涉及突变体难辨梭菌毒素的组合物及其方法
【专利摘要】在一方面，本发明涉及免疫原性组合物，其包含突变体难辨梭菌毒素A和/或突变体难辨梭菌毒素B。相对于相应的野生型难辨梭菌毒素，每种突变体毒素包括具有至少一个突变的葡萄糖基转移酶结构域和具有至少一个突变的半胱氨酸蛋白酶结构域。所述突变体毒素还可包含至少一个经化学交联的氨基酸。在另一方面，本发明涉及结合所述免疫原性组合物的抗体或其结合片段。在另外的方面，本发明涉及编码任意前述物质的分离的核苷酸序列，以及使用任意前述组合物的方法。
【专利说明】涉及突变体难辨梭菌毒素的组合物及其方法
[0001]相关申请的交叉参考
[0002]本申请要求2011 年 4 月 22 日提交的 U.S.Provisional PatentApplication61/478, 474、和 2011 年 4 月 25 日提交的 U.S.Provisional PatentApplication61/478，899的优先权。上述申请的全部内容以其整体援引加入本文。
发明领域
[0003]本发明针对的是涉及突变体难辨梭菌(Clostridium difficile)毒素的组合物及其方法。
[0004]发明背景
[0005]难辨梭菌(C.difficile)是革兰氏阳性的厌氧菌，其与人类胃肠道疾病相关。如果天然肠菌群由于用抗体治疗而减少，则难辨梭菌的建群通常在结肠中发生。通过葡萄糖基化毒素，毒素A和毒素B(分别为308和270kDa,其是难辨梭菌的主要毒力因子)的分泌，感染可导致抗生素相关性腹泻以及有时导致假膜性结肠炎。
[0006]毒素A和毒素B分别是由基因tcdA和tcdB在19kb的致病性基因座(PaLoc)内所编码的。难辨梭菌的非致病性菌株中此基因座被另外的115碱基对的序列所置换。
[0007]毒素A和毒素B均为强力细胞毒素。这些蛋白是使Rho/Rac/Ras家族的小GTPase失活的同源葡萄糖基转移酶。所导致的信号传导中断会引起细胞-细胞连接、肌动蛋白细胞骨架失调、和/或凋亡的丧失，导致与难辨梭菌感染(CDI)相关的深层分泌性腹泻(profound secretory diarrhea)。
[0008]在最近十年，在医院、疗养院、和其它长期护理机构中难辨梭菌爆发的次数和严重性大幅增加。此增加的主要因素包括高毒性致病菌株的出现、抗生素使用的增加、检测方法的改善、和健康护理机构中对空气散播孢子暴露的增加。
[0009]甲硝唑和万古霉素是目前接受的用于难辨梭菌相关疾病(CDAD)抗生素治疗的护理标准。然而，大约20%接受此种治疗的患者在第一期CDI之后经历感染的复发，以及达到大约50%的那些患者患有另外的复发。复发的治疗是非常重要的挑战，大部分的复发通常在前一期的一个月之内发生。
[0010]因此，需要涉及难辨梭菌的免疫原性和/或治疗性组合物以及其方法。
[0011]发明概述
[0012]本发明在本文中提供了这些以及其它的目标。
[0013]在一方面，本发明涉及免疫原性组合物，其包括突变体难辨梭菌毒素A。相对于相应的野生型难辨梭菌毒素A，所述突变体难辨梭菌毒素A包括具有至少一个突变的葡萄糖基转移酶结构域和具有至少一个突变的半胱氨酸蛋白酶结构域。在一个实施方案中，所述突变体难辨梭菌毒素A的至少一个氨基酸是经化学交联的。
[0014]在一方面，本发明涉及包括SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的分离的多肽，其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在，并且其中所述多肽包括至少一个经1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)碳二亚胺)(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学修饰的氨基酸侧链。[0015]在一个实施方案中，所述突变体难辨梭菌毒素的至少一个氨基酸是经化学交联的。
[0016]在一个实施方案中，所述至少一个氨基酸氨基酸是经如下化学交联的:甲醛，1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳二亚胺(EDC)，N-羟基琥珀酸酯/盐，或者EDC和NHS的组合。
[0017]在一个实施方案中，所述免疫原性组合物由各自的抗毒素中和抗体或其结合片段所识别
[0018]在一个实施方案中，相对于相应的野生型难辨梭菌毒素，所述免疫原性组合物展现降低的细胞毒性。
[0019]在另一方面，本发明涉及免疫原性组合物，其包括突变体难辨梭菌毒素A，所述突变体难辨梭菌毒素A包括具有SEQ ID NO: 29的葡萄糖基转移酶结构域，其在位置285和287具有氨基酸取代(相对于相应的野生型难辨梭菌毒素A)，以及具有SEQ ID NO: 32的半胱氨酸蛋白酶结构域，其在位置158具有氨基酸取代(相对于相应的野生型难辨梭菌毒素A)，其中所述突变体难辨梭菌毒素A的至少一个氨基酸是经化学交联的。
[0020]在另外的方面，本发明涉及包括突变体难辨梭菌毒素A的免疫原性组合物，所述突变体难辨梭菌毒素A包括SEQ ID NO:4，其中所述突变体难辨梭菌毒素A的至少一个氨基酸是经化学交联的。 [0021]在另一方面，本发明涉及免疫原性组合物，其包括SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQID NO: 6，SEQ ID NO: 7，或 SEQ ID NO: 8。
[0022]在一方面，本发明涉及包括突变体难辨梭菌毒素B的免疫原性组合物。相对于相应的野生型难辨梭菌毒素B，所述突变体难辨梭菌毒素B包括具有至少一个突变的葡萄糖基转移酶结构域和具有至少一个突变的半胱氨酸蛋白酶结构域。
[0023]在另一方面，本发明涉及包括SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的分离的多肽，其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在，并且其中所述多肽包括至少一个经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺)(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学修饰的氨基酸侧链。
[0024]在另一方面，本发明涉及包括突变体难辨梭菌毒素B的免疫原性组合物，所述突变体难辨梭菌毒素B包括具有SEQ ID NO: 31的葡萄糖基转移酶结构域，其在位置286和288具有氨基酸取代(相对于相应的野生型难辨梭菌毒素B)，和具有SEQ ID NO: 33的半胱氨酸蛋白酶结构域，其在位置155具有氨基酸取代(相对于相应的野生型难辨梭菌毒素B)，其中所述突变体难辨梭菌毒素B的至少一个氨基酸是经化学交联的。
[0025]在另外的方面，本发明涉及包括突变体难辨梭菌毒素B的免疫原性组合物，所述突变体难辨梭菌毒素B包括SEQ ID N0:6，其中所述突变体难辨梭菌毒素B的至少一个氨基酸是经化学交联的。
[0026]在一方面，本发明涉及包括突变体难辨梭菌毒素A和突变体难辨梭菌毒素B的免疫原性组合物，所述突变体难辨梭菌毒素A包括SEQ ID NO:4，所述突变体难辨梭菌毒素B包括SEQ ID N0:6，其中每个所述突变体难辨梭菌毒素的至少一个氨基酸是经化学交联的。
[0027]在另外的方面，本发明涉及包括多核苷酸的重组细胞或其后代，所述多核苷酸编码任意前述突变体难辨梭菌毒素，其中所述细胞缺乏编码毒素的内源多核苷酸。
[0028]在另一方面，本发明涉及抗体或其抗体结合片段，其特异于包括突变体难辨梭菌毒素的免疫原性组合物。
[0029]在一方面，本发明涉及在哺乳动物中治疗难辨梭菌感染的方法。所述方法包括向哺乳动物施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括突变体难辨梭菌毒素A和突变体难辨梭菌毒素B，所述突变体难辨梭菌毒素A包括SEQ ID N0:4，所述突变体难辨梭菌毒素B包括SEQ ID N0:6，其中每个所述突变体难辨梭菌毒素的至少一个氨基酸是经甲醛交联的。
[0030]在一方面，本发明涉及在哺乳动物中治疗难辨梭菌感染的方法。所述方法包括向哺乳动物施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括突变体难辨梭菌毒素A和突变体难辨梭菌毒素B，所述突变体难辨梭菌毒素A包括SEQ ID N0:4，所述突变体难辨梭菌毒素B包括SEQ ID NO:6，其中每个所述突变体难辨梭菌毒素的至少一个氨基酸是经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和/或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联的。
[0031]在一方面，本发明涉及在哺乳动物中诱导对难辨梭菌感染免疫应答的方法。所述方法包括向哺乳动物施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括突变体难辨梭菌毒素A和突变体难辨梭菌毒素B，所述突变体难辨梭菌毒素A包括SEQ ID NO: 4，所述突变体难辨梭菌毒素B包括SEQ ID N0:6，其中每个所述突变体难辨梭菌毒素的至少一个氨基酸是经甲醛交联的。
[0032]在一方面，本发明涉及在哺乳动物中诱导对难辨梭菌感染免疫应答的方法。所述方法包括向哺乳动物施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包括突变体难辨梭菌毒素A和突变体难辨梭菌毒素B，所述突变体难辨梭菌毒素A包括SEQ ID NO: 4，所述突变体难辨梭菌毒素B包括SEQ ID N0:6，其中每个所述突变体难辨梭菌毒素的至少一个氨基酸是经
1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳二亚胺和/或N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)交联的。
[0033]在一个实施方案中，治疗的方法或者诱导免疫应答的方法是在有需要的哺乳动物中.[0034]在一个 实施方案中，治疗的方法或者诱导免疫应答的方法包括已患有复发的难辨梭菌感染的哺乳动物。
[0035]在一个实施方案中，治疗的方法或者诱导免疫应答的方法包括胃肠外施用组合物。
[0036]在一个实施方案中，治疗的方法或者诱导免疫应答的方法包括还含有佐剂的免疫原性组合物。
[0037]在一个实施方案中，所述佐剂包括氢氧化铝凝胶和CpG寡核苷酸。在另一实施方案中，所述佐剂包括ISCOMATRIX。
[0038]在一个实施方案中，所述分离的多肽包括经甘氨酸化学交联的所述多肽的至少一个天冬氨酸残基侧链或所述多肽的至少一个谷氨酸残基侧链。
[0039]在一个实施方案中，所述分离的多肽包括所述多肽的天冬氨酸残基侧链和所述多肽的赖氨酸残基侧链之间的至少一个交联；和所述多肽的谷氨酸残基侧链和所述多肽的赖氨酸残基侧链之间的至少一个交联。
