蛋白制剂的制造方法
【专利摘要】本发明提供一种病毒去除蛋白质制剂的制造方法，其包括(a)使用小孔病毒去除膜过滤含病毒的蛋白质溶液，从而得到病毒去除蛋白质溶液的过滤工序，过滤工序(a)包括(q)使用小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下的过滤压力过滤溶液，从而得到病毒去除蛋白质溶液的低压过滤工序，低压过滤工序(q)中的过滤前溶液的pH(X)及盐的离子强度(Y(mM))满足以下的式1及式5：0≤Y≤150X-590(式1)和3.5≤X≤8.0(式5)或者满足以下的式4及式5：Y=0(式4)和3.5≤X≤8.0(式5)。
【专利说明】蛋白制剂的制造方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及病毒去除蛋白质制剂的制造方法以及通过该制造方法制造的病毒去除蛋白质制剂。
【背景技术】
[0002]以生物技术药物、血浆分级分离制剂等为代表的蛋白质制剂，担心混入源自原料或源自工序的病毒。因此，制造这种蛋白质制剂时，制剂中的病毒的灭活、去除从制剂的安全性和稳定性的观点考虑是非常重要的。作为病毒的灭活方法，进行加热处理、利用化学药品进行处理等，但是仅利用这些单独的处理时，病毒的灭活不充分，另外，利用这些方法时，制剂中的蛋白质其本身也有可能变性。由于这种背景，作为不伴随有化学变性的物理性病毒去除手段，通过使用病毒去除膜的过滤来实施病毒的分离去除(例如专利文献I~3
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寸/ ο
[0003]作为病毒去除膜，已知由纤维素等天然原材料形成的膜，或者由聚偏二氟乙烯(PVDF)、聚醚砜(PES)等合成高分子原材料形成的膜(非专利文献I~4)。特别是蛋白质溶液中的蛋白质的分子小时，使用具有病毒不能透过而蛋白质分子能够透过的尺寸的孔径的过滤膜、即小孔病毒去除膜。
[0004]对于利用装填有病毒去除膜的病毒去除装置进行的含病毒的溶液的过滤而言，理想的是，可以在短时间内过滤更多量的蛋白质溶液、并且可以发挥充分高的病毒去除性能。为了短时间内处理更多量的蛋白质溶液，通常含病毒的溶液的过滤尽可能在高压下进行。但是，若连续进行这种高`压下的过滤，则有可能在膜的内部残留应该含有在滤液中的蛋白质。另外，近年存在蛋白质的制剂浓度升高的倾向，随之在用于去除病毒的过滤工序中，提高蛋白质浓度的要求也日益升高。用小孔病毒去除膜过滤高浓度的蛋白质溶液时，特别是由于蛋白质残留于膜的内部所导致的堵塞的产生显著。
[0005]为了回收残留于小孔病毒去除膜的内部的蛋白质，将不含有蛋白质的缓冲液(通常与溶解蛋白质的缓冲液相同)作为洗涤液进行过滤。该工序由于为在过滤蛋白质之后追加进行的过滤，因此被称为后洗漆(Post-wash)、后过滤(Post filtration)。后洗漆时,通常为了将过滤液的入口由蛋白质溶液的管路转换为洗涤液的管路，暂时释放过滤压力。若不降低过滤压力，则液体倒流到洗涤液侧。
[0006]作为与后洗涤工序同样地、利用病毒去除膜过滤时的过滤压力降低的情况，还可列举出由于停电等缘故而在过滤中途暂时中断加压的例子(被称为起止(Stop & Start))。
[0007]另外，根据蛋白质制剂的种类，在制剂的制造中，有时希望用病毒去除膜过滤时的过滤压力低。以低的过滤压力进行过滤，大多在欲增加容易堵塞的溶液的最终处理量的情况，欲增加形状细长的高分子蛋白质溶液的透过率、回收率的情况下实施。关于采用低的过滤压力时的具体的过滤压力，大多兼顾透过性和生产率来确定，也取决于所欲得到的蛋白质制剂的浓度等。例如专利文献4采用0.15kgf/cm2程度的过滤压力。
[0008]现有技术文献[0009]专利文献
[0010]专利文献1:日本特开2001-335509号公报
[0011]专利文献2:日本特开2003-274941号公报
[0012]专利文献3:国际公开2010/109920号公报
[0013]专利文献4:美国专利7932355号公报
[0014]非专利文献
[0015]非专利文献I =Manabe S, Dev.Biol.Stand.，(1996)88:81-90
