结合部分可以衍生化或者连接到另外一种功能分子(例如，另外一种肽或蛋白质)。例如，抗体可以与另外一种或多种分子实体如另外一种抗体、可检测试剂、细胞毒性剂、药剂和/或能够介导与另外一种分子连接的蛋白质或肽(如链霉抗生物素核心区或多组氨酸标记)功能连接(通过化学偶联、基因融合、非共价连接或其他方式)。
一种类型的衍生化蛋白质是通过将两种或多种(相同类型或不同类型的)蛋白质交联在一起产生的。合适的交联剂包括具有被适当间隔区隔开的两个不同反应基的异双功能交联剂(例如m-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-马来酰亚胺)或同双功能交联剂(例如辛二酸二琥珀酰亚胺酯)。这些交联剂可从Pierce Chemical Company，Rockford，IL获得。
可以衍生化(或标记)蛋白质的有用的可检测试剂包括荧光化合物、各种酶、辅基、发光材料、生物发光材料和放射性物质。荧光可检测试剂的例子包括荧光素、异硫氰酸荧光素、罗丹明和藻红蛋白。蛋白质或抗体也可以用可检测的酶衍生化，如碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、乙酰胆碱酯酶、葡萄糖氧化酶等。当蛋白质用可检测的酶衍生化时，通过加入该酶用来产生可检测反应产物的其他试剂来检测该蛋白质。例如，当存在可检测试剂辣根过氧化物酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯产生可以检测的有色反应产物。蛋白质也可以用辅基(例如链霉抗生物素蛋白/生物素和抗生物素蛋白/生物素)衍生化。例如，抗体可以用生物素衍生化，并且通过间接测量抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白的结合进行检测。
例如，在许多情况下可以在诊断和/或实验中使用标记的蛋白质和抗体，包括(i)通过标记技术如亲和层析或免疫沉淀法分离预定的抗原；和(ii)检测预定的抗原(例如毒素，例如细胞裂解物或患者标本中的毒素)，以监测组织中的蛋白质水平，作为临床检验程序的一部分，例如测定给定治疗方案的效果。
抗毒素抗体或其抗原结合片段可以与另外一种分子实体如标记物偶联。
3.筛选方法可以用多种公知技术表征抗毒素抗体与毒素的结合。抗体一般首先用ELISA进行表征。简言之，微量滴定板用PBS中的毒素或类毒素抗原包被，然后用PBS稀释的无关蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)封闭。将来自用毒素免疫的小鼠的血浆稀释液加入各孔中，在37℃下温育1-2小时。用PBS/Tween 20洗板，然后与偶联到碱性磷酸酶上的山羊抗人IgG Fc特异性多克隆试剂在37℃下温育1小时。洗涤后，平板用ABTS底物显色，在OD 405下分析。优选地，用表现最高效价的小鼠进行融合。
如上所述的ELISA试验可以用来筛选抗体，从而选择产生对毒素显示阳性反应性的抗体的杂交瘤。然后亚克隆并进一步表征产生优选以高亲力与毒素结合的抗体的杂交瘤。然后每个杂交瘤选择一个保留亲本细胞反应性的克隆(根据ELISA)制备细胞库，并用于抗体纯化。
为了纯化抗毒素抗体，选择的杂交瘤可以在滚瓶、两升旋转摇瓶或其他培养系统中生长。过滤上清液，浓缩，之后用蛋白A-sepharose(Pharmacia，Piscataway，N.J.)进行亲和层析，以纯化蛋白质。将缓冲液更换为PBS后，可以通过分光光度法测定浓度。
为了确定选择的单克隆抗体是否与独特的表位结合，可以用常用试剂(Pierce，Rockford，Ill.)将每种抗体生物素化。生物素化的MAb的结合可以用链霉抗生物素标记的探针检测。可以利用Western印迹法进一步检测抗毒素抗体对毒素的反应性。
测定抗毒素抗体活性的其他试验包括中和试验。体外中和试验可以测定抗体抑制对培养细胞的细胞致病作用的能力(见下文实施例3)。测定毒素中和的体内试验在下文的实施例5、6、7中描述。
4.药物组合物和试剂盒在另一方面，本发明提供组合物，例如药物可接受的组合物，其包含与药物可接受的载体配制在一起的此处所述的抗体分子或其抗原结合部分。
“药物可接受的载体”包括生理学相容的任何及所有溶剂、分散介质、等渗剂和吸收延迟剂等。这些载体适合于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、直肠、脊柱或表皮施用(如通过注射或输注)。
本发明的组合物可以是多种形式。其中包括，例如，液体、半固体和固体剂型，如液体溶液(例如注射和输注溶液)、分散液或悬浮液、脂质体和栓剂。优选的形式取决于预期的施用方式和治疗用途。有用的组合物是可注射或可输注溶液的形式。一种有用的施用方式是肠胃外(例如静脉内、皮下、腹膜内、肌肉内)施用。例如，抗体或其抗原结合部分可以通过静脉内输注或注射施用。在另一个实施方案中，抗体或其抗原结合部分通过肌肉内或皮下注射施用。
如此处所用的短语“肠胃外施用”意思是除肠内施用和局部施用以外的施用方式，通常是通过注射，包括但不限于静脉内、肌肉内、动脉内、鞘膜内、囊内、眼眶内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、角质层下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜外和胸骨内注射和输注。
治疗组合物在生产和贮存条件下一般应当是无菌的和稳定的。该组合物可以配制为溶液、微乳剂、分散液、脂质体或其他适合高抗体浓度的有序结构。通过将活性化合物(即抗体或抗体部分)以需要的量掺入合适的溶剂中，并且根据需要加入以上列举的成分中的一种或其组合，接着过滤除菌，可制备无菌注射液。通常，通过将活性化合物掺入到含有基本分散介质和来自上面所列举的其他所需成分的灭菌载体中制备分散液。在用于制备无菌注射液的灭菌粉末剂的情况下，可用的制备方法是真空干燥和冷冻干燥，该方法由其先前无菌过滤的溶液得到活性成分加任何其他所需成分的粉末。例如通过应用包衣如卵磷脂，在分散液的情况下通过维持所需的颗粒大小，和通过应用表面活性剂，可维持溶液的适当的流动性。通过在组合物中包含延迟吸收剂，例如单硬脂酸盐和明胶，可以实现注射型组合物的延长的吸收。
此处所述的抗体或抗体部分可以通过本领域公知的多种方法施用，并且用于多种治疗用途。本领域技术人员应当知道，施用途径和/或方式根据需要的结果而不同。
在某些实施方案中，抗体或其抗体部分可以例如与惰性稀释剂或可同化食用载体一起经口施用。该化合物(和其他成分，如果需要的话)也可以包封在硬壳或软壳的明胶胶囊中、压制成片剂或直接加入受试者的饮食中。对于经口治疗性施用，化合物可以与赋形剂一起加入并且以可摄入的片剂、含化片、糖锭剂、胶囊、酏剂、悬浮剂、糖浆、糯米纸囊剂等的形式使用。为了通过肠胃外施用以外的方式施用本发明的化合物，可能有必要将该化合物包裹上阻止其失活的材料或者与该材料共同施用。治疗性组合物可以用本领域公知的医疗装置施用。