[0040]在一个实施方案中，所述分离的多肽包括连接至所述多肽的至少一个赖氨酸残基侧链的丙氨酸部分。
[0041]在一个实施方案中，所述分离的多肽包括连接至所述多肽的天冬氨酸残基侧链或者连接至所述多肽的谷氨酸残基侧链的甘氨酸部分。[0042]在一个实施方案中，所述分离的多肽包括SEQ ID N0:4所示的氨基酸序列，其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在，并且其中所述多肽的至少一个赖氨酸残基侧链连接β-丙氨酸部分。
[0043]在一个实施方案中，所述分离的多肽包括SEQ ID Ν0:6所示的氨基酸序列，其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在，并且其中所述多肽的至少一个赖氨酸残基侧链连接β-丙氨酸部分。
[0044]在一个实施方案中，所述分离的多肽包括连接至天冬氨酸残基侧链或连接至谷氨酸残基侧链的第二个赖氨酸残基的侧链。
[0045]在一个实施方案中，所述分离的多肽包括连接甘氨酸部分的所述多肽的天冬氨酸残基侧链或者谷氨酸残基侧链。
[0046]在一个实施方案中，所述分离的多肽具有至少约100 μ g/ml的EC5(I。
[0047]在一方面，所述免疫原性组合物包括具有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的分离的多肽(其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在)，和具有SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的分离的多肽(其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在)，并且其中所述多肽具有至少一个经1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳二亚胺)(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学修饰的氨基酸侧链。
[0048]在一个实施方案中，所述多肽包括如下中任意的至少一个:a)a)连接至所述多肽赖氨酸侧链的至少一个β-丙氨酸部分；b)天冬氨酸残基侧链和所述多肽的赖氨酸残基侧链之间的至少一个交联；和c)谷氨酸残基侧链和所述多肽的赖氨酸残基侧链之间的至少一个交联。
[0049]在一个实施方案中，所述分离的`多肽具有至少约100 μ g/ml的EC5(I。
[0050]在一方面，所述免疫原性组合物包括具有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的分离的多肽(其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在)，和具有SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的分离的多肽(其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在)，并且a)其中SEQ ID N0:4的至少一个赖氨酸残基侧链连接β -丙氨酸部分，以及b)其中SEQ ID NO: 6的至少一个赖氨酸残基侧链连接丙氨酸部分。
[0051]在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包括SEQ ID Ν0:4的第二个赖氨酸残基侧链连接天冬氨酸残基侧链或连接谷氨酸残基侧链，并且其中SEQ ID Ν0:6的第二个赖氨酸残基连接天冬氨酸残基侧链或连接谷氨酸残基侧链。
[0052]在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包括连接甘氨酸部分的具有SEQ IDΝ0:4所示氨基酸序列(其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在)的多肽的天冬氨酸残基侧链或谷氨酸残基侧链。
[0053]在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包括连接甘氨酸部分的具有SEQ IDΝ0:6所示氨基酸序列(其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在)的多肽的天冬氨酸残基侧链或谷氨酸残基侧链。
[0054]在一个实施方案中，所述分离的多肽具有至少约100 μ g/ml的EC5(I。
[0055]在一方面，所述免疫原性组合物包括:具有SEQ ID NO:84所述氨基酸序列的分离的多肽和具有SEQ ID N0:86所述氨基酸序列的分离的多肽，其中每个多肽包括:a)所述多肽的天冬氨酸残基侧链和所述多肽的赖氨酸残基侧链之间的至少一个交联；b)所述多肽的谷氨酸残基侧链和所述多肽的赖氨酸残基侧链之间的至少一个交联；C)连接至所述多肽的至少一个赖氨酸残基侧链的β-丙氨酸部分；和d)连接至所述多肽的至少一个天冬氨酸残基侧链或所述多肽的至少一个谷氨酸残基侧链的甘氨酸部分。[0056]附图简述
[0057]图1:来自菌株630、VPI10463、R20291、CD196的野生型难辨梭菌毒素A和具有SEQID NO:4的突变体毒素A的序列比对，其中使用CLUSTALW比对，默认参数。
[0058]图2:来自菌株630、VPI10463、R20291、CD196的野生型难辨梭菌毒素A和具有SEQID NO:6的突变体毒素B的序列比对，其中使用CLUSTALW比对，默认参数。
[0059]图3:显示对野生型毒素阴性的难辨梭菌菌株进行鉴别的图。对于毒素A，通过ELISA测试了 13种难辨梭菌菌株的培养基。如其中所示，7种菌株表达了毒素A而6种菌株未表达(菌株 1351,3232,7322,5036,4811 和 VPI11186)。
[0060]图4A和B: SDS-PAGE结果，说明了三重突变体A (SEQ ID NO: 4),双重突变体B (SEQID NO: 5)，和三重突变体B (SEQ ID NO: 6)，在使用UDP-14C-葡萄糖的体外葡萄糖基化测定中并不将Racl或RhoA GTPase葡萄糖基化；而10 μ g至Ing的野生型毒素B却葡萄糖基化 Rac I。
[0061]图5:Western印迹，表明了与野生型毒素A和B(分别为SEQ ID N0:1和2)的剪切片段相比，突变体毒素A和B (分别为SEQ ID N0:4和6)中半胱氨酸蛋白酶活性的消除。参见实施例13。
[0062]图6:显示通过在MR-90中进行体外细胞毒性测试，三重突变体毒素A和B (分别为SEQ ID N0:4和6)在高浓度(例如约100 μ g/ml)测试时展现残余细胞毒性的图。
[0063]图7:显示三重突变体毒素B (SEQ ID NO:6)和七重突变体毒素B (SEQ ID NO:8)的EC5tl值类似的图。
[0064]图8:代表体外细胞毒性测试中结果的图，其中将ATP水平(RLU)针对三重突变体TcdA(SEQ ID N0:4)(上部分)和三重突变体TcdB(SEQ ID N0:6)(下部分)升高的浓度作图。突变体毒素A和B的残余细胞毒性能够用特异于突变体毒素A (上部分-pAb A和mAbA3-25+A60-22)和特异于突变体毒素B (下部分-pAb B)的中和抗体完全消除。
[0065]图9:处理后72小时的MR-90细胞形态图。A部分显示了模拟处理的对照细胞。B部分显示了用经福尔马林失活的突变体TcdB (SEQ ID NO:6)处理之后的细胞形态。C部分显示了用经EDC失活的突变体TcdB (SEQ ID NO:6)处理之后的细胞形态。D部分显示了用野生型毒素B(SEQ ID NO:2)处理之后的细胞形态。E部分显示了用三重突变体TcdB(SEQID NO:6)处理之后的细胞形态。在TcdA处理中观测到类似结果。
[0066]图10:显示实施例25中所述中和抗体滴度的图(研究muCdiff2010_06)。
[0067]图11:显示实施例26中所述中和抗体滴度的图(研究muCdiff2010_07)。
[0068]图12:显示了 4次免疫后仓鼠中针对毒素A和B的中和抗体应答的图，如实施例27所述(研究ham难辨梭菌2010-02)。
[0069]图13:显示了用化学失活的遗传突变体毒素和List Biological类毒素接种后仓鼠中的中和抗体应答的图，如实施例27中所述(研究ham难辨梭菌2010-02)。
[0070]图14:三个免疫组的仓鼠与未免疫对照相比的存活曲线，如实施例28所述(研究ham难辨梭菌2OlO-O2,续)。[0071]图15:显示仓鼠中针对难辨梭菌突变体毒素不同配制物的相对中和抗体应答的图(研究ham难辨梭菌2010-03)，如实施例29所述。[0072]图16A-B:显示食蟹猴中针对化学失活的遗传突变体毒素A和B(分别为SEQ IDN0:4和6)的强的相对中和抗体应答的图，如实施例30所述。[0073]图17:A3-25mAb IgE的轻链(VL)和重链(HL)可变区的氨基酸序列。信号肽-突出显示fDR-斜体并加下划线；恒定区-粗体并加下划线(未显示完整序列)。[0074]图18:显示毒素中和测定中个别毒素A单克隆抗体的滴定的图，其中使用ATP水平(由相对光单位-RLU来定量)作为细胞生存力的指标。与毒素对照(4xEC5Q)相比，mAbA80-29、A65-33、A60-22和A3-25对毒素A具有随浓度提高的中和作用(但对阳性兔抗毒素A对照的水平却不这样)。mAbA50-10、A56-33和A58-46未中和毒素A。只有细胞的对照是 1-L 5x106RLU。[0075]图19:通过BiaCore对毒素B mAb的8个表位的组作图。[0076]图20A-C:毒素A mAb的组合的协同中和活性:将中和抗体A60-22，A65-33，和A80-29的不同稀释液加至浓度增加的A3-25mAb会协同提高毒素A的中和(无论是何稀释)。示出了仅有毒素A(4x EC50)的对照的RLU(〈0.3xl06)，而仅有细胞的对照是2-2.5xl06RLU，如图20B和图20C中所示。[0077]图21:毒素B mAb的组合的协同中和活性:毒素B由mAb8-26、B60_2和B59-3的中和在图21A中示出。毒素B的中和在将B8-26与B59-3的稀释液组合后会协同提高(图21B)。[0078]图22:Western印迹，显示了 RaclGTPase的表达在遗传突变体毒素B(SEQ IDNO: 6)提取物中自24至96小时降低，但在野生型毒素B (SEQ ID NO: 2)处理的提取物中却并不如此。该印迹还显示了，Racl在毒素B-处理的提取物中是葡萄糖基化的，但是在遗传突变体毒素B处理的提取物中却不是。[0079]图23A-K:代表体外细胞毒性测试结果的图，其中将ATP水平(RLU)针对如下作图:浓度提高的难辨梭菌培养基和仓鼠血清库(□);来自各菌株和仓鼠血清库的粗制毒素(培养收获物)(.)；纯化的毒素(得自List Biologicals的市售毒素)和仓鼠血清库(▲);粗制毒素(▼)，对照；和纯化的毒素(?)，对照。将来自各菌株的毒素以4xEC5Q值加至细胞。图23显示了，包括突变体TcdA(SEQ ID NO:4)和突变体TcdB(SEQ ID NO:6)的免疫原性组合物(其中突变体毒素由EDC失活，例如，根据本文所述的实施例29，表15)诱导了中和抗体，所述中和抗体对来自至少如下16种不同CDC菌株的难辨梭菌的毒素展现出中和活性(与各自仅有毒素的对照相比):2007886(图23A) ; 2006017(图23B) ; 2007070 (图23C) ; 2007302 (图 23D) ; 2007838 (图 23E) ; 2007886 (图 23F) ; 2009292 (图 23G) ; 2004013 (图23H);2009141(图 231);2005022(图 23J);2006376(图 23K)。[0080]图24:说明了突变体难辨梭菌毒素的示例性EDC/NHS失活，导致了至少三种可能类型的修饰:交联、甘氨酸加合物、和丙氨酸加合物。A部分说明了交联。三重突变体毒素的羧酸残基通过加成EDC和NHS而激活。激活的酯与伯胺反应以形成稳定的酰胺键，导致了分子内和分子间的交联。B部分说明了甘氨酸加合物的形成。失活之后，通过加成甘氨酸形成稳定的酰胺键而使残余的激活酯猝灭。C部分说明了 β-丙氨酸加合物的形成。3摩尔的NHS能够与I摩尔的EDC反应以形成激活的β -丙氨酸。这继而与伯胺反应形成稳定的酰胺键。