[0016]非专利文献2 =Brandwein H 等、Dev Biol (Basel).，(2000) 102:157-63
[0017]非专利文献3:Aranha_Creado 等、Biologicals.，(1998) Jun; 26 (2): 167-72
[0018]非专利文献4:L.Moce-Llivina 等、Journal of Virological Methods, (2003) April, Vol.109, Issuel, Pages99_101
【发明内容】
[0019]发明要解决的问题
[0020]迄今，对于使用了病毒去除膜的蛋白质溶液的过滤而言，为了增加处理量、提高效率，尽可能在高压下进行的方 法令人注目，对于低的过滤压力下的过滤，未得到充分的见解。
[0021]基于这种背景，本发明人等对于低过滤压力下的使用了小孔病毒去除膜的蛋白质溶液的过滤独自地进行了研究，结果令人惊讶地发现，在与高过滤压力下同样的溶液条件下实施低过滤压力下的过滤时，根据溶液条件，病毒漏到滤液侧，有可能得到病毒去除率低的蛋白质制剂。上述后洗涤工序、起止工序中，由于在低过滤压力下进行过滤，根据溶液条件，也有可能产生病毒去除率的降低。
[0022]基于上述新的发现，本发明的目的在于，提供包括在低过滤压力下使用小孔病毒去除膜过滤含病毒的蛋白质溶液的工序的、病毒去除率高的病毒去除蛋白质制剂的制造方法。
[0023]用于解决问题的方案
[0024]本发明人等为了解决上述问题而进行了深入地研究，结果发现，通过使供于过滤的溶液中的PH和盐的离子强度的条件为特定的值，即使低过滤压力下也能得到病毒去除率闻的蛋白质制剂，从而完成了本发明。
[0025]即，本发明涉及以下方案。
[0026][I] 一种病毒去除蛋白质制剂的制造方法，其包括以下的工序(a):
[0027](a)使用小孔病毒去除膜过滤含病毒的蛋白质溶液，从而得到病毒去除蛋白质溶液的过滤工序，
[0028]过滤工序(a)包括以下的工序(q):
[0029](q)使用小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下的过滤压力过滤溶液，从而得到病毒去除蛋白质溶液的低压过滤工序，
[0030]低压过滤工序(q)中的过滤前溶液的PH(X)及盐的离子强度Y(mM)满足以下的式I及式5:
[0031]O ≤ Y ≤ 150X-590 (式 I)[0032]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)
[0033]或者满足以下的式4及式5:
[0034]Y=O (式 4)
[0035]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
[0036][2]根据[I]所述的方法，其中，前述工序(q)中的过滤前溶液为含病毒的蛋白质溶液，
[0037]通过过滤工序(a)过滤的全部含病毒的蛋白质溶液的50%以上被低压过滤工序(q)过滤。
[0038][3]根据[I]所述的方法，其中，过滤工序(a)为使用小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下的过滤压力过滤含病毒的蛋白质溶液，从而得到病毒去除蛋白质溶液的工序，过滤工序(a)中的过滤前溶液的pH(X)及盐的离子强度Y(mM)满足以下的式I及式5:
[0039]O ≤ Y ≤ 150X-590 (式 I)
[0040]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)
[0041]或者满足以下的式4及式5:
[0042]Y=O (式 4)
[0043]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
[0044][4]根据[I]所述的方法，其中，过滤工序(a)包括在低压过滤工序(q)之前进行的以下的工序(P):
[0045](P)使用小孔病毒去除膜，以超过0.30kgf/cm2的过滤压力过滤含病毒的蛋白质溶液，从而得到病毒去除蛋白质溶液的高压过滤工序。
[0046][5]根据[4]所述的方法，其中，低压过滤工序(q)中的过滤前溶液为洗涤用缓冲液。