调节剂量方案，以提供最佳的所需反应(例如，治疗反应)。例如，可以施用单一大丸剂，可以随时间推移施用几次分开的剂量，或者可以根据治疗状况的紧急情况所指示的，按比例减小或增加剂量。特别有利的是将肠胃外组合物配制成容易施用并且配药均匀的剂量单位形式。此处使用的剂量单位形式是指适合作为接受治疗的受试者的单位剂量的物理不连续单位；每一个单位含有预定量的活性化合物，该活性化合物的量经计算与所需的药物载体组合产生所需的治疗效果。对本发明剂量单位形式的具体说明限定于且直接依赖于(a)活性化合物的独特特性和要达到的特定疗效，和(b)配制这样的用于治疗个体敏感性的活性化合物的技术中固有的限制。
对于本发明的抗体或抗体部分的治疗或预防有效量范围，一个非限制性的例子是0.1-60mg/kg，例如0.5-25mg/kg，1-2mg/kg或0.75-10mg/kg。还应当理解，对于任何特定受试者，应当根据个体需要和施用或监督组合物施用者的专业判断随时间推移调节具体剂量方案，此处所述的剂量范围只是说明性的，并非限制要求保护的组合物的范围或实施。
本发明范围内也包括含有抗毒素抗体或其抗原结合部分的试剂盒。该试剂盒可包含一个或多个其他要素，包括使用说明；其他试剂，例如标记物、治疗剂或用于将抗体与标记物或治疗剂螯合或偶联的试剂，或用于制备所施用抗体的其他材料；药物可接受的载体；和用于向受试者施用的装置或其他材料。
抗体的各种组合可以包装在一起。例如，一个试剂盒可以包括结合毒素A的抗体(例如包含3D8的可变重链和轻链区的抗体)和结合毒素B的抗体(例如人单克隆抗毒素B抗体，例如124-152、2A11和/或1G10，或对毒素B具有反应性的多克隆抗血清)。这些抗体可以混合在一起或者分别包装于试剂盒内。
使用说明可以包括治疗性应用的说明，包括建议剂量和/或给药方式，例如对于具有CDAD症状的患者。其他说明可包括将抗体与螯合剂、标记物或治疗剂偶联的说明，或者例如从未反应的偶联成分中纯化偶联抗体的说明。
该试剂盒可包括可检测标记物、治疗剂和/或用于将标记物或治疗剂与抗体螯合或偶联的试剂。偶联剂包括诸如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的试剂。在这些情况中，该试剂盒可包括一个或多个用于进行反应的反应容器或分离装置，例如层析柱，用于将终产物与起始材料或反应中间物分离开来。
该试剂盒还可包括至少另外一种试剂，如诊断或治疗剂，例如此处所述的诊断或治疗剂，和/或另外一种或多种抗毒素或抗艰难梭菌抗体(或其部分)，适当时它们配制在一个或多个分别的药物制剂中。
其他试剂盒可以包括优化的编码抗毒素抗体的核酸，和用于表达该核酸的说明。
5.治疗方法和组合物新的蛋白质和抗体具有体外和体内治疗、预防和诊断用途。例如，这些抗体可以例如在体外或离体地对培养的细胞施用，或者例如在体内对受试者施用，用以治疗、抑制、预防复发和/或诊断艰难梭菌和艰难梭菌相关疾病。
如此处使用的，术语“受试者”包括人和非人动物。术语“非人动物”包括所有脊椎动物，例如哺乳动物和非哺乳动物，例如非人灵长类动物、鸡、小鼠、狗、猫、猪、牛和马。
蛋白质和抗体可以例如在体外或离体地用于培养的细胞。例如，可以在培养基中体外培养细胞，并且通过向该培养基中加入抗毒素抗体或其片段进行接触步骤。可以对受试者中存在的病毒体或细胞进行这些方法，作为体内(例如治疗或预防)方案的一部分。对于体内实施方案，接触步骤在受试者中进行，包括在有效地使抗体或部分与受试者中例如肠中细胞表达的任何毒素结合的条件下，向该受试者施用抗毒素抗体或其部分。
此处描述了施用抗体分子的方法。使用的适当的分子剂量取决于受试者的年龄和体重和使用的具体药物。抗体分子可以用作配体结合的竞争剂，以抑制或减少不需要的相互作用，例如抑制毒素与胃肠上皮的结合。
抗毒素抗体(或其抗原结合部分)可以与其他抗艰难梭菌抗体(例如其他单克隆抗体、多克隆γ-球蛋白)联合施用。能够使用的抗体组合包括抗毒素A抗体或其抗原结合部分和抗毒素B抗体或其抗原结合部分。抗毒素A抗体可以是3D8，这是一种包括3D8的可变区的抗体，或具有与3D8的可变区至少90％相同的可变区的抗体。抗毒素B抗体可以是124-152、2A11、1G10或具有与前述抗体如124-152的可变区至少90％相同的可变区的抗体。抗毒素A(即3D8)与抗毒素B抗体(例如124-152)的组合可以提供对CDAD的有力抑制。
应当理解，本发明的任何药剂，例如抗毒素A或抗毒素B抗体或其片段，可以例如以不同的比例或含量联合，用于改善疗效。实际上，本发明的药剂可以配制为混合物，或者利用本领域公知的技术进行化学或遗传连接，从而产生既具有抗毒素A结合性质又具有抗毒素B结合性质的共价连接的抗体(或共价连接的抗体片段)。通过测定单独的或与另一种药物联合的药剂的一个或多个参数，如亲和力、亲合力或生物学效能，可以指导组合制剂。在靶向、清除和/或隔离艰难梭菌或其抗原中，本发明的药剂也可以与提高治疗剂接近、半衰期或稳定性的其他药剂联合施用。
在治疗活性，例如抑制、预防(例如预防复发)和/或治疗艰难梭菌相关疾病上，这些联合治疗优选是加合的，甚至是协同性的(参见，例如，实施例16，其显示单一和联合抗体治疗的效果)。给予这样的联合治疗能够减少达到所需效果需要的治疗剂(例如抗体或抗体片段混合物，或交联的或遗传融合的双特异性抗体或抗体片段)的剂量。
含有免疫原有效量的毒素或其片段的免疫原组合物在此描述，并且能够用于产生抗毒素抗体。毒素序列中的免疫原性表位可以按照本领域公知的方法鉴定，含有这些表位的蛋白质或片段可以用多种手段加入到疫苗组合物中。合适的组合物包括，例如，脂肽(例如，Vitiello等，J.Clin.Invest.95341(1995))、包封于聚(DL-丙交酯-共聚-乙交酯)(“PLG”)微球体中的肽组合物(参见，例如，Eldridge等，Molec.Immunol.28287-94(1991)；Alonso等，Vaccine 12299-306(1994)；Jones等，Vaccine 13675-81(1995))、包含于免疫刺激复合物(ISCOMS)中的肽组合物(参见，例如，Takahashi等，Nature 344873-75(1990)；Hu等，Clin.Exp.Immunol.113235-43(1998))，和多抗原肽系统(MAPs)(参见，例如，Tam，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.855409-13(1988)；Tam，J.Immunol.Methods19617-32(1996))。
可以与本发明的免疫原组合物一起使用的有用的载体众所周知，包括，例如，甲状腺球蛋白、白蛋白如人血清白蛋白、破伤风类毒素、聚氨基酸如聚L-赖氨酸、聚L-谷氨酸、流感、乙型肝炎病毒核心蛋白等。这些组合物可含有生理学耐受的(即可接受的)稀释剂，如水或盐水，一般是磷酸缓冲盐溶液。这些组合物和疫苗一般还含有佐剂。如不完全弗氏佐剂、磷酸铝、氢氧化铝或明矾等佐剂是本领域公知的材料的例子。另外，将毒素(或其片段、失活衍生物或类似物)与脂质如三棕榈酰-S-甘油半胱氨酰-丝氨酰-丝氨酸(P3CSS)偶联，可以引发CTL反应。