[0081]图25:说明了示例性的突变体难辨梭菌毒素EDC/NHS失活，导致至少一种如下类型的修饰:(A)交联，(B)甘氨酸加合物，和(C) β-丙氨酸加合物。
[0082]序列简述
[0083]SEQ ID NO:1示出了野生型难辨梭菌630毒素A(TcdA)的氨基酸序列。
[0084]SEQ ID NO: 2示出了野生型难辨梭菌630毒素B (TcdB)的氨基酸序列。
[0085]SEQ ID Ν0:3示出了与SEQ ID NO:1相比在位置285和287具有突变的突变体TcdA的氨基酸序列。
[0086]SEQ ID NO: 4示出了与SEQ ID NO:1相比在位置285，287和700具有突变的突变体TcdA的氨基酸序列。
[0087]SEQ ID NO:5示出了与SEQ ID NO:2相比在位置286和288具有突变的突变体TcdB的氨基酸序列。
[0088]SEQ ID NO: 6示出了与SEQ ID NO: 2相比在位置286，288和698具有突变的突变体TcdB的氨基酸序列。
[0089]SEQ ID NO: 7 示出了与 SEQ ID NO:1 相比在位置 269，272，285，287，460，462和 700具有突变的突变体TcdA的氨 基酸序列。
[0090]SEQ ID NO: 8 示出了与 SEQ ID NO: 2相比在位置 270，273，286，288，461，463和 698具有突变的突变体TcdB的氨基酸序列。
[0091]SEQ ID NO:9示出了编码野生型难辨梭菌630毒素A(TcdA)的DNA序列。
[0092]SEQ ID NO: 10示出了编码野生型难辨梭菌630毒素B(TcdB)的DNA序列。
[0093]SEQ ID NO: 11 示出了编码 SEQ ID NO: 3 的 DNA 序列。
[0094]SEQ ID NO: 12 示出了编码 SEQ ID NO: 4 的 DNA 序列。
[0095]SEQ ID NO: 13 示出了编码 SEQ ID Ν0:5 的 DNA 序列。
[0096]SEQ ID NO: 14 示出了编码 SEQ ID Ν0:6 的 DNA 序列。
[0097]SEQ ID NO: 15示出了野生型难辨梭菌R20291TcdA的氨基酸序列。
[0098]SEQ ID NO: 16 示出了编码 SEQ ID NO: 15 的 DNA 序列。
[0099]SEQ ID NO: 17示出了野生型难辨梭菌CD196TcdA的氨基酸序列。
[0100]SEQ ID NO: 18 示出了编码 SEQ ID NO: 17 的 DNA 序列。
[0101]SEQ ID NO: 19示出了野生型难辨梭菌VPI10463TcdA的氨基酸序列。
[0102]SEQ ID NO: 20 示出了编码 SEQ ID NO: 19 的 DNA 序列。
[0103]SEQ ID NO:21示出了野生型难辨梭菌R2029ITcdB的氨基酸序列。
[0104]SEQ ID NO: 22 示出了编码 SEQ ID NO: 21 的 DNA 序列。
[0105]SEQ ID NO:23示出了野生型难辨梭菌CD196TcdB的氨基酸序列。
[0106]SEQ ID NO: 24 示出了编码 SEQ ID NO: 23 的 DNA 序列。
[0107]SEQ ID N0:25示出了野生型难辨梭菌VPI10463TcdB的氨基酸序列。
[0108]SEQ ID NO: 26 示出了编码 SEQ ID NO: 25 的 DNA 序列。
[0109]SEQ ID NO:27示出了野生型难辨梭菌VPI10463的致病性基因座的DNA序列。
[0110]SEQ ID NO: 28 示出了 SEQ ID NO:1 的残基 101-293 的氨基酸序列。
[0111]SEQ ID NO: 29示出了 SEQ ID NO:1的残基1-542的氨基酸序列。[0112]SEQ ID NO:30 示出了 SEQ ID NO:2 的残基 101-293 的氨基酸序列。
[0113]SEQ ID NO:31示出了 SEQ ID NO:2的残基1-543的氨基酸序列。
[0114]SEQ ID NO: 32 示出了 SEQ ID NO:1 的残基 543-809 的氨基酸序列。
[0115]SEQ ID NO:33 示出了 SEQ ID NO:2 的残基 544-767 的氨基酸序列。
[0116]SEQ ID N0:34示出了突变体TcdA的氨基酸序列，其中残基101，269，272，285，287,460,462, 541, 542, 543, 589,655, 700 可为任意氨基酸。 [0117]SEQ ID N0:35 示出了突变体 TcdB 的氨基酸序列，其中 102，270，273，286，288，384，461，463，520，543，544，587，600，653，698 和 751 可为任意氨基酸。
[0118]SEQ ID N0:36示出了难辨梭菌TcdA(A3-25mAb)的中和抗体的可变轻链的氨基酸序列。
[0119]SEQ ID N0:37示出了难辨梭菌TcdA(A3-25mAb)的中和抗体的可变重链的氨基酸序列。
[0120]SEQ ID勵:38示出了难辨梭菌1^(^(43-2511^)的中和抗体的可变轻链的CDRl的
氨基酸序列。
[0121]SEQ ID勵:39示出了难辨梭菌1^(^(43-2511^13)的中和抗体的可变轻链的CDR2的
氨基酸序列。.[0122]SEQ ID NO: 40示出了难辨梭菌TcdA (A3_25mAb)的中和抗体的可变轻链的CDR3的
氨基酸序列。
[0123]SEQ ID N0:41示出了难辨梭菌TcdA(A3_25mAb)的中和抗体的可变重链的CDRl的
氨基酸序列。
[0124]SEQ ID NO: 42示出了难辨梭菌TcdA (A3_25mAb)的中和抗体的可变重链的CDR2的
氨基酸序列。
[0125]SEQ ID NO: 43示出了难辨梭菌TcdA (A3_25mAb)的中和抗体的可变重链的CDR3的
氨基酸序列。
[0126]SEQ ID NO: 44 示出了编码 SEQ ID NO: 3 的 DNA 序列。
[0127]SEQ ID NO: 45 示出了编码 SEQ ID NO: 4 的 DNA 序列。
[0128]SEQ ID NO: 46 示出了编码 SEQ ID NO: 5 的 DNA 序列。
[0129]SEQ ID NO: 47 示出了编码 SEQ ID NO: 6 的 DNA 序列。
[0130]SEQ ID N0:48示出了免疫刺激性寡核苷酸ODN CpG24555的核苷酸序列。
[0131]SEQ ID NO:49示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B8_26mAb)的可变重链的氨基酸序列。
[0132]SEQ ID NO: 50示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B8_26mAb)可变重链的信号肽的氨
基酸序列。
[0133]SEQ ID NO:51示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B8_26mAb)可变重链的CDRl的氨
基酸序列。
[0134]SEQ ID NO:52示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B8_26mAb)可变重链的CDR2的氨
基酸序列。
[0135]SEQ ID NO:53示出了辨梭菌TcdB中和抗体(B8_26mAb)可变重链的CDR3的氨基
酸序列。[0136]SEQID NO: 54示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B8_26mAb)可变重链的恒定区的氨
基酸序列。
[0137]SEQID NO: 55示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B8_26mAb)可变轻链的氨基酸序列。
[0138]SEQID NO: 56示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B8_26mAb)可变轻链的信号肽的氨
基酸序列。
[0139]SEQID NO:57示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B8_26mAb)可变轻链的CDRl的氨
基酸序列。
[0140]SEQID NO:58示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B8_26mAb)可变轻链的CDR2的氨
基酸序列。
[0141]SEQID NO:59示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B8_26mAb)可变轻链的CDR3的氨
基酸序列。
[0142]SEQID NO:60示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B59_3mAb)可变重链的氨基酸序列。
[0143]SEQID NO:61示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B59_3mAb)可变重链的信号肽的氨
基酸序列。
[0144]SEQID NO:62示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B59_3mAb)可变重链的CDRl的氨