[0047][6]根据[4]或[5]所述的方法，其中，低压过滤工序(q)为后洗涤工序或起止工序。
[0048][7]根据[I]~[6]中任一项所述的方法，其中，低压过滤工序(q)中的过滤溶液的PH⑴及盐的离子强度Y(mM)满足以下的式2及式5:
[0049]O ≤ Y ≤ 50X-200 (式 2)
[0050]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)
[0051]或者满足以下的式4及式5:
[0052]Y=O (式 4)
[0053]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
[0054][8]根据[I]~[6]中任一项所述的方法，其中，低压过滤工序(q)中的过滤前溶液的PH⑴及盐的离子强度Y(mM)满足以下的式3及式5:
[0055]O ≤ Y ≤ 50X-250 (式 3)
[0056]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)
[0057]或者满足以下的式4及式5:
[0058]Y=O (式 4)
[0059]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。[0060][9]根据[I]~[8]中任一项所述的方法，其中，低压过滤工序(q)为使用小孔病毒去除膜，以0.20kgf/cm2以下的过滤压力过滤溶液，从而得到病毒去除蛋白质溶液的工序。
[0061][10]根据[I]~[4]中任一项所述的方法，其中，根据过滤工序(a)前的含病毒的蛋白质溶液中的病毒浓度(Ctl)与过滤后的病毒去除蛋白质溶液中的病毒浓度(Cf)使用以下的式6算出的对数下降值LRV (Log Reduction Value)为4以上，
[0062]LRV=1g10 (C0/CF)(式 6)。
[0063][11]根据[5]或[6]所述的方法，其中，根据过滤工序(a)前的含病毒的蛋白质溶液中的病毒浓度(Ctl)与过滤后的病毒去除蛋白质溶液中的病毒浓度(Cf)使用以下的式6算出的对数下降值LRV(Log Reduction Value)为4以上，
[0064]LRV=1g10 (C0/CF)(式 6)
[0065]根据过滤工序(a)前的含病毒的蛋白质溶液中的病毒浓度(Ctl)与过滤工序(a)后的洗涤用缓冲液滤液中的病毒浓度(Cw)使用以下的式7算出的对数下降值LRV’为4以上，
[0066]LRVj =1g10 (C0/Cff)(式 7)。
[0067][12]根据[I]~[11]中任一项所述的方法，其中，小孔病毒去除膜的材质为纤维素或亲水化的合成高分子。
[0068][13]根 据[I]~[12]中任一项所述的方法，其中，小孔病毒去除膜的材质为亲水化的合成高分子，前述合成高分子选自由聚偏二氟乙烯、聚醚砜、聚砜和聚乙烯组成的组中。
[0069][14]根据[I]~[13]中任一项所述的方法，其中，小孔病毒去除膜的形状为平膜或中空纤维膜。
[0070][15]根据[I]~[14]中任一项所述的方法，其中，含病毒的蛋白质溶液中的蛋白质浓度为lmg/mL~100mg/mL。
[0071][16]根据[I]~[15]中任一项所述的方法，其中，含病毒的蛋白质溶液包含选自由各种单克隆抗体、基因重组血液凝固因子、干扰素、各种激素、各种酶、免疫球蛋白、白蛋白、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、纤维蛋白原和抗凝血酶III组成的组中的一种以上的蛋白质。
[0072][17]根据[I]~[15]中任一项所述的方法，其中，含病毒的蛋白质溶液包含抗体作为蛋白质。
[0073][18]根据[I]~[15]中任一项所述的方法，其中，含病毒的蛋白质溶液包含血液凝固第VIII因子或纤维蛋白原作为蛋白质。
[0074][19]根据[I]~[18]中任一项所述的方法，其中，含病毒的蛋白质溶液含有选自由人细小病毒B19(B19)、小鼠微小病毒(MVM)、猪细小病毒(PPV)、牛细小病毒(BPV)、犬细小病毒(CPV)、脊髓灰质炎病毒(Polio)、圆环病毒、甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)组成的组中的一种以上的病毒。