抗毒素抗体可以与其他药剂如治疗CDAD的组合物联合施用。例如，可以与抗毒素抗体联合施用的治疗剂包括用来治疗CDAD的抗生素，如万古霉素、甲硝唑或杆菌肽。这些抗体可以与益生剂如Saccharomyces boulardii联合施用。这些抗体也可以与艰难梭菌疫苗例如类毒素疫苗联合施用。
6.其他方法通过标准技术，例如亲和层析或免疫沉淀法，可以利用抗毒素抗体(例如单克隆抗体)分离毒素。而且，抗毒素抗体也可以用来检测(例如粪便标本中的)毒素，例如，用来筛查标本中艰难梭菌的存在。可以在诊断上应用抗毒素抗体监测组织中毒素的水平，作为临床检验程序的一部分，例如，测定特定治疗方案的效果。
具体实施例方式
在所有实施例中，除非另外说明，使用如下的材料与方法。
材料与方法通常，除非另外说明，本发明的实施使用常规化学、分子生物学、重组DNA技术、免疫学(特别是例如抗体技术)和标准多肽制备技术。参见，例如，Sambrook，Fritsch和Maniatis，Molecular CloningCold SpringHarbor Laboratory Press(1989)；Antibody Engineering Protocols(Methodsin Molecular Biology)，510，Paul，S.，Humana Pr(1996)；AntibodyEngineeringA Practical Approach(Practical Approach Series，169)，McCafferty，编著，Irl Pr(1996)；AntibodiesA Laboratory Manual，HarloW等，C.S.H.L.Press，Pub.(1999)；和Current Protocols in Molecular Biology，编著.Ausubel等，John Wiley&Sons(1992)。
实施例本发明在下面的实施例中进一步描述，这些实施例不是限制权利要求书中所述的本发明的范围。
实施例1.抗毒素A单克隆抗体的产生艰难梭菌毒素A或者从Techlab，Inc.(Blacksburg，Va)获得或者通过重组产生。该毒素在免疫前进行纯化和灭活。灭活通过用反应性UDP-二醛处理进行，导致催化残基烷基化而保留天然毒素结构。关于详细方案，参见Genth等，Infand Immun.68(3)1094-1101，2000。简言之，纯化的毒素A与UDP-2’，3’-二醛(0.1-1.0mM)在缓冲液中37℃温育18小时，通过100 kDa-截断值的滤纸过滤以除去未反应的UDP-2’，3’-二醛，并用缓冲液洗涤。灭活的毒素A(类毒素A)用于免疫。
如以上标题为“在HuMAb小鼠中产生人单克隆抗体”的章节所述产生的以及由Medarex，Milpitas，CA提供的HCo7转基因小鼠每次用RIBI佐剂中的10μg类毒素腹膜内免疫，共6-12次。在HCo7转基因小鼠中，已经如Chen等(1993)EMBO J.12811-820所述将内源小鼠κ轻链基因纯合地破坏，并且已经如PCT公布WO 01/09187的实施例1所述将内源小鼠重链基因纯合地破坏。HCo7转基因小鼠携带如Fishwild等(1996)Nature Biotechnology 14845-85 1所述的人κ轻链转基因KCo5，和如美国专利号5,545,806；5,625,825；和5,545,807所述的HCo7人重链转基因。从每只小鼠采集血清，通过ELISA检测与毒素A的反应性，以及对IMR-90细胞的细胞毒性的中和。检测为毒素A反应性和中和抗血清阳性的小鼠通过尾静脉注射5-10μg类毒素A。在尾静脉注射大约3天后杀死小鼠，分离脾脏，用于与杂交瘤融合。
产生克隆杂交瘤，并通过ELISA筛选。通过筛选4个分别的杂交瘤融合产生的克隆而鉴定的κ/γ轻链阳性、抗原特异性和中和克隆的百分数在表5中列出。
表5

选择三个杂交瘤克隆进一步分析3D8、1B11和33.3H2。通过RT-PCR从mRNA扩增每个克隆的cDNA，克隆，并测序。每个克隆发现一个重链V区共有序列。所有三个克隆都使用来源于同一种系V区基因的VH区(VH 3-33)，但是使用不同的J序列。每个克隆的VH和VL区的氨基酸序列在图1中显示(SEQ ID NOs1-6)。在该图中互补决定区(CDRs)在上方划线。
κV(Vκ轻链)基因的序列分析显示，HuMAb 1B11和33.3H2各自表达一个共有κ链V序列。1B11杂交瘤表达来源于VκL6种系基因的Vκ轻链，而33.3H2杂交瘤表达来源于VκL15种系基因的Vκ轻链。经分析来自HuMAb 3D8的Vκ克隆，6条(I-VI)轻链在mRNA水平上表达(图1)。为了确定哪条轻链在蛋白质水平上表达，对纯化的3D8抗体进行质谱分析和N末端测序。当从细胞蛋白质中分离轻链并通过质谱法进行分析时，可见一条分子量为23,569道尔顿的轻链。其对应于具有图1所示I组氨基酸序列的轻链，来源于VκL19种系基因。该轻链的N-末端测序证实了该结果。图2A、3A和4A分别显示了3D8(I组；SEQ ID NOs4和30-34)、1B11(SEQ ID NO5)和33.3H2(SEQ ID NO6)的Vκ的核苷酸和氨基酸序列。CDR在上方划线，并且显示了种系Vκ和Jκ。
因此，3D8抗体包含产生自或来源于人VH 3-33基因的重链可变区和产生自或来源于人VκL19基因的轻链可变区。1B11抗体包含产生自或来源于人VH 3-33基因的重链可变区和产生自或来源于人VκL6基因的轻链可变区。33.3H2抗体包含产生自或来源于人VH 3-33基因的重链可变区和产生自或来源于人VκL15基因的轻链可变区。
抗体3D8和1B11表达人IgG1恒定区，抗体33.3H2表达人IgG3恒定区。实施例2-7中所述的抗体从这些杂交瘤中分离，因此表达图1所示的可变序列以及人恒定区。将编码每个克隆的抗原结合部分的DNA克隆到载体中，表达为人抗体，用于向人施用。
实施例2.抗毒素A抗体的结合活性应用标准技术通过ELISA测定每种抗体与毒素A的结合。该测定的结果在图5中显示。将3D8、1B11和33.3H2产生的抗体与具有毒素A结合活性的第四种人单克隆抗体8E6进行比较。图5显示这些抗体以相当的亲和力与毒素A结合。
3D8和1B11抗体对毒素A的亲和力也用Biacore仪器测定，该仪器用表面等离振子共振技术检测生物分子的结合相互作用。将每种抗体加到蛋白A包被的传感器芯片上，使毒素A在芯片上流动，以测定结合。3D8的KD为14.6×10-10M。1B11的KD为7.38×10-10M。因此，这些抗体以高亲和力与毒素A结合。这些结合常数表明这些抗体具有适合用于人类治疗的亲和力。
实施例3.抗毒素A抗体的毒素中和对1B11、3D8和33.3H2杂交瘤表达的抗体的体外毒素A中和活性进行检测。细胞在不同浓度毒素A存在下培养，这导致细胞积聚(roundup)并且不能附着于细胞培养皿。通过目测细胞测定细胞致病作用(CPE)。根据目测结果确定0-4的CPE得分(4＝100％细胞毒素，0＝0％毒性)。这些测定结果在图6A和6B中显示。测定对人肺成纤维细胞系IMR-90和人肠上皮细胞系T-84的毒性的中和。图6A显示所有抗体对IMR-90细胞都具有中和能力。毒素A对IMR-90细胞的细胞毒性的相对中和活性为1B11＞3H2＞3D8。有趣的是，对人结肠上皮细胞T-84细胞的相对中和活性为3D8≥1B11＞3H2(图6A)。T-84细胞被认为比其他细胞型对毒素A更敏感。T-84细胞可提供用于测定毒素A细胞毒性的更相关的靶细胞。