基酸序列。
[0145]SEQID NO:63示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B59_3mAb)可变重链的CDR2的氨
基酸序列。
[0146]SEQID NO:64示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B59_3mAb)可变重链的CDR3的氨
基酸序列。
[0147]SEQID NO:65示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B59_3mAb)可变重链的恒定区的氨
基酸序列。
[0148]SEQID NO:66示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B59_3mAb)可变轻链的氨基酸序列。
[0149]SEQID NO:67示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B59_3mAb)可变轻链的信号肽的氨
基酸序列。
[0150]SEQID NO:68示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B59_3mAb)可变轻链的CDRl的氨
基酸序列。
[0151]SEQID NO:69示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B59_3mAb)可变轻链的CDR2的氨
基酸序列。
[0152]SEQID NO:70示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B59_3mAb)可变轻链的CDR3的氨
基酸序列。
[0153]SEQID NO: 71示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B9_30mAb)可变重链的氨基酸序列。
[0154]SEQID NO: 72示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B9_30mAb)可变重链的信号肽的氨
基酸序列。
[0155]SEQID NO:73示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B9_30mAb)可变重链的CDRl的氨基酸序列。
[0156]SEQ ID NO:74示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B9_30mAb)可变重链的CDR2的氨
基酸序列。
[0157]SEQ ID NO:75示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B9_30mAb)可变重链的CDR3的氨
基酸序列。
[0158]SEQ ID NO: 76示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B9_30mAb)可变重链的恒定区的氨
基酸序列。
[0159]SEQ ID NO: 77示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B9_30mAb)可变轻链的氨基酸序列。
[0160]SEQ ID NO: 78示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B9-30mAb)可变轻链的信号肽的氨
基酸序列。
[0161]SEQ ID NO:79示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B9_30mAb)可变轻链的CDRl的氨
基酸序列。
[0162]SEQ ID NO:80示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B9_30mAb)可变轻链的CDR2的氨
基酸序列。
`[0163]SEQ ID N0:81示出了难辨梭菌TcdB中和抗体(B9_30mAb)可变轻链的CDR3的氨
基酸序列。
[0164]SEQ ID N0:82示出了突变体TcdB的氨基酸序列，其中位置102，270，273，286，288，384，461，463，520，543，544，587，600，653，698 和 751 处的残基可以是任意氨基酸。
[0165]SEQ ID NO: 83 示出了与 SEQ ID NO:1 相比，在位置 269，272，285，287，460，462 和700处具有突变的突变体TcdA的氨基酸序列，其中位置I处的甲硫氨酸缺失。
[0166]SEQ ID N0:84示出了与SEQ ID NO:1相比，在位置285，287和700处具有突变的突变体难辨梭菌毒素A的氨基酸序列，其中位置I处的甲硫氨酸缺失。
[0167]SEQ ID N0:85 示出了与 SEQ ID NO: 2 相比，在位置 270，273，286，288，461，463 和698处具有突变的突变体难辨梭菌毒素B的氨基酸序列，其中位置I处的甲硫氨酸缺失。
[0168]SEQ ID NO: 86示出了与SEQ ID NO: 2相比，在位置286，288和698处具有突变的突变体难辨梭菌毒素B的氨基酸序列，其中位置I处的甲硫氨酸缺失。
[0169]SEQ ID NO:87示出了野生型难辨梭菌2004013TcdA的氨基酸序列。
[0170]SEQ ID NO:88示出了野生型难辨梭菌2004111TcdA的氨基酸序列。
[0171]SEQ ID NO:89示出了野生型难辨梭菌2004118TcdA的氨基酸序列。
[0172]SEQ ID NO: 90示出了野生型难辨梭菌2004205TcdA的氨基酸序列。
[0173]SEQ ID NO: 91示出了野生型难辨梭菌2004206TcdA的氨基酸序列。
[0174]SEQ ID NO:92示出了野生型难辨梭菌2005022TcdA的氨基酸序列。
[0175]SEQ ID NO:93示出了野生型难辨梭菌2005088TcdA的氨基酸序列。
[0176]SEQ ID NO:94示出了野生型难辨梭菌2005283TcdA的氨基酸序列。
[0177]SEQ ID NO:95示出了野生型难辨梭菌2005325TcdA的氨基酸序列。
[0178]SEQ ID NO:96示出了野生型难辨梭菌2005359TcdA的氨基酸序列。
[0179]SEQ ID NO:97示出了野生型难辨梭菌2006017TcdA的氨基酸序列。
[0180]SEQ ID NO:98示出了野生型难辨梭菌2007070TcdA的氨基酸序列。[0181]SEQ ID NO:99示出了野生型难辨梭菌2007217TcdA的氨基酸序列。
[0182]SEQ ID NO: 100示出了野生型难辨梭菌2007302TcdA的氨基酸序列。
[0183]SEQ ID NO: 101示出了野生型难辨梭菌2007816TcdA的氨基酸序列。
[0184]SEQ ID NO: 102示出了野生型难辨梭菌2007838TcdA的氨基酸序列。
[0185]SEQ ID NO: 103示出了野生型难辨梭菌2007858TcdA的氨基酸序列。
[0186]SEQ ID NO: 104示出了野生型难辨梭菌2007886TcdA的氨基酸序列。
[0187]SEQ ID NO: 105示出了野生型难辨梭菌2008222TcdA的氨基酸序列。
[0188]SEQ ID NO: 106示出了野生型难辨梭菌2009078TcdA的氨基酸序列。
[0189]SEQ ID NO: 107示出了野生型难辨梭菌2009087TcdA的氨基酸序列。
[0190]SEQ ID NO: 108示出了野生型难辨梭菌2009141TcdA的氨基酸序列。
[0191]SEQ ID NO: 109示出了野生型难辨梭菌2009292TcdA的氨基酸序列。
[0192]SEQ ID NO: 110示出了野生型难辨梭菌2004013TcdB的氨基酸序列。
[0193]SEQ ID NO: 111示出了野生型难辨梭菌2004111TcdB的氨基酸序列。
[0194]SEQ ID NO: 112示出了野生型难辨梭菌2004118TcdB的氨基酸序列。
[0195]SEQ ID NO: 113示出了野生型难辨梭菌2004205TcdB的氨基酸序列。
[0196]SEQ ID NO: 114示出了野生型难辨梭菌2004206TcdB的氨基酸序列。
[0197]SEQ ID NO: 115示出了野生型难辨梭菌2005022TcdB的氨基酸序列。
[0198]SEQ ID NO: 116示出了野生型难辨梭菌2005088TcdB的氨基酸序列。
[0199]SEQ ID NO: 117示出了野生型难辨梭菌2005283TcdB的氨基酸序列。
[0200]SEQ ID NO: 118示出了野生型难辨梭菌2005325TcdB的氨基酸序列。
[0201]SEQ ID NO: 119示出了野生型难辨梭菌2005359TcdB的氨基酸序列。
[0202]SEQ ID NO: 120示出了野生型难辨梭菌2006017TcdB的氨基酸序列。
[0203]SEQ ID NO: 121示出了野生型难辨梭菌2006376TcdB的氨基酸序列。
[0204]SEQ ID NO: 122示出了野生型难辨梭菌2007070TcdB的氨基酸序列。
[0205]SEQ ID NO: 123示出了野生型难辨梭菌2007217TcdB的氨基酸序列。
[0206]SEQ ID NO: 124示出了野生型难辨梭菌2007302TcdB的氨基酸序列。
[0207]SEQ ID NO: 125示出了野生型难辨梭菌2007816TcdB的氨基酸序列。
[0208]SEQ ID NO: 126示出了野生型难辨梭菌2007838TcdB的氨基酸序列。
[0209]SEQ ID NO: 127示出了野生型难辨梭菌2007858TcdB的氨基酸序列。
[0210]SEQ ID NO: 128示出了野生型难辨梭菌2007886TcdB的氨基酸序列。
[0211]SEQ ID NO: 129示出了野生型难辨梭菌2008222TcdB的氨基酸序列。
[0212]SEQ ID NO: 130示出了野生型难辨梭菌2009078TcdB的氨基酸序列。
[0213]SEQ ID NO: 131示出了野生型难辨梭菌2009087TcdB的氨基酸序列。
[0214]SEQ ID NO: 132示出了野生型难辨梭菌2009141TcdB的氨基酸序列。
[0215]SEQ ID NO: 133示出了野生型难辨梭菌2009292TcdB的氨基酸序列。
[0216]SEQ ID NO: 134示出了野生型难辨梭菌OHTcdA的氨基酸序列。
[0217]SEQ ID NO: 135示出了野生型难辨梭菌015TcdA的氨基酸序列。
[0218]SEQ ID NO: 136示出了野生型难辨梭菌020TcdA的氨基酸序列。