[0075][20]根据[I]~[19]中任一项所述的方法，其中，含病毒的蛋白质溶液含有不具有包膜的直径32nm以下的病毒。
[0076][21]根据[I]~[20]中任一项所述的方法，其中，含病毒的蛋白质溶液含有选自由无机盐、缓冲液成分、表面活性剂和糖类组成的组中的一种以上的成分。[0077][22] 一种病毒去除蛋白质制剂的制造方法，其包括以下的工序(a):
[0078](a)使用小孔病毒去除膜过滤含病毒的蛋白质溶液，从而得到病毒去除蛋白质溶液的过滤工序，
[0079]过滤工序(a)包括以下的工序(q):
[0080](q)使用小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下的过滤压力过滤溶液，从而得到病毒去除蛋白质溶液的低压过滤工序，
[0081]在低压过滤工序(q)之前包括调整过滤前溶液的工序以使工序(q)中的过滤前溶液的PH⑴及盐的离子强度Y(mM)满足以下的式I及式5:
[0082]O ≤ Y ≤ 150X-590 (式 I)
[0083]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)
[0084]或者满足以下的式4及式5:
[0085]Y=O (式 4)
[0086]3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
[0087][23] 一种病毒去除蛋白质制剂，其通过[I]~[22]中任一项所述的方法得到。
[0088]发明的效果
[0089]根据本发明，在包括在低过滤压力下使用小孔病毒去除膜过滤含病毒的蛋白质溶液的工序的病毒去除蛋白质制剂的制造方法中，可以提供病毒去除率高的蛋白质制剂。因此，即使在例如以低过滤压力连续地过滤含病毒的蛋白质溶液的情况、包括后洗涤工序的情况、或者包括起止工序的情况下，也可以提供病毒去除率高的蛋白质制剂。
【专利附图】
【附图说明】
[0090]图1为表示实施例2中未产生病毒的漏出的情况的过滤前溶液中的pH⑴与盐的离子强度(Y(HiM))的关系的图。由左侧开始表示实施例2中确定的对应于式1、式2和式3的线。
【具体实施方式】
[0091]以下对用于实施本发明的方式(以下称为“本实施方式”)进行详细说明。需要说明的是，本发明不被以下的本实施方式限定，在其要旨的范围内可以进行各种变形来实施。
[0092]本实施方式中的病毒去除蛋白质制剂的制造方法包括使用小孔病毒去除膜过滤含病毒的蛋白质溶液，从而得到病毒去除蛋白质溶液的过滤工序(a)。
[0093]工序(a)中被过滤的“含病毒的蛋白质溶液”只要为含有用后述的小孔病毒过滤膜过滤时通过过滤膜的蛋白质、有可能含有病毒的溶液则没有特别限制。特别是将源自包括人的动物的成分、基因等作为原料的溶液，由于含有病毒的可能性高，因此通过作为本实施方式的制造方法中的含病毒的蛋白质溶液使用，可以有效地提供病毒去除蛋白质制剂。
[0094]作为含病毒的蛋白质溶液，可列举出例如作为生物技术药物的原料的，利用遗传工程学、细胞培养等生物技术生产的，含有肽、蛋白质作为有效成分的溶液。具体而言，可例示出含有各种单克隆抗体(IgG、IgM等)、基因重组血液凝固因子、干扰素、各种激素(生长激素、促红细胞生成素等)、各种酶，以糖修饰蛋白质、PEG化蛋白质为代表的修饰蛋白质，人工蛋白质等的溶液等，但是不限于此。[0095]另外，作为含病毒的蛋白质溶液，还可列举出例如由血浆精制得到的血浆分级分离制剂的原料。作为血浆分级分离制剂，可例示出免疫球蛋白制剂、白蛋白制剂、血液凝固因子制剂等，特别是作为血液凝固因子制剂，可例示出血液凝固第VIII因子制剂、血液凝固第IX因子制剂、纤维蛋白原制剂、抗凝血酶III制剂等。因此，作为含病毒的蛋白质溶液，具体而言，可例不出含有免疫球蛋白、白蛋白、血液凝固因子(血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、纤维蛋白原、抗凝血酶III等)等的溶液，但是不限于此。一方案中，本实施方式中的含病毒的蛋白质溶液有时优选含有抗体作为蛋白质。一方案中，本实施方式中的含病毒的蛋白质溶液有时优选含有血液凝固第VIII因子或纤维蛋白原作为蛋白质。