实施例4.抗毒素A抗体的表位作图每种单克隆抗体结合的毒素A的表位通过western印迹法测定。构建表达4个毒素A片段的重组大肠杆菌克隆，这4个片段代表酶结构域(即毒素A的氨基酸1-659)、受体结合结构域(即毒素A的氨基酸1853-2710)和介于之间的两个区(即毒素A的氨基酸660-1255和1256-1852)。由从艰难梭菌ATCC 43255株制备的基因组DNA经PCR扩增毒素A基因的适当区段。利用pET载体克隆这些片段，并转化BL21DE3细胞用于表达。该载体提供诱导型表达和用于纯化(即His标记)和检测(即V5表位标记)的亲和结构域。用IPTG诱导表达，通过亲和层析纯化片段。测定与4种不同毒素A片段的结合片段1对应于氨基酸1-659；片段2对应于氨基酸660-1255；片段3对应于氨基酸1256-1852；片段4对应于氨基酸1853-2710(图7)。1B11与片段1和片段2反应。33.3H2与片段2反应。3D8和另外一种人单克隆抗体6B4与片段4(受体结合结构域)反应。来自用类毒素A免疫的兔的多克隆抗血清与全部4个片段都反应。
对1B11和33.3H2表位详细作图。为了对1B11表位作图，产生了片段1(氨基酸1-659)的亚片段，其对应于氨基酸1-540、1-415、1-290和1-165(图8A)。1B11与片段1以及含有氨基酸1-540的片段结合。1B11不与其他亚片段结合。因此，被1B11结合的表位作图位于毒素A的氨基酸415-540之间。
为了对33.3H2表位作图，产生了片段2(氨基酸660-1255)的亚片段，其对应于氨基酸660-1146、660-1033、660-920和660-807(图8B)。33.3H2与对应于氨基酸660-1255、660-1146和660-1033的片段结合。33.3H2不与其他亚片段结合。因此，被33.3H2结合的表位作图位于毒素A的氨基酸920-1033之间。
实施例5.施用抗毒素A抗体保护小鼠避免致死性毒素A攻击检测每种抗体保护小鼠避免致死剂量毒素A攻击的能力。重10-20克的Swiss Webster雌性小鼠腹膜内注射可达250μg的3D8、1B11或33.3H2或对照抗体(抗呼吸道合胞体病毒抗体，MedImmune)，之后用毒素A攻击。注射约24小时后，用高于致死剂量(LD50)10倍的毒素A攻击小鼠，一般为100ng。在随后7天内观察动物的毒性指征。这些实验的结果总结在图9中。数据表示为百分存活率。如果给予非250μg的剂量，则括号中的数字指抗体剂量。图9显示每种抗体都能够一定程度地保护小鼠避免致死性毒素A的攻击。用3D8处理时存活小鼠的百分数为10-100％。用33.3H2处理时存活小鼠的百分数为20-100％。用1B11处理时存活小鼠的百分数为0-60％。这些单克隆抗体保护小鼠的相对能力为3H2≥3D8＞1B11。
实施例6.用抗毒素A抗体中和毒素A在结扎小鼠肠袢中的肠毒性在小鼠回肠袢模型中检测3D8和33.3H2抗体对毒素A肠毒性的中和。该模型检测小鼠肠中毒素A诱导的液体积累。为了进行这些实验，使每只小鼠饥饿16小时，麻醉，并暴露靠近盲肠的回肠。在每端双重结扎3-5厘米的袢，注射10μg毒素A。将回肠袢置回腹腔，闭合伤口，使动物恢复。手术4小时后，动物行安乐死，从动物中取出该袢。重新测量每段的长度，抽出管内液。计算每个袢的液体体积和体积长度(V∶L)比，单位为毫升每厘米。测试小鼠在手术前1-2天肠胃外注射抗体。这些实验的结果显示在图10中。注射毒素A使肠液的重量长度比提高了50％。3D8和33.3H2都阻止这种液体积累的增加。施用任一种抗体的小鼠具有与未接受任何毒素A注射的小鼠相当的重量长度比。因此，3D8和33.3H2在体内保护避免肠液积累。
这些结果表明抗毒素A单克隆抗体在体内保护避免毒素A介导的肠毒性。小鼠结扎袢数据显示这些单克隆抗体当全身施用时能够保护其避免粘膜损伤。
实施例7.抗毒素A抗体保护仓鼠避免艰难梭菌复发在仓鼠复发模型中检测3D8。仓鼠对艰难梭菌毒素的毒性作用敏感，在艰难梭菌的存在下，一般在接受单剂量克林霉素的2-3天内死亡。为了检测3D8在仓鼠中的效果，使用复发模型。在该模型中，给予仓鼠一次克林霉素，一天后给予一次艰难梭菌B1孢子。一组对照仓鼠不接受另外的抗生素或抗体。第二组对照仓鼠用10mg/kg/天的万古霉素处理。万古霉素是治疗艰难梭菌病中使用的抗生素。如图11A所示，一组试验仓鼠在艰难梭菌暴露后7天内每天接受10mg/kg/天的万古霉素和2mg/kg/天的抗毒素A的兔多克隆抗血清。第二组试验仓鼠以相同的时间间隔接受10mg/kg/d万古霉素和50mg/kg/天的3D8。仓鼠存活率对时间作图，在图11B中显示。
图11B显示只接受克林霉素和艰难梭菌(菱形)的所有仓鼠都在细菌攻击两天内死亡。12％(2/17)的万古霉素处理的仓鼠(正方形)在细菌攻击后存活；88％(15/17)在8天内死亡。41％(7/17)的万古霉素和3D8处理的仓鼠(十字形)在攻击后存活；59％(10/17)在7天内死亡。64％(7/11)的万古霉素和多克隆兔血清处理的仓鼠(三角形)在细菌攻击后存活；36％(4/11)在9天内死亡。这些数据也在图12中表示为每个处理组中总存活者的百分数。如该图所示，在接受万古霉素和多克隆兔血清的组中存活者的百分数最高(64％)。接受3D8和万古霉素的组具有第二高的存活率(41％)。万古霉素处理的仓鼠只有12％存活。未处理的仓鼠全都死亡。这些数据显示，当在注射后施用多克隆和单克隆抗毒素抗体时在体内保护其避免艰难梭菌病的复发。
实施例8.用于对人施用的抗毒素A抗体的产生应用标准重组DNA方法将编码3D8抗体的可变重链和轻链的核酸序列克隆到pIE-UgammalF载体中。该载体在大肠杆菌中扩增，纯化，并转移到CHO-dg44细胞内。将转染的细胞以每孔4×105细胞的密度接种于96-孔平皿中，并用G418对载体转染进行筛选。最初根据G418抗性选择了一个被命名为1D3的克隆，然后与其他转染瘤一起对IgG产生进行测定。在几轮扩增中相对于其他转染子，1D3具有较高水平的IgG产生。通过在浓度逐渐增加的氨甲喋呤的存在下生长，扩大3D8抗体的表达。选择能够在175nM氨甲喋呤中生长的培养物，用于为了进一步的开发而克隆单细胞。将该培养物以低密度接种于96孔板中导致产生起源于单细胞或克隆的培养物。对该培养物的人IgG产生进行筛选，选择产生最高水平IgG的细胞进一步应用。扩充氨甲喋呤扩增的克隆，以产生包括几十个细胞瓶的细胞库。
为了从转染的细胞制备抗体，培养在前述步中分离的克隆的细胞，并且扩增，作为生物反应器的接种物。该生物反应器一般容纳500升体积的培养基。细胞在生物反应器中培养，直到细胞生存力下降，这指示在培养中已经产生了最大的抗体浓度。过滤除去细胞。将滤液加至蛋白A柱上。抗体与该柱结合，用低pH洗液洗脱。然后，将抗体加样至Q-Sepharose柱上，除去残余的杂质，如CHO细胞蛋白质、DNA和其他杂质(例如病毒污染物，如果存在的话)。从Q-Sepharose柱上洗脱抗体，纳米过滤，浓缩，在缓冲液如PBS中洗涤。然后将该制剂无菌等分至小瓶中用于施用。