[0219]SEQ ID NO: 137示出了野生型难辨梭菌023TcdA的氨基酸序列。[0220]SEQIDNO: 138示出了野生型难辨梭菌027TcdA的氨基酸序列。
[0221]SEQIDNO: 139示出了野生型难辨梭菌029TcdA的氨基酸序列。
[0222]SEQIDNO: 140示出了野生型难辨梭菌046TcdA的氨基酸序列。
[0223]SEQIDNO: 141示出了野生型难辨梭菌OHTcdB的氨基酸序列。
[0224]SEQIDNO: 142示出了野生型难辨梭菌015TcdB的氨基酸序列。
[0225]SEQIDNO: 143示出了野生型难辨梭菌020TcdB的氨基酸序列。
[0226]SEQIDNO: 144示出了野生型难辨梭菌023TcdB的氨基酸序列。
[0227]SEQIDNO: 145示出了野生型难辨梭菌027TcdB的氨基酸序列。
[0228]SEQIDNO: 146示出了野生型难辨梭菌029TcdB的氨基酸序列。
[0229]SEQIDNO: 147示出了野生型难辨梭菌046TcdB的氨基酸序列。
[0230]SEQIDNO: 148示出了野生型难辨梭菌OOlTcdA的氨基酸序列。
[0231]SEQIDNO: 149示出了野生型难辨梭菌002TcdA的氨基酸序列。
[0232]SEQIDNO: 150示出了野生型难辨梭菌003TcdA的氨基酸序列。
[0233]SEQIDNO: 151示出了野生型难辨梭菌004TcdA的氨基酸序列。
[0234]SEQIDNO: 152示出了野生型难辨梭菌070TcdA的氨基酸序列。
[0235]SEQIDNO: 153示出了野生型难辨梭菌075TcdA的氨基酸序列。
[0236]SEQIDNO: 154示出了野生型难辨梭菌077TcdA的氨基酸序列。
[0237]SEQIDNO: 155示出了野生型难辨梭菌081TcdA的氨基酸序列。
[0238]SEQIDNO: 156示出了野生型难辨梭菌117TcdA的氨基酸序列。
[0239]SEQIDNO: 157示出了野生型难辨梭菌131TcdA的氨基酸序列。
[0240]SEQIDNO: 158示出了野生型难辨梭菌OOlTcdB的氨基酸序列。
[0241]SEQIDNO: 159示出了野生型难辨梭菌002TcdB的氨基酸序列。
[0242]SEQIDNO: 160示出了野生型难辨梭菌003TcdB的氨基酸序列。
[0243]SEQIDNO: 161示出了野生型难辨梭菌004TcdB的氨基酸序列。
[0244]SEQIDNO: 162示出了野生型难辨梭菌070TcdB的氨基酸序列。
[0245]SEQIDNO: 163示出了野生型难辨梭菌075TcdB的氨基酸序列。
[0246]SEQIDNO: 164示出了野生型难辨梭菌077TcdB的氨基酸序列。
[0247]SEQIDNO: 165示出了野生型难辨梭菌08ITcdB的氨基酸序列。
[0248]SEQIDNO: 166示出了野生型难辨梭菌117TcdB的氨基酸序列。
[0249]SEQIDNO: 167示出了野生型难辨梭菌131TcdB的氨基酸序列。
[0250]SEQIDNO: 168示出了野生型难辨梭菌053TcdA的氨基酸序列。
[0251]SEQIDNO: 169示出了野生型难辨梭菌078TcdA的氨基酸序列。
[0252]SEQIDNO: 170示出了野生型难辨梭菌087TcdA的氨基酸序列。
[0253]SEQIDNO: 171示出了野生型难辨梭菌095TcdA的氨基酸序列。
[0254]SEQIDNO: 172示出了野生型难辨梭菌126TcdA的氨基酸序列。
[0255]SEQIDNO: 173示出了野生型难辨梭菌053TcdB的氨基酸序列。
[0256]SEQIDNO: 174示出了野生型难辨梭菌078TcdB的氨基酸序列。
[0257]SEQIDNO: 175示出了野生型难辨梭菌087TcdB的氨基酸序列。
[0258]SEQIDNO: 176示出了野生型难辨梭菌095TcdB的氨基酸序列 。[0259]SEQ ID NO: 177示出了野生型难辨梭菌126TcdB的氨基酸序列。
[0260]发明详述
[0261]本发明人令人吃惊地发现了(与其它事项一起)突变体难辨梭菌毒素A和毒素B，以及其方法。所述突变体部分特征在于，其是免疫原性的并且与各自的毒素野生型的形式相比展现出降低的细胞毒性。本发明还涉及其免疫原性部分、其生物学等价物、和包含编码任何前述物质的核酸序列的分离的多核苷酸。
[0262]本文所述的免疫原性组合物出乎意料的证实了引发针对难辨梭菌毒素的新型中和抗体的能力，并且其可具有赋予针对难辨梭菌攻击的主动和/或被动防护的能力。所述新型的抗体针对毒素A和毒素B的各种表位。本发明人还发现至少两种中和性单克隆抗体的组合能够在毒素A和毒素B各自的体外中和中展现出乎意料的协同效应。
[0263]与未施用本文所述的本发明组合物的哺乳动物相比，所述组合物可用于对哺乳动物中的难辨梭菌感染、难辨梭菌相关疾病(CDAD)、综合征、病况、症状、和/或其并发症进行治疗、预防、降低其风险、降低其发生、降低其严重性、和/或延迟其发病。
[0264]另外，本发明人发现了能够稳定表达突变体难辨梭菌毒素A和毒素B的重组的不产孢子难辨梭菌细胞，以及用于产生其的方法。
[0265]免疫原性组合物
[0266]在一方面，本 发明涉及免疫原性组合物，其包括突变体难辨梭菌毒素。所述突变体难辨梭菌毒素包括氨基酸序列，其相对于相应的野生型难辨梭菌毒素具有葡萄糖基转移酶结构域中的至少一个突变以及半胱氨酸蛋白酶结构域中的至少一个突变。
[0267]本文所用的术语“野生型”指的是自然界中发现的形式。例如，野生型多肽或多核苷酸序列是存在于生物体中的序列，该生物体可以分离自自然界中的来源并且未被人为操作有意地修饰。本发明还涉及分离的多核苷酸，其包含编码任何上述多肽的核酸序列。另外，本发明涉及任何上述组合物在治疗、预防哺乳动物的难辨梭菌感染、难辨梭菌相关疾病、综合征、疾病状况、症状和/或并发症，与未给药所述组合物的哺乳动物相比降低其风险，降低其严重性，减少其发病率和/或延缓其发生的用途，以及用于制备所述组合物的方法。
[0268]本文所用的“免疫原性组合物”或“免疫原”指在给药组合物的哺乳动物中引起免疫应答的组合物。
[0269]“免疫应答”指在受体患者中发展针对难辨梭菌毒素的有益的体液(抗体介导的)和/或细胞(抗原特异性T细胞或其分泌产物)应答。免疫应答可以是体液的、细胞的或者这两者。
[0270]免疫应答可以是给药免疫原性组合物、免疫原诱导的主动应答。或者，免疫应答可以是给药抗体或致敏T细胞诱导的被动应答。
[0271]体液(抗体介导的)免疫应答的存在可以通过例如本领域已知的基于细胞的测定如中和抗体测定、ELISA等来确定。
[0272]细胞免疫应答通常由与I类或II类MHC分子相关的多肽表位的呈递引起以激活抗原特异性CD4+T辅助细胞和/或CD8+细胞毒性T细胞。应答还可以涉及单核细胞、巨噬细胞、NK细胞、嗜碱粒细胞、树状细胞、星形细胞、小胶质细胞、嗜酸粒细胞或自然免疫的其他组分的活化。细胞介导的免疫应答的存在可以通过本领域已知的增殖测定(CD4+T细胞)或CTL (细胞毒性T淋巴细胞)来确定。
[0273]在一个实施方案中，免疫原性组合物为疫苗组合物。本文所用的“疫苗组合物”是引起给药所述组合物的哺乳动物的免疫应答的组合物。疫苗组合物可以保护被免疫的哺乳动物对抗免疫性物质或免疫交叉反应性物质随后的攻击。与相同条件下的未免疫的哺乳动物相比，对于症状或感染的减少，保护可以是完全或部分的。
[0274]本文所述的免疫原性组合物是交叉反应性的,这表示具有能够引起针对与组合物所来源的菌株不同的另一难辨梭菌菌株产生的毒素的有效免疫应答(例如，体液免疫应答)。例如，本文所述的免疫原性组合物(例如，源自难辨梭菌630)可以引起能够结合难辨梭菌的多种菌株产生的毒素(例如，难辨梭菌R20291和VPI10463产生的毒素)的交叉反应性抗体。参见，例如实施例37。交叉反应性指示细菌免疫原的交叉保护潜力，并且反之亦然。
[0275]本文所用的术语“交叉保护”指免疫原性组合物诱导的免疫应答预防或减弱不同细菌菌株或相同属的物种引起的感染的能力。例如，本文所述的免疫原性组合物(例如，源自难辨梭菌630)可以在哺乳动物中诱导有效的免疫应答以减弱哺乳动物中除了 630以外的菌株(例如，难辨梭菌R20291)引起的难辨梭菌感染和/或减弱哺乳动物中除了 630以外的菌株(例如，难辨梭菌R20291)引起的难辨梭菌疾病。
[0276]免疫原性组合物或免疫原引起免疫应答的示例性哺乳动物包括任何哺乳动物，例如小鼠、仓鼠、灵长类和人。在优选的实施方案中，免疫原性组合物或免疫原在给药所述组合物的人中引起免疫应答。
[0277]如上文所述 ，毒素A (TcdA)和毒素B (TcdB)是同源葡萄糖基转移酶，其失活Rho/Rac/Ras家族的小GTP酶。TcdA和TcdB对哺乳动物靶细胞的作用取决于受体介导的内吞作用、膜易位、自体蛋白水解加工和GTP酶的单糖基化的多步机制。许多这些功能活性已经归因于毒素的一级序列中的分离区域，并且已经进行了毒素的成像以显示这些分子在结构上是相似的。
[0278]TcdA的野生型基因具有约8130个核苷酸，其编码具有约2710氨基酸的约308-kDa的减少分子量的蛋白。如本文所用，野生型难辨梭菌TcdA包括来自任何野生型难辨梭菌菌株的难辨梭菌TcdA。野生型难辨梭菌TcdA可以包括这样的野生型难辨梭菌TcdA氨基酸序列，当最优比对时，例如通过使用预定间隙重(gap weight)的程序GAP或BESTFIT时，其与SEQ ID NO:1 (全长)具有至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%，优选约98%，更优选约99%或者最优选约100%的相同性。
[0279]在优选的实施方案中，野生型难辨梭菌TcdA包含SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，其描述来自难辨梭菌菌株630的TcdA的野生型氨基酸序列(也公开为GenBank登录号YP_001087137.1和/或CAJ67494.1)。难辨梭菌菌株630在本领域中已知为PCR-核糖核酸型012菌株。SEQ ID Ν0:9描述来自难辨梭菌菌株630的TcdA的野生型基因，其也公开为 GenBank 登录号 NC_009089.1。
[0280]野生型难辨梭菌TcdA的另一实例包含SEQ ID NO: 15所示的氨基酸序列，其描述来自难辨梭菌菌株R20291的TcdA的野生型氨基酸序列(也公开为GenBank登录号YP_003217088.1)。难辨梭菌菌株R20291在本领域中已知为高毒性菌株和PCR-核糖核酸型027菌株。来自难辨梭菌菌株R20291的TcdA的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有约98%的相同性。SEQ ID NO: 16描述来自难辨梭菌菌株R20291的野生型基因，其也公开为GenBank登录号 NC_013316.1。