[0096]含病毒的蛋白质溶液中的蛋白质的浓度只要能够通过小孔病毒去除膜过滤则没有特别限定，例如为lmg/mL~100mg/mL,优选为lmg/mL~80mg/mL,更优选为lmg/mL~70mg/mL,进一步优选为lmg/mL~50mg/mL。存在蛋白质的浓度升高时利用病毒去除膜实现的过滤速度降低的倾向。
[0097]对含病毒的蛋白质溶液所含的病毒没有特别限定，可列举出人细小病毒B19(B19)、小鼠微小病毒(MVM)、猪细小病毒(PPV)、牛细小病毒(BPV)、犬细小病毒(CPV)、脊髓灰质炎病毒(Polio)、圆环病毒、甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)等，优选选自由人细小病毒B19(B19)、小鼠微小病毒(MVM)、猪细小病毒(PPV)、牛细小病毒(BPV)、犬细小病毒(CPV)、脊髓灰质炎病毒(Polio)和甲型肝炎病毒(HAV)组成的组中。
[0098]上述病毒中、特别是细小病毒，在血浆分级分离制剂领域中，被报告有由于人细小病毒B19(B19)所导致的感染的事例，EMEA(欧洲药品评价局)作出了关于源自血浆的制剂的病毒安全性的报告。进而，在生物技术药物领域中，存在由于小鼠细小病毒对CHO细胞(源自小鼠)的混入所导致的对制造工艺中的单克隆抗体的污染的实例，FDA(美国食品药品监督管理局)作出了关于使用动物细胞制作的生物技术药物的病毒安全性评价的指南(ICH Q5A)。
[0099]细小病毒属于细小病毒科，是现在公知的最小病毒(直径18~24nm)。可列举出人细小病毒B19(B19)、小鼠细小病毒(MVM)、猪细小病毒(PPV)、犬细小病毒(CPV)、牛细小病毒(BPV)等。
[0100]细小病毒由于不具有包膜，因此物理化学上稳定，对于生物学制剂的制造工艺中的灭活工序中通常进行的加热、低pH、化学药品处理具有耐性，作为作用机理与灭活法不同的病毒去除方法，利用病毒去除膜进行细小病毒去除的需求升高。一方案中，本实施方式提供细小病毒去除蛋白质制剂的制造方法。
[0101]另外，作为细小病毒以外的不具有包膜的小病毒，可列举出圆环病毒(17~22nm)、小核糖核酸病毒科(family Picornaviridae)的甲型肝炎病毒(27~30nm)、脊髓灰质炎病毒(30nm)、戍型肝炎病毒(32nm)等,一方案中,本实施方式提供以不具有包膜的病毒(优选直径32nm以下、更优选直径30nm以下、进一步优选直径24nm以下的病毒)作为对象的病毒去除蛋白质制剂的制造方法。
[0102]含病毒的蛋白质溶液，除了上述蛋白质和病毒之外，还可以含有选自由碱性氨基酸、无机盐、缓冲液成分、表面活性剂和糖类组成的组中的一种以上成分。
[0103]作为碱性氨基酸，可列举出精氨酸、组氨酸、胍、赖氨酸或它们的衍生物、或者它们的盐，优选为精氨酸、组氨酸、赖氨酸或它们的衍生物、或者它们的盐，更优选为精氨酸或其衍生物、或它们的盐。
[0104]作为无机盐，可以含有NaCl、缓冲盐。作为缓冲液成分，可以使用醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液等。无机盐和缓冲液成分的浓度可以参照以下具体说明的盐的离子强度来确定。
[0105]作为表面活性剂,可例示出作为非离子性表面活性剂的Tween20、Tween80等，可以以0.01~0.05wt%的浓度含有。
[0106]作为糖类，为单糖、二糖、三糖、低聚糖、糖醇等，没有特别限定，具体而言，可以以I~10wt%、优选I~5wt%含有葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、山梨糖、麦芽糖、蔗糖(sucrose)、山梨糖醇、甘露糖醇、葡聚糖等中的一种或多种的组合。
[0107]过滤前的含病毒的蛋白质溶液的温度只要处于不会影响到所得到的蛋白质制剂的状态的温度范围内即可，但是从防止蛋白质的变性的观点考虑，优选处于4°C~40°C的范围内，更优选处于4°C~35 °C的范围内。温度影响到蛋白质溶液的粘度、影响到病毒去除膜过滤时的通量(Flux)，因此虽然取决于蛋白质自身对于温度的稳定性，但是进一步优选处于20°C~35°C的范围内。