实施例9.多克降抗毒素B抗体的制备和表征两只Nubian山羊(#330和#331)肌肉内注射50μg UDP二醛灭活的毒素B(Techlab)和完全弗氏佐剂。以两周间隔肌肉内给予加强剂量的25μg类毒素B与不完全弗氏佐剂。4次免疫后进行检测采血。测定ELISA反应性和对毒素A和毒素B的细胞毒性的中和，以确定血清的特异性和交叉反应性。
经ELISA测定，两只动物均对毒素B有良好的应答，对毒素A有程度较低的应答。来自山羊#331的血清具有较低的毒素A交叉反应性，选择其用于大多数后续实验。如实施例3所述测定对IMR-90细胞的细胞毒性的中和。细胞毒性中和的结果在图13中显示，该图显示来自两只动物的血清均表现出良好的毒素B中和抗体效价和极低的但是可检测到的毒素A中和抗体效价。山羊血清保护小鼠避免毒素B(100ng)致死性腹膜内攻击的能力也得到证实(数据未显示)。
实施例10.抗毒素A和抗毒素B抗体保护仓鼠避免艰难梭菌复发仓鼠组(n＝20)用克林霉素和艰难梭菌攻击，然后如实施例7中仓鼠复发模型所述用万古霉素处理。万古霉素处理后每日两次给予抗体(3D8，来自山羊#331的血清，或3D8和来自山羊#331的血清)(图14)。监测动物的存活率(图15)或疾病(图16)。抗体剂量为，对于来自山羊#331的血清1ml，每日两次，对于3D83mg，每日两次。只接受万古霉素(即不接受抗体处理)的动物用作阴性对照。如以前所见，单用3D8和万古霉素处理证明有部分保护作用，其中20只动物中有10只得到保护而避免致死(图15)。该组中50％的动物保持健康(图16)。只接受万古霉素处理的20只动物中有6只得到保护(图15)。30％保持健康(图16)。当仅仅使用山羊血清时也观察到部分保护(9/20的动物得到保护)(图15)。40％保持健康。当山羊血清和3D8一起施用时，保护率增加到接近100％(18/20)，并且疾病发作延迟(图15)。这些动物中90％保持健康(图16)。显然，对于疾病的保护模式类似于对于致死性的保护模式。这些数据证明，在仓鼠疾病模型中当毒素B也被中和时，3D8能够提供完全保护。
实施例11.毒素B免疫的仓鼠中艰难梭菌复发的保护用RIBI作为佐剂，用大肠杆菌中表达的10μg毒素B的COOH-端片段(对应于毒素B的氨基酸1777-2366)腹膜内免疫仓鼠。动物接受7次毒素B抗原。在检测的动物中观察到中和抗体应答。如实施例7中的仓鼠复发模型所述，免疫组仓鼠用克林霉素和艰难梭菌攻击，然后用万古霉素处理。万古霉素处理后19只动物每日给予两次抗体(3D8，3mg/剂量)，然后与不接受处理的阴性对照组(n＝20)进行比较(图17和18)。6只动物接受攻击但不用万古霉素处理，以确保毒素B抗原免疫的仓鼠对艰难梭菌感染敏感。监测动物的存活率(图17)或疾病(图18)。图17显示未给予3D8的免疫动物以类似于以前所见的速度复发(65％复发)。接受3D8的毒素B免疫的动物比以前所见更全面地得到对于复发的保护(10％复发，与之相比，在其他实验中预先未用毒素B免疫的动物中约50％复发)。
图18显示接受3D8的一些免疫动物患病，但是其腹泻得到恢复。只接受万古霉素的免疫动物中有35％保持健康。在动物中不存在毒素B反应性血清的实验中，实际上所有患腹泻的动物后来都死亡。这些数据进一步证明当毒素B也被中和时，3D8在仓鼠疾病模型中能够提供完全保护。为了在该模型中对艰难梭菌病提供最佳保护，除毒素A之外还需要中和毒素B。
实施例12.在山羊抗毒素B血清处理的仓鼠中使用3D8保护仓鼠避免初次艰难梭菌攻击仓鼠中艰难梭菌病复发的预防比对直接攻击(即攻击而不施用万古霉素)的保护更易于证明。应用兔血清的实验证明对直接攻击只有弱保护，并且3D8对直接攻击没有可检测的作用。由于3D8在毒素B中和抗体的背景中保护性更高，因此确定联合施用3D8和抗毒素B抗血清是否能够预防直接攻击引起的疾病。每组5只仓鼠在每日接受一次3D8(3mg)、联合的3D8(3mg)和山羊#331(1ml)血清后进行攻击，或在攻击前3天不接受抗体，如图19所示。图20中的数据显示不接受抗体的动物或只接受3D8或山羊血清的动物均在艰难梭菌攻击48小时内死亡。大多数接受3D8和山羊血清的动物(80％)存活，受影响的动物在攻击后存活10天。图21显示用3D8和山羊血清处理的动物患病但是恢复。这些数据进一步证明当毒素B也被中和时，3D8在仓鼠疾病模型中能够提供完全保护。为了在该模型中对艰难梭菌病提供最佳保护，除毒素A之外还需要中和毒素B。
成功保护艰难梭菌直接攻击的仓鼠相比筛选新的毒素B候选物具有几个优点。可以使用数量更少的动物，因为100％的未处理的动物死亡。能够在仓鼠中直接筛选抗体，如单克隆抗体(例如人单克隆抗体)，因为该过程需要100mg或更少的测试抗体。其他检测方式，如复发模型，需要产生克级的量，因为在复发模型中攻击率较低，这需要检测数量较多的动物。直接攻击实验的持续时间也较短，最终在艰难梭菌攻击3-4天内读数，而在复发模型中为7-10天。另外，从筛选方法中去掉万古霉素处理减少了处理动物的次数。
实施例13.抗毒素B单克隆抗体的产生艰难梭菌毒素B自Techlab，Inc.(Blacksburg，Va)获得或重组产生。该毒素在免疫前纯化并灭活。灭活通过用反应性UDP-二醛处理进行，这导致催化残基的烷基化而保持天然毒素结构。简言之，纯化的毒素B与UDP-2’，3’-二醛(0.1-1.0mM)在缓冲液中37℃温育18小时，通过100kDa截断值的滤纸过滤，以除去未反应的UDP-2’，3’-二醛，并且用缓冲液洗涤。灭活的毒素B(类毒素B)或重组毒素B片段作为免疫原。毒素B受体结合结构域(氨基酸残基1777-2366)在大肠杆菌中表达为含有免疫标记(六组氨酸)的融合蛋白，该免疫标记用于通过镍螯合物亲和层析进行亲和纯化(命名为片段4；参见实施例11)。
如以上标题为“在HuMAb小鼠中产生人单克隆抗体”的章节所述产生的以及由Medarex，Milpitas，CA提供的Hco12转基因小鼠每次用RIBI佐剂中的10μg类毒素腹膜内免疫，共6-12次。在HCo12转基因小鼠中，已经如Chen等(1993)EMBO J.12811-820所述将内源小鼠κ轻链基因纯合地破坏，并且已经如PCT公布WO 01/09187的实施例1所述将内源小鼠重链基因纯合地破坏。HCo12转基因小鼠携带如Fishwild等(1996)Nature Biotechnology 14845-851所述的人κ轻链转基因KCo5，和如美国专利号5,545,806；5,625,825；和5,545,807所述的HCo12人重链转基因。从每只小鼠采集血清，通过ELISA检测对毒素B的反应性，以及对IMR-90细胞的细胞毒性的中和。检测为毒素B反应性和中和抗血清阳性的小鼠通过尾静脉注射5-10μg类毒素B或片段4。在尾静脉注射大约3天后杀死小鼠，分离脾脏用于与杂交瘤融合。