[0281]野生型难辨梭菌TcdA的另一实例包含SEQ ID NO: 17所示的氨基酸序列，其描述来自难辨梭菌菌株CD196的TcdA的野生型氨基酸序列(也公开为GenBank登录号CBA61156.1)。⑶196是来自最近的加拿大爆发的菌株，并且在本领域中已知为PCR-核糖核酸型027菌株。来自难辨梭菌菌株⑶196的TcdA的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有约98%的相同性，并且与来自难辨梭菌菌株R20291的TcdA具有约100%的相同性。SEQ IDNO: 18描述来自难辨梭菌菌株⑶196的TcdA的野生型基因，其也公开为GenBank登录号FN538970.1。
[0282]野生型难辨梭菌TcdA的氨基酸序列的另外的实例包括SEQ ID N0:19，其描述来自难辨梭菌菌株VPI10463的TcdA的野生型氨基酸序列(也公开为GenBank登录号CAA63564.1)。来自难辨梭菌菌株VPI10463的TcdA的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有约100%(99.8%)的相同性。SEQ ID NO: 20描述来自难辨梭菌菌株VPI10463的TcdA的野生型基因，其也公开为GenBank登录号X92982.1。
[0283]野生型难辨梭菌TcdA的另外实例包括来自野生型难辨梭菌菌株的TcdA，其可获得自疾病控制与预防中心(CDC，Atlanta，GA)。本发明人发现，当最优比对时，来自可获得自CDC的野生型难辨梭菌菌株的TcdA的氨基酸序列与SEQ ID NO:1 (来自难辨梭菌630的TcdA)的氨基酸残基1-821具有至少约99.3%-100%的相同性。参见表1。
[0284]本发明人还发现，当最优比对时(例如，最优比对全长序列时)，来自野生型难辨梭菌菌株的TcdA的氨基酸序列可以包含与SEQ ID NO:1至少约90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99% 至约 100% 的相同性。
[0285]表1:获得自⑶C的野生型难辨梭菌菌株以及最优比对时来自各种野生型难辨梭菌菌株的TcdA的氨基酸残基1-821与S`EQ ID NO:1的氨基酸残基1_821的百分比相同性
【权利要求】
1.包含SEQID N0:4所示氨基酸序列的分离的多肽，其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在，并且其中所述多肽包含至少一个经1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺)(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学修饰的氨基酸侧链。
2.包含SEQID N0:6所示氨基酸序列的分离的多肽，其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在，并且其中所述多肽包含经1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳二亚胺)(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学修饰的氨基酸侧链。
3.权利要求1或2的分离的多肽，其中所述多肽的至少一个天冬氨酸残基侧链或所述多肽的至少一个谷氨酸残基侧链是经甘氨酸化学修饰的。
4.权利要求1-3中任一项的分离的多肽，其中所述多肽包含: a)所述多肽的天冬氨酸残基侧链和所述多肽的赖氨酸残基侧链之间的至少一个交联；和 b)所述多肽的谷氨酸残基侧链和所述多肽的赖氨酸残基侧链之间的至少一个交联。
5.权利要求1-4中任一项的分离的多肽，其中所述多肽包含连接至所述多肽的至少一个赖氨酸残基侧链的丙氨酸部分。
6.权利要求4的分离的多肽，其中所述多肽包含连接至所述多肽的天冬氨酸残基侧链或连接至所述多肽的谷氨酸残基侧链的甘氨酸部分。
7.包含SEQID Ν0:4所示氨基酸序列的分离的多肽，其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在，并且其中所述多肽的至少一个赖氨酸残基侧链连接丙氨酸部分。
8.包含SEQID Ν0:6所示氨基酸序列的分离的多肽，其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在，并且其中所述多肽的至少一个赖氨酸残基侧链连接丙氨酸部分。`
9.权利要求7或8的分离的多肽，其中所述多肽的第二个赖氨酸残基的侧链连接天冬氨酸残基侧链或连接谷氨酸残基侧链。
10.权利要求7-9中任一项的分离的多肽，其中所述多肽的天冬氨酸残基侧链或者谷氨酸残基侧链连接甘氨酸部分。
11.权利要求1-10中任一项的分离的多肽，其中所述多肽具有至少大约ΙΟΟμg/ml的EC500
12.免疫原性组合物，其包含: 具有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的分离的多肽，其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在，和 具有SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的分离的多肽，其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在， 并且其中所述多肽具有至少一个经1-乙基-3-(3- 二甲基氨丙基)碳二亚胺)(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)化学修饰的氨基酸侧链。
13.权利要求12的免疫原性组合物，其中所述多肽包含下列任意的至少一个: a)连接至所述多肽赖氨酸侧链的至少一个丙氨酸部分； b)天冬氨酸残基侧链和所述多肽的赖氨酸残基侧链之间的至少一个交联；和 c)谷氨酸残基侧链和所述多肽的赖氨酸残基侧链之间的至少一个交联。
14.权利要求12的免疫原性组合物，其中所述多肽具有至少大约ΙΟΟμg/ml的EC5(I。
15.免疫原性组合物，其包含:具有SEQ ID N0:4所示氨基酸序列的分离的多肽，其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在，和 具有SEQ ID N0:6所示氨基酸序列的分离的多肽，其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在，并且 a)其中SEQ ID NO:4的至少一个赖氨酸残基侧链连接β _丙氨酸部分，和 b)其中SEQ ID NO:6的至少一个赖氨酸残基侧链连接丙氨酸部分。
16.权利要求15的免疫原性组合物，其中SEQID NO:4的第二个赖氨酸残基侧链连接天冬氨酸残基侧链或连接谷氨酸残基侧链，并且其中SEQ ID NO:6的第二个赖氨酸残基连接天冬氨酸残基侧链或连接谷氨酸残基侧链。
17.权利要求12-16中任一项的免疫原性组合物，其中所述多肽的天冬氨酸残基侧链或者谷氨酸残基侧链连接甘氨酸部分， 其中所述多肽具有SEQ ID Ν0:4所示的氨基酸序列，其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在。
18.权利要求12-16中任一项的免疫原性组合物，其中所述多肽的天冬氨酸残基侧链或者谷氨酸残基侧链连接甘氨酸部分， 其中所述多肽具有SEQ ID Ν0:6所示的氨基酸序列，其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在。
19.权利要求12-18中任一项的免疫原性组合物，其中所述多肽具有至少大约100 μ g/ml 的 EC50。
20.免疫原性组合物，其包含具有SEQID N0:84所示的氨基酸序列的分离的多肽和具有SEQ ID NO:86所示的氨基酸序列的分离的多肽，其中每个多肽包含: a)所述多肽的天冬氨酸残基侧链和所述多肽的赖氨酸残基侧链之间的至少一个交联； b)所述多肽的谷氨酸残基侧链和所述多肽的赖氨酸残基侧链之间的至少一个交联； c)连接至所述多肽的至少一个赖氨酸残基侧链的β-丙氨酸部分；和 d)连接至所述多肽的至少一个天冬氨酸残基侧链或所述多肽的至少一个谷氨酸残基侧链的甘氨酸部分。
21.免疫原性组合物，其包含突变体难辨梭菌毒素A，相对于相应的野生型难辨梭菌毒素A，所述突变体难辨梭菌毒素A包含具有至少一个突变的葡萄糖基转移酶结构域和具有至少一个突变的半胱氨酸蛋白酶结构域。
22.权利要求O的组合物，其中所述突变是非保守氨基酸取代。
23.权利要求22的组合物，其中所述取代包含丙氨酸取代。
24.权利要求21-23中任一项的组合物，其中所述野生型难辨梭菌毒素A包含与SEQID NO:1具有至少95%相同性的序列。
25.权利要求24的组合物，其中所述野生型难辨梭菌毒素A包含与SEQID NO:1具有至少98%相同性的序列。
26.权利要求25的组合物，其中所述野生型难辨梭菌毒素A包含SEQID NO:1。
27.权利要求21-26中任一项的组合物，其中所述葡萄糖基转移酶结构域包含至少两个突变。
28.权利要求27的组合物，其中根据SEQID NO:1的编号，所述至少两个突变存在于氨基酸位置 101、269、272、285、287、269、272、460、462、541 或 542。
29.权利要求21-26中任一项的组合物，其中所述葡萄糖基转移酶结构域包含SEQIDN0:29。
30.权利要求29的组合物，其中所述葡萄糖基转移酶结构域包含至少两个非保守突变，所述非保守突变存在于SEQ ID NO:29的氨基酸位置101、269、272、285、287、269、272、460、462、541、或542、或者其任意组合。
31.权利要求21-26中任一项的组合物，其中根据SEQID NO:1的编号，所述半胱氨酸蛋白酶结构域包含存在于位置700、589、655、543、或其任意组合的突变。
32.权利要求21-26中任一项的组合物，其中所述半胱氨酸蛋白酶结构域包含SEQIDNO:32。
33.权利要求32的组合物，其中所述半胱氨酸蛋白酶结构域包含非保守突变，所述非保守突变存在于SEQ ID NO:32的位置1、47、113、158、或其任意组合。
34.权利要求21的组合物，其中所述突变体难辨梭菌毒素A包含SEQID N0:4。
35.权利要求21的组合物，其中所述突变体难辨梭菌毒素A包含SEQID N0:84。
36.权利要求21的组合物，其中所述突变体难辨梭菌毒素A包含SEQID NO: 7。
37.权利要求21的组合 物，其中所述突变体难辨梭菌毒素A包含SEQID NO:83。
38.权利要求21-33中任一项的组合物，其中所述突变体难辨梭菌毒素A的至少一个氨基酸是化学交联的。
39.权利要求38的组合物，其中所述氨基酸是通过甲醛化学交联的。
40.权利要求38的组合物，其中所述氨基酸是通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺化学交联的。