[0108]本实施方式中，病毒去除中使用的“小孔病毒去除膜”被非内服药物协会(PDA、Parenteral Drug Association)定义，指的是基于 PDA 的 Technical report41 (2008 年修订、Appendixl)中记载的手法测定时具有30~33nm粒径的卩遼菌体PP7 (Pseudomonasphage7)的去除率大于41og1(l的膜。
[0109]作为PDA作出的小孔 病毒去除膜的另外的定义，可列举出使用静脉注射免疫球蛋白(IVIG)水溶液或含IVIG的缓冲液，使用与上述噬菌体PP7相同的手法进行试验时，蛋白质的透过率或回收率大于90%的膜。蛋白质的透过率以膜过滤后的溶液的蛋白质浓度与过滤前溶液的蛋白质浓度的比例表示，在将充分体积的溶液进行膜过滤直至膜过滤后的溶液的蛋白质浓度稳定为止后测定。蛋白质浓度的测定可以使用UV光谱测定(A.)。
[0110]对于小孔病毒去除膜而言，优选在各病毒去除膜的推荐压力下，对于细小病毒的去除性能，使用后述的式6算出的LRV为4以上。
[0111]小孔病毒去除膜的材质优选为纤维素或亲水化的合成高分子。作为纤维素，可以使用再生纤维素、天然纤维素、醋酸纤维素等。作为亲水化的高分子，可以使用亲水化聚偏二氟乙烯(PVDF)、亲水化聚醚砜(PES)、亲水化聚乙烯(PE)、亲水化聚砜(PS)等。作为亲水化方法，可列举出通过涂覆、接枝反应、交联反应等方法，向膜表面导入亲水性官能团的方法，固定亲水性聚合物的方法等。
[0112]膜的形状可以为平膜和中空纤维膜中的任意一种，但是由于即使膜面积大、也可以使得将膜装填于容器制成的过滤器小型，因此优选为中空纤维膜。可以制成通过膜隔开为过滤液入口侧的一次侧空间和过滤液出口侧的二次侧空间的过滤器。将病毒去除膜用于过滤时，可以以过滤器的形态使用。
[0113]作为以细小病毒等小病毒的去除作为对象的市售的小孔病毒去除膜，可列举出纤维素制的 Planova (注册商标)15N(Asahi Kasei Medical C0.，Ltd 制)及 Planova (注册商标)20N(Asahi Kasei Medical C0.，Ltd 制)、亲水化 PVDF 制的 Planova (注册商标)BioEX (Asahi Kasei Medical C0.，Ltd 制)、Ultipore (注册商标)VF DV20 (Pali 公司制)及 Viresolve NFP (Millipore 公司制)、亲水化 PES 制的 Virosart CPV(Sartorius 公司制)、Viresolve Pro (Mi l lipore公司制)等。可以根据欲去除的病毒、欲制造的蛋白质制剂的种类适当选择病毒去除膜。
[0114]使用小孔病毒去除膜的含病毒的蛋白质溶液的过滤可以使用各小孔病毒去除膜的通常的使用方法进行。从回收率高的观点考虑，过滤优选为死端式过滤。可以使用过滤压力恒定的定压过滤、过滤压力变动的过滤、过滤速度恒定的定速过滤等任意一种过滤方法。根据过滤前溶液的组成，采用优选的过滤方法。
[0115]工序(a)中的过滤压力虽然取决于小孔病毒去除膜的材质，但是在膜的耐压以下的范围内进行。例如由纤维素形成的小孔病毒去除膜的情况下，0.00kgf/cm2(0.0kPa)~1.00kgf/cm2(9.8X10kPa)的范围是最合适的。由亲水化PVDF、亲水化PES或亲水化PS形成的小孔病毒去除膜的情况下，0.00kgf/cm2(0.0kPa)~5.00kgf/cm2(4.9X 102kPa)的范围是最合适的。
[0116]本实施方式的制造方法中，工序(q)是使用上述小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下的过滤压力过滤溶液、得到病毒去除蛋白质溶液的低压过滤工序，是上述工序(a)所包括的工序。即，工序(q)指的是上述工序(a)中、以0.30kgf/cm2以下的过滤压力进行过滤的工序。