产生克隆杂交瘤，并通过ELISA筛选。选择三个杂交瘤克隆进一步分析124-152；2A11；和1G10。特别地，通过RT-PCR由mRNA扩增来自124-152克隆的cDNA，克隆，并测序。重链V区确定来源于种系序列VH 5-51，D区来源于种系序列7-27，J序列来源于种系区JH3b。轻链(κ)区确定来源于A27，J区来源于JK1。124-152克隆的同种型确定为IgG1。124-152克隆的VH和VL区的氨基酸序列在图27-28中显示。互补决定区(CDR)在图中标出。VH和VL区的相关种系序列在图30-31中显示。
从相应杂交瘤中分离抗体124-152、2A11和1G10，检测它们的结合特性(见下文)。将编码124-152克隆的DNA克隆到载体中，表达为用于对人施用的人抗体。
实施例14.抗毒素B抗体的结合活性利用标准技术通过Biacore测定每种抗体与毒素B的结合。该测定结果显示在表6中。将124-152、2A11和1G10产生的抗体与合适的对照进行比较。
具体地，用Biacore仪器测定124-152、2A11和1G10抗体对毒素B的亲和力，该仪器用表面等离振子共振技术检测生物分子的结合相互作用。将每种抗体加到蛋白A包被的传感器芯片上，使毒素B在芯片上流动，以测定结合。124-152的KD为1.64×10-10M；2A11的KD为0.24×10-10M；1G10的KD为2.98×10-10M。因此，这些抗体以高亲和力与毒素B结合。这些结合常数表明这些抗体具有适合用于体内应用例如人类治疗的亲和力。
表6

实施例15.抗毒素B抗体的毒素中和检测124-152、2A11和1G10杂交瘤表达的抗体的体外毒素B中和活性。细胞在不同浓度的毒素B特异的单克隆抗体存在下培养，这将阻止细胞在暴露于毒素B后积聚。通过目测细胞测定细胞致病作用(CPE)。根据目测结果确定0-4的CPE得分(4＝100％细胞毒性，0＝0％毒性)。这些测定的结果在图27中显示。对人肺成纤维细胞系IMR-90的毒性的中和。图27显示所有抗体对IMR-90细胞都具有中和能力。毒素A对IMR-90细胞的细胞毒性的相对中和活性为124-152＞1G10＞2A11。
实施例16.用抗毒素B抗体保护仓鼠避免初次艰难梭菌攻击对于艰难梭菌接种物直接攻击的保护(第-1天克林霉素，第0天艰难梭菌孢子(1/100,000稀释)在存在或不存在抗毒素B抗体的情况下在4-10天的期限内进行。每组5只仓鼠在接受每日一次3D8(4天总共20mg)、联合的3D8(相同量)和山羊#331(3ml)血清、3D8联合抗毒素B抗体124-152(4天总共18mg)、2A11(4天总共20mg)或1G10(4天总共20mg)后进行攻击，或在攻击前3天不接受抗体，如图24所示。图24中的数据显示不接受抗体的动物或只接受3D8或山羊血清的动物均在艰难梭菌攻击72小时内死亡，而接受3D8和抗毒素B抗体、优选联合124-152的动物具有40％的存活率(图24)。用含量逐渐增加的抗毒素B抗体124-152(在第-3、-2、-1和0天给予0.56mg、1.7mg或5.0mg)进行如前述相似的为期10天的研究。既接受3D8又接受山羊血清的动物存活，如果给予3D8联合124-152，大多数动物(60％-70％)在攻击后存活10天。甚至最低剂量的抗毒素B抗体124-152(0.56mg联合3D8)也高度有效(70％存活率；参见图25)。结果显示，单用124-152和3D8比联合使用时有效性低，联合使用时不只达到加合作用，实际上达到协同的治疗结果(图24-26)。这些数据进一步证明抗毒素B抗体高度有效，特别是在与抗毒素A抗体3D8联用时。在该模型中除毒素A外毒素B的中和确定提供对艰难梭菌病的保护。
实施例17.抗毒素B抗体的表位作图被每种单克隆抗体结合的毒素B的表位通过western印迹法检测。构建表达代表毒素B不同结构域的毒素B片段的重组大肠杆菌克隆。由适当艰难梭菌株制备的DNA经PCR扩增毒素B基因的合适区段。将这些片段克隆到表达载体中，并且在大肠杆菌中表达。为了对结合表位作图，利用人单克隆抗体152探查western印迹中的毒素B片段。从含有一部分毒素B基因的大肠杆菌中分离毒素B蛋白片段，并用SDS-PAGE分开。电泳后，将毒素B片段转移到硝酸纤维素上，用单克隆抗体152然后用碱性磷酸酶偶联的山羊抗人抗体探针杂交，以检测MAb 152的结合。确定HuMab 152与介于氨基酸1777与2366之间的毒素B的-COOH片段部分结合(参见，例如，图32)。
其他实施方案已经描述了本发明的许多实施方案。但是应当理解，可以进行各种修饰而不脱离本发明的精神和范围。因此，其他实施方案也在下面的权利要求书的范围内。
权利要求
1.一种与艰难梭菌外毒素特异性结合的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分。
2.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与艰难梭菌毒素A(毒素A)特异性结合。
3.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与艰难梭菌毒素B(毒素B)特异性结合。
4.权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分在体外中和毒素A。
5.权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分在体内中和毒素A。
6.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分在体内抑制艰难梭菌介导的疾病。
7.权利要求6的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分具有以下一个或多个特征在受试者中防止或抑制艰难梭菌介导的结肠炎；在受试者中防止或抑制抗生素相关的结肠炎；在受试者中防止或抑制艰难梭菌介导的假膜性结肠炎(PMC)；在受试者中防止或抑制艰难梭菌介导的腹泻；和抑制艰难梭菌介导的疾病的复发。
8.权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与毒素A的N末端一半内的表位特异性结合。
9.权利要求8的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与毒素A的氨基酸1-1256之间的表位结合。
10.权利要求3的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与选自毒素B的C末端一半和毒素B受体结构域的表位特异性结合。
11.权利要求10的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与毒素B受体结构域的氨基酸1777-2366之间的表位结合。
12.权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与毒素A的C末端受体结合结构域内的表位特异性结合。
13.权利要求12的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与毒素A的氨基酸1852-2710之间的表位结合。