41.权利要求38或40的组合物，其中所述氨基酸是通过N-羟基琥珀酰亚胺化学交联的。
42.权利要求21-41中任一项的组合物，其中所述组合物被抗毒素A中和抗体或其结合片段所识别。
43.免疫原性组合物，其包含突变体难辨梭菌毒素A，相对于相应的野生型难辨梭菌毒素A，所述突变体难辨梭菌毒素A包含: 葡萄糖基转移酶结构域，其包含在位置285和287具有氨基酸取代的SEQ ID NO:29,和 半胱氨酸蛋白酶结构域，其包含在位置158具有氨基酸取代的SEQ ID NO:32, 其中所述突变体难辨梭菌毒素A的至少一个氨基酸是化学交联的。
44.免疫原性组合物，其包含SEQID N0:4或SEQ ID NO:7,其中SEQ ID N0:4或SEQID NO:7的至少一个氨基酸是化学交联的。
45.权利要求43或44的组合物，其中所述至少一个氨基酸是通过甲醛交联的。
46.权利要求43或44的组合物，其中所述至少一个氨基酸是通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺交联的。
47.权利要求43、44或46的组合物，其中所述至少一个氨基酸是通过N-羟基琥珀酰亚胺交联的。
48.权利要求43或44的组合物，其中所述组合物被抗毒素A中和抗体或其结合片段所识别。
49.免疫原性组合物，其包含SEQID N0:4。
50.免疫原性组合物，其包含SEQID N0:84。
51.免疫原性组合物，其包含SEQID NO:7。
52.免疫原性组合物，其包含SEQID NO:83。
53.权利要求49-52中任一项的组合物，其中至少一个氨基酸是化学交联的。
54.权利要求21-52中任一项的组合物，其中相对于相应的野生型难辨梭菌毒素A，所述组合物展现出降低的细胞毒性。
55.分离的多肽，其包含SEQID N0:84o
56.分离的多肽，其包含SEQID NO:86。
57.分离的多肽，其包含SEQID N0:83o
58.分离的多肽，其包含SEQID N0:85o
59.免疫原性组合物，其包含突变体难辨梭菌毒素B，相对于相应的野生型难辨梭菌毒素B，所述突变体难辨梭菌毒素B包含具有至少一个突变的葡萄糖基转移酶结构域和具有至少一个突变的半胱氨酸蛋 白酶结构域。
60.权利要求59的组合物，其中所述突变是非保守氨基酸取代。
61.权利要求60的组合物，其中所述取代包含丙氨酸取代。
62.权利要求59-61中任一项的组合物，其中所述野生型难辨梭菌毒素B包含与SEQID NO:2具有至少95%相同性的序列。
63.权利要求62的组合物，其中所述野生型难辨梭菌毒素B包含与SEQID NO: 2具有至少98%相同性的序列。
64.权利要求63的组合物，其中所述野生型难辨梭菌毒素B包含SEQID NO: 2。
65.权利要求59-64中任一项的组合物，其中所述葡萄糖基转移酶结构域包含至少两个突变。
66.权利要求65的组合物，其中根据SEQID NO:2的编号，所述至少两个突变存在于氨基酸位置 102、286、288、270、273、384、461、463、520、或 543。
67.权利要求59-64中任一项的组合物，其中所述葡萄糖基转移酶结构域包含SEQIDNO:31。
68.权利要求67的组合物，其中所述葡萄糖基转移酶结构域包含至少两个非保守突变，所述非保守突变存在于SEQ ID NO:31的氨基酸位置102、286、288、270、273、384、461、463、520、或 543。
69.权利要求59-64中任一项的组合物，其中根据SEQID NO: 2的编号，所述半胱氨酸蛋白酶结构域包含存在于位置698、653、587、544、或其任意组合的突变。
70.权利要求59-64中任一项的组合物，其中所述半胱氨酸蛋白酶结构域包含SEQIDNO:33。
71.权利要求70的组合物，其中所述半胱氨酸蛋白酶结构域包含非保守突变，所述非保守突变存在于SEQ ID NO:33的位置1、44、110、155、或其任意组合。
72.权利要求59的组合物，其中所述突变体难辨梭菌毒素B包含SEQID NO:6。
73.权利要求59的组合物，其中所述突变体难辨梭菌毒素B包含SEQID N0:86。
74.权利要求59的组合物，其中所述突变体难辨梭菌毒素B包含SEQID N0:8。
75.权利要求59的组合物，其中所述突变体难辨梭菌毒素B包含SEQID N0:85。
76.权利要求59-71中任一项的组合物，其中所述突变体难辨梭菌毒素B的至少一个氨基酸是化学交联的。
77.权利要求76的组合物，其中所述氨基酸是通过甲醛化学交联的。
78.权利要求76的组合物，其中所述氨基酸是通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺化学交联的。
79.权利要求76或78的组合物，其中所述至少一个氨基酸是通过N-羟基琥珀酰亚胺化学交联的。
80.权利要求59-79中任一项的组合物，其中所述组合物被抗毒素B中和抗体或其结合片段所识别。
81.免疫原性组合物，其包含突变体难辨梭菌毒素B，相对于相应的野生型难辨梭菌毒素B，所述突变体难辨梭菌毒素B包含:葡萄糖基转移酶结构域，其包含在位置286和288具有氨基酸取代的SEQ ID NO:31,和 半胱氨酸蛋白酶结构域，其包含在位置155具有氨基酸取代的SEQ ID NO:33, 其中所述突变体难辨梭菌毒 素B的至少一个氨基酸是化学交联的。
82.免疫原性组合物，其包含SEQID NO:6或SEQ ID NO:8,其中SEQ ID NO:6或SEQID NO:8的至少一个氨基酸是化学交联的。
83.权利要求81或82的组合物，其中所述至少一个氨基酸是通过甲醛交联的。
84.权利要求81或82的组合物，其中所述至少一个氨基酸是通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺交联的。
85.权利要求81、82、或84的组合物，其中所述至少一个氨基酸是通过N-羟基琥珀酰亚胺交联的。
86.权利要求81或82的组合物，其中所述组合物被抗毒素B中和抗体或其结合片段所识别。
87.免疫原性组合物，其包含SEQID NO:6。
88.免疫原性组合物，其包含SEQID NO:86。
89.免疫原性组合物，其包含SEQID NO:8。
90.免疫原性组合物，其包含SEQID NO:85。
91.权利要求59-89中任一项的组合物，其中相对于相应的野生型难辨梭菌毒素B，所述组合物展现出降低的细胞毒性。
92.包含SEQID NO:4的免疫原性组合物和包含SEQ ID NO:6的免疫原性组合物，其中SEQ ID N0:4和6每个都至少有一个氨基酸是化学交联的。
93.包含SEQID NO:84的免疫原性组合物和包含SEQ ID NO:86的免疫原性组合物，其中SEQ ID N0:84和86每个都至少有一个氨基酸是化学交联的。
94.权利要求92或93的组合物，其中所述至少一个氨基酸是通过甲醛交联的。
95.权利要求92或93的组合物，其中所述至少一个氨基酸是通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺交联的。
96.权利要求92、93、或95的组合物，其中所述至少一个氨基酸是通过N-羟基琥珀酰亚胺交联的。
97.重组细胞或其后代，包含SEQ ID NO: 11、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 13、SEQ IDNO:14、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、或 SEQ ID NO:47。
98.重组细胞或其后代，包含编码SEQID NO: 4,SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 7、或SEQ IDNO:8的核酸序列。
99.重组细胞或其后代，包含编码SEQID N0:84的核酸序列。
100.重组细胞或其后代，包含编码SEQID NO:86的核酸序列。
101.重组细胞或其后代，包含编码SEQID NO:83的核酸序列。
102.重组细胞或其后代，包含编码SEQID NO:85的核酸序列。
103.权利要求97或98的重组细胞，其中所述细胞衍生自革兰氏阳性菌细胞。
104.权利要求97、98或99的重组细胞，其中所述细胞衍生自难辨梭菌细胞。
105.权利要求97-104中任一项的重组细胞，其中所述细胞缺乏编码毒素的内源多核苷酸。
106.权利要求104或105的细胞，其中所述细胞衍生自选自下列的难辨梭菌细胞:难辨梭菌1351、难辨梭菌3232、难辨梭菌7322、难辨梭菌5036、难辨梭菌4811、和难辨梭菌VPI11186。
107.权利要求106的细胞，其中所述细胞是难辨梭菌VPI11186细胞。
108.权利要求106或107的细胞，其中所述难辨梭菌细胞的孢子形成基因是失活的。
109.权利要求108的细胞，其中所述孢子形成基因包括spoOA基因或spoIIE基因。
110.产生突变体难辨梭菌毒素的方法，包括: 在适宜的条件下培养重组细胞或其后代以表达编码突变体难辨梭菌毒素的多核苷酸，其中所述细胞包含所述编码突变体难辨梭菌毒素的多核苷酸，并且其中相对于相应的野生型难辨梭菌毒素，所述突变体包含具有至少一个突变的葡萄糖基转移酶结构域和具有至少一个突变的半胱氨酸蛋白酶结构域。
111.权利要求110的方法，其中所述细胞缺乏编码毒素的内源多核苷酸。
112.权利要求110的方法，其中所述重组细胞或其后代包括权利要求97-111中任一项的细胞。
113.权利要求110的方法，还包括分离突变体难辨梭菌毒素。
114.权利要求113的方法，还包括将分离的突变体难辨梭菌毒素与甲醛接触。
115.权利要求114的方法，其中所述接触发生最多14天。
116.权利要求115的方法，其中所述接触发生最多48小时。
117.权利要求114的方法，其中所述接触在大约25°C发生。
118.权利要求113的方法，还包括将分离的突变体难辨梭菌毒素与乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺接触。
119.权利要求118的方法，其中所述接触发生最多24小时。
120.权利要求120的方法，其中所述接触发生最多4小时。
121.权利要求118的方法，其中所述接触在大约25°C发生。
122.权利要求118的方法，还包括将分离的突变体难辨梭菌毒素与N-羟基琥珀酰亚胺接触。
123.由权利要求110-122中任一项的方法产生的免疫原性组合物。
124.产生针对难辨梭菌毒素A的中和抗体的方法，包括:向哺乳动物施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:4,其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在，其中SEQ ID N0:4的至少一个氨基酸通过甲醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的组合交联，并从所述哺乳动物回收抗体。