14.权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与毒素A的氨基酸659-1852内的表位结合。
15.权利要求8的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与毒素A的氨基酸1-600、400-600或415-540内的表位特异性结合。
16.权利要求14的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与毒素A的氨基酸900-1852、900-1200或920-1033内的表位特异性结合。
17.权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分以低于20×10-6M的KD与毒素A特异性结合。
18.权利要求3的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分以低于20×10-6M的KD与毒素B特异性结合。
19.权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变重链区，该可变重链区包含与SEQ ID NO1、SEQ IDNO2或SEQ ID NO3的可变重链区氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
20.权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变轻链区，该可变轻链区包含与SEQ ID NO4、SEQ IDNO5或SEQ ID NO6的可变轻链区氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
21.权利要求3的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变重链区，该可变重链区包含与SEQ ID NO54或SEQID NO56的可变重链区氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
22.权利要求3的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含可变轻链区，该可变轻链区包含与SEQ ID NO58或SEQID NO60的可变轻链区氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
23.权利要求19的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分还包含一个可变轻链区，该可变轻链区包含与SEQ ID NO4、SEQ ID NO5或SEQ ID NO6的可变轻链氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列。
24.权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与一个表位特异性结合，该表位与被克隆3D8、1B11或3H2产生的抗体结合的表位重叠。
25.权利要求3的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与一个表位特异性结合，该表位与被克隆124-152、2A11或1G10产生的抗体结合的表位重叠。
26.权利要求24的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分与克隆3D8、1B11或3H2产生的抗体竞争结合毒素A。
27.权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分的可变重链区包含与SEQ ID NOs7-15中的一个或多个至少80％相同的一个或多个互补决定区(CDR)。
28.权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分的可变轻链区包含与SEQ ID NOs16-24中的一个或多个至少80％相同的一个或多个CDR。
29.权利要求3的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分的可变重链区包含与SEQ ID NOs62、64和66中的一个或多个至少80％相同的一个或多个互补决定区(CDR)。
30.权利要求3的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分的可变轻链区包含与SEQ ID NOs68、70和72中的一个或多个至少80％相同的一个或多个CDR。
31.权利要求21的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分的可变轻链区包含与SEQ ID NOs16-24中的一个或多个至少80％相同的一个或多个CDR。
32.权利要求21的抗体或其抗原结合部分，其中可变重链区包含与SEQ ID NOs10-15中的一个或多个的可变重链区CDR至少80％相同的三个CDR。
33.权利要求22的抗体或其抗原结合部分，其中可变轻链区包含与SEQ ID NOs16-18、SEQ ID NOs19-21或SEQ ID NOs22-24至少80％相同的三个CDR。
34.权利要求23的抗体或其抗原结合部分，其中可变重链区包含与SEQ ID NOs7-9、SEQ ID NOs10-12或SEQ ID NOs13-15至少80％相同的三个CDR。
35.权利要求26的抗体或其抗原结合部分，其中可变轻链区包含与SEQ ID NOs16-18、SEQ ID NOs19-21或SEQ ID NOs22-24至少80％相同的三个CDR。
36.权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中可变轻链区的互补决定区1(CDR1)包含氨基酸序列R-A-S-Q-X-X-S-S-X-L-A(SEQ IDNO25)，其中可变轻链区的互补决定区2(CDR2)包含氨基酸序列A-S-X-X-X-S/T(SEQ ID NO26)，并且其中可变轻链区的互补决定区3(CDR3)包含氨基酸序列Q-Q-X-X-S/N-X-P/S(SEQ ID NO27)，其中X是任意氨基酸。
37.权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中可变重链区的CDR1包含氨基酸序列Y-G-M-H(SEQ ID NO28)，并且其中可变重链区的CDR2包含氨基酸序列I-W-X-X-G-X-X-X-Y-X-X-S-X-X-G(SEQ IDNO29)，其中X是任意氨基酸。
38.权利要求29的抗体或其抗原结合部分，其中可变轻链区的CDR1包含氨基酸序列R-A-S-Q-X-X-S-S-X-L-A(SEQ ID NO25)，其中可变轻链区的CDR2包含氨基酸序列A-S-X-X-X-S/T(SEQ ID NO26)，并且其中可变轻链区的CDR3包含氨基酸序列Q-Q-X-X-S/N-X-P/S(SEQ ID NO27)。
39.权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制毒素A与哺乳动物细胞的结合。
40.权利要求2的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是全长抗体。
41.权利要求3的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分抑制毒素B与哺乳动物细胞的结合。
42.权利要求3的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是全长抗体。
43.一种与艰难梭菌外毒素特异性结合的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分(a)包含产生自或来源于VH 3-33基因的重链可变区；且(b)包含产生自或来源于人Vκ基因的轻链可变区，该人Vκ基因选自VκL19、VκL6和VκL15。
44.一种分离的多肽，其包含杂交瘤克隆3D8、1B11或3H2产生的抗体的抗原结合部分。
45.一种与艰难梭菌外毒素特异性结合的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分(a)包含产生自或来源于VH5-51基因的重链可变区；且(b)包含产生自或来源于人VκA27基因的轻链可变区。
46.一种分离的多肽，其包含杂交瘤克隆124-152、2A11或1G10产生的抗体的抗原结合部分。
47.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含效应结构域。
48.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分包含Fc结构域。
49.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是单链抗体。
50.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其中所述抗体或其抗原结合部分是Fab片段。
51.一种药物组合物，其在药物可接受的载体中包含权利要求1的抗体或其抗原结合部分。
52.权利要求1的抗体或其抗原结合部分，其还包含标记物。
53.一种分离的核酸，其包含编码与SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4、SEQ ID NO5、SEQ ID NO6、SEQ IDNO54、SEQ ID NO56、SEQ ID NO58或SEQ ID NO60至少90％相同的多肽的序列。
54.包含权利要求53的核酸的一种表达载体。
55.包含权利要求53的核酸的一种宿主细胞。
56.权利要求55的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
57.权利要求55的宿主细胞，其中所述宿主细胞是真核细胞。
58.权利要求55的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞.
59.一种试剂盒，其包括权利要求1的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分，和用于治疗艰难梭菌介导的疾病的说明。
60.一种治疗受试者的艰难梭菌疾病的方法，该方法包括以有效抑制艰难梭菌疾病症状的量向受试者施用权利要求1的分离的人单克隆抗体或其抗原结合部分。
61.权利要求60的方法，其中所述受试者是人。
62.权利要求60的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分静脉内、肌肉内或皮下施用给受试者。
63.权利要求60的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分与第二种药物联合施用。
64.权利要求63的方法，其中所述第二种药物是第二种人单克隆抗体或其抗原结合部分。
65.权利要求64的方法，其中所述抗体或其抗原结合部分与艰难梭菌毒素A特异性结合，所述第二种人单克隆抗体或其抗原结合部分与艰难梭菌毒素B特异性结合。
66.权利要求64的方法，其中所述第二种药物是抗生素。
67.权利要求67的方法，其中所述第二种药物是万古霉素或甲硝唑。
68.权利要求65的方法，其中所述两种物质与抗生素联合施用。
69.权利要求64的方法，其中所述第二种药物是艰难梭菌疫苗。
70.权利要求61的方法，其中艰难梭菌引起抗生素相关的腹泻、艰难梭菌介导的假膜性结肠炎(PMC)、腹泻或艰难梭菌介导的疾病的复发。
71.一种组合物，其包含(a)与艰难梭菌毒素A特异性结合的分离的人单克隆抗体，和(b)与艰难梭菌毒素B特异性结合的分离的抗体。
72.权利要求71的组合物，其中所述与艰难梭菌毒素A特异性结合的分离的抗体是选自3D8、1B11和3H2的人单克隆抗体。
73.权利要求71的组合物，其中所述与艰难梭菌毒素B特异性结合的分离的抗体是选自124-152、2A11和1G10的人单克隆抗体。
74.权利要求71的组合物，其中所述与艰难梭菌毒素A特异性结合的分离的抗体是人单克隆抗体3D8，并且所述与艰难梭菌毒素B特异性结合的分离的抗体是人单克隆抗体124-152。
75.一种适用于治疗哺乳动物中艰难梭菌相关疾病或障碍的组合物，其包含毒素A结合抗体或其片段，和毒素B结合抗体或其片段，其中所述抗体或其片段以协同有效的量存在。
76.权利要求75的组合物，其中所述与艰难梭菌毒素A结合的抗体或其片段是选自3D8、1B11和3H2的人单克隆抗体。
77.权利要求75的组合物，其中所述与艰难梭菌毒素B结合的抗体或其片段是选自124-152、2A11和1G10的人单克隆抗体。
78.一种用于治疗哺乳动物中艰难梭菌相关疾病或障碍的方法，包括向该哺乳动物施用协同有效量的毒素A结合抗体或其片段和毒素B结合抗体或其片段，从而实现治疗。
79.权利要求78的方法，其中所述与艰难梭菌毒素A结合的抗体或其片段是选自3D8、1B11和3H2的人单克隆抗体。
80.权利要求78的方法，其中所述与艰难梭菌毒素B结合的抗体或其片段是选自124-152、2A11和1G10的人单克隆抗体。
全文摘要
本发明提供了与艰难梭菌毒素特异性结合的抗体，其抗原结合部分，以及制备并且应用该抗体及其抗原结合部分的方法。
文档编号C12N1/21GK101014620SQ200580004126
公开日2007年8月8日 申请日期2005年2月4日 优先权日2004年2月6日
发明者唐娜·安布罗西诺, 格雷戈里·J·巴布科克, 特里萨·布罗林, 罗伯特·格拉齐亚诺, 赫克托·贾维尔·赫南德兹, 伊斯雷尔·洛伊, 罗伯特·曼德尔, 德博尔·莫尔里尼, 小威廉·D·托马斯, 张慧芬 申请人:马萨诸塞州大学, 米德列斯公司