125.产生针对难辨梭菌毒素A的中和抗体的方法，包括:向哺乳动物施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:84,其中SEQ ID NO:84的至少一个氨基酸通过甲醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的组合交联，并从所述哺乳动物回收抗体。
126.产生针对难辨梭菌毒素B的中和抗体的方法，包括:向哺乳动物施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO: 6,其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在，其中SEQ ID NO:6的至少一个氨基酸通过甲醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、或1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的组合交联，并从所述哺乳动物回收抗体。
127.产生针对难辨梭菌毒素A的中和抗体的方法，包括:向哺乳动物施用免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含SEQ ID NO:86,其中SEQ ID NO:86的至少一个氨基酸通过甲醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、或1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的组合交联，并从所述哺乳动物回收抗体。
128.特异于免疫原性组合物的抗体或其抗体结合片段，所述免疫原性组合物包含其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在的SEQ ID NO:4,或者其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在的SEQ ID NO:7。
129.权利要求128的抗体或其抗体结合片段，其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在的SEQ ID NO: 4中的至少一个氨基酸、或者位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在的SEQID NO:7中的至少一个氨基酸通过甲醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、或1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的组合交联。
130.抗体或其抗体结合片段，其包含:
SEQ ID NO:41 (CDR HI)、SEQ ID NO:42(CDR H2)和 SEQ ID NO:43(CDR H3)中所示的重链互补决定区(CDR)的氨基酸序列，和
SEQ ID NO: 38 (CDR LI)、SEQ ID NO: 39 (CDR L2)和 SEQ ID NO: 40 (CDR L3)中所示的轻链CDR的氨基酸序列。
131.权利要求128、129、或130的抗体或其抗体结合片段，其中所述抗体或其抗体结合片段包含: 重链，其包含SEQ ID NO:37中所示的氨基酸序列，和 轻链，其包含SEQ ID NO:36中所示的氨基酸序列。
132.包含两种或更多种抗体或其抗体结合片段的组合物，其中所述抗体或其抗体结合片段选自权利要求128-131中的任一项的任意抗体或其抗体结合片段。
133.特异于免疫原性组合物的抗体或其抗体结合片段，所述免疫原性组合物包含:其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在的SEQ ID NO:6,或者其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在的SEQ ID N0:8。
134.权利要求133的抗体或其抗体结合片段，其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在的SEQ ID NO:6中的至少一个氨基酸、或者位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在的SEQID N0:8中的至少一个氨基酸通过甲醛、1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、或1-乙基-3- (3- 二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的组合交联。
135.抗体或其抗体结合片段，其包含:
SEQ ID NO: 51 (CDR HI)、SEQ ID NO:52 (CDR H2)和 SEQ ID NO:53 (CDR H3)中所示的重链互补决定区(CDR)的氨基酸序列，和
SEQ ID NO: 57 (CDR LI)、SEQ ID NO: 58 (CDR L2)和 SEQ ID NO: 59 (CDR L3)中所示的轻链CDR的氨基酸序列。
136.抗体或其抗体结合片段，其包含:
SEQ ID NO: 61 (CDR HI)、SEQ ID NO:62 (CDR H2)和 SEQ ID NO:63 (CDR H3)中所示的重链互补决定区(CDR)的氨基酸序列，和
SEQ ID NO: 68 (CDR LI)、SEQ ID NO: 69 (CDR L2)和 SEQ ID NO: 70 (CDR L3)中所示的轻链CDR的氨基酸序列。
137.抗体或其抗体结合片段，其包含:
SEQ ID NO: 73 (CDR HI)、SEQ ID NO:74 (CDR H2)和 SEQ ID NO:75 (CDR H3)中所示的重链互补决定区(CDR)的氨基酸序列，和
SEQ ID NO: 79 (CDR LI)、SEQ ID NO: 80 (CDR L2)和 SEQ ID NO: 81 (CDR L3)中所示的轻链CDR的氨基酸序列。
138.包含两种或更多种抗体或其抗体结合片段的组合物，其中所述抗体或其抗体结合片段选自权利要求133-137中的任一项。
139.在哺乳动物中治疗难辨梭菌感染的方法，包括向所述哺乳动物施用: 免疫原性组合物，其包含其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在的SEQ ID NO:4,和 免疫原性组合物，其包含其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在的SEQ ID NO:6, 其中SEQ ID N0:4和6每个都至少有一个氨基酸通过甲醛交联。
140.在哺乳动物中治疗难辨梭菌感染的方法，包括向所述哺乳动物施用:免疫原性组合物，其包含其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在的SEQ ID NO:4,和免疫原性组合物，其包含其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在的SEQ ID NO:6,其中SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 6每个都至少有一个氨基酸通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、或者1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的组合交联。
141.在哺乳动物中治疗难辨梭菌感染的方法，包括向所述哺乳动物施用:包含SEQIDNO:84的免疫原性组合物，和包含SEQ ID NO:86的免疫原性组合物，其中SEQ ID NO:84和SEQ ID NO:86每个都至少有一个氨基酸通过1_乙基_3_(3_ 二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺交联。
142.在哺乳动物中诱导对难辨梭菌的免疫应答的方法，包括向所述哺乳动物施用:免疫原性组合物，其包含其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在的SEQ ID NO:4,和 免疫原性组合物，其包含其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在的SEQ ID NO:6, 其中SEQ ID N0:4和SEQ ID N0:6每个都至少有一个氨基酸通过甲醛交联。
143.在哺乳动物中诱导对难辨梭菌的免疫应答的方法，包括向所述哺乳动物施用: 免疫原性组合物，其包含其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在的SEQ ID NO:4,和 免疫原性组合物，其包含其中位置I处的甲硫氨酸残基任选不存在的SEQ ID NO:6, 其中SEQ ID NO: 4和SEQ ID NO: 6每个都至少有一个氨基酸通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、或者1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺的组合交联。
144.在哺乳动物中诱导对难辨梭菌的免疫应答的方法，包括向所述哺乳动物施用:包含SEQ ID NO:84的免疫原性组合物，和包含SEQ ID NO:86的免疫原性组合物，其中SEQID N0:84和SEQ ID NO:86每个都至少有一个氨基酸通过1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺交联。
145.权利要求139-144中任一项的方法，其中所述哺乳动物是对其有需要的哺乳动物。
146.权利要求139-144中任一项的方法，其中所述哺乳动物患有复发的难辨梭菌感染。
147.权利要求139-144中任一项的方法，其中肠胃外施用所述组合物。
148.权利要求139-144中任一项的方法，其中所述组合物还包含佐剂。`
149.权利要求148的方法，其中所述佐剂包含铝。
150.权利要求148的方法，其中所述佐剂包含氢氧化铝凝胶和CpG寡核苷酸。
151.权利要求148的方法，其中所述佐剂包含ISCOMATRIX?。
【文档编号】C07K16/12GK103619871SQ201280030656
【公开日】2014年3月5日 申请日期:2012年4月20日 优先权日:2011年4月22日
【发明者】M·K·希胡, A·S·安德森, R·G·K·唐纳德, K·U·扬森, N·K·卡利安, T·L·米宁尼, J·K·莫兰, M·E·鲁彭, M·J·弗林特 申请人:惠氏有限责任公司