[0117]通常，使用病毒去除膜的含病毒的溶液的过滤尽可能以高过滤压力进行以可以短时间内处理更多量的蛋白质溶液。但是，本发明人等发现在使用上述小孔病毒去除膜、以低过滤压力过滤含病毒的溶液的低压过滤工序中，病毒有可能漏出到滤液中，未被去除。而本发明人等发现，在该低压过滤工序中，通过进行调整以使过滤前溶液的PH(X)和盐的离子强度(Y (mM))满足以下的式I及式5、或者式4及式5，病毒不会漏出到滤液中，能得到病毒被去除的滤液。
[0118]本实施方式中，过滤压力可以简便地使用装填有上述小孔病毒去除膜的病毒去除装置所具备的压力计进行测定。也可以在供给液容器侧设置压力计来进行测定。过滤压力为0.30kgf/cm2以下(例如如后述的实施例所述那样，0.20kgf/cm2附近)时，根据过滤前溶液的组成，病毒漏出到滤液中。虽然并非被理论束缚，但是作为其理由，认为在于，随着过滤压力降低，将病毒拘束于小孔病毒去除膜的拘束力减弱、病毒的自由度升高而漏出到滤液侧，特别是过滤压力为0.30kgf/cm2以下时，该现象更明显。
[0119]但是，低压过滤工序中，过滤前溶液的pH(X)和盐的离子强度(Y(mM))满足以下的式I及式5:
[0120]O ≤ Y ≤ 150X-590 (式 1)
[0121]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)
[0122]或者满足以下的式4及式5:
[0123]Y=O (式 4)
[0124]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)
[0125]时，可以得到病毒被去除的滤液。
[0126]根据欲得到的蛋白质制剂中的病毒去除率，有时更优选低压过滤工序中的过滤前溶液的PH(X)和盐的离子强度(Y(mM))进一步满足以下的式2及式5:
[0127]O ≤ Y ≤ 50X-200 (式 2)
[0128]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)[0129]或者满足以下的式4及式5:
[0130]Y=O (式 4)
[0131]3.5 ^ X ^ 8.0 (式5)，进而，有时特别优选满足以下的式3及式5:
[0132]O ≤ Y ≤ 50X-250 (式 3)
[0133]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)
[0134]或者满足以下的式4及式5:
[0135]Y=O (式 4)
[0136]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)。
[0137]如后述的实施例所述，本发明人等确认，过滤压力为0.30kgf/cm2以下、例如0.20kgf/cm2 附近(例如 0.1Okgf/cm2 ~0.30kgf/cm2、进而例不 0.15kgf/cm2 ~0.25kgf/cm2)，过滤前溶液的pH(X)和盐的离子强度(Y(mM))满足上述式I时，过滤后的病毒的去除率高。
[0138]过滤后的病毒的去除率可以使用对数下降值(LRV、Log Reduction Value)表示。对数下降值LRV根据过滤前溶液中的病毒浓度(Ctl)与过滤后溶液中的病毒浓度(Cf)使用以下的式6算出，LRV值越小则病毒去除率越低。
[0139]LRV=1g10 (C0/CF)(式 6)
[0140]算出LRV时的病毒浓度可以以传染性滴度、病毒核酸的拷贝数等表示。作为传染性滴度的测定方法，可列举出TCID50法、蚀斑技术等。病毒的核酸的拷贝数可以使用PCR法等测定。
[0141]通常，病毒去除膜的性能评价中，若LRV为4以上，则通过膜过滤病毒被充分去除，若LRV为5以上，则病毒被去除至10的5次方分之I以下，若LRV为6以上，则病毒被去除至10的6次方分之I以下，几乎没有病毒的漏出。
[0142]本实施方式中，根据过滤工序(a)前的含病毒的蛋白质溶液中的病毒浓度(Ctl)与过滤后的病毒去除蛋白质溶液中的病毒浓度(Cf)使用上述式6算出的LRV优选为4以上，更优选为5以上，进一步优选为6以上。还优选病毒浓度(Cf)为检测限以下。
[0143]由后述的实施例的结果可知，在低压过滤工序中，随着过滤前溶液的pH降低，病毒向滤液中的漏出增加，LRV降低。该现象在过滤前溶液的盐的离子强度高时更显著，过滤前溶液的PH低、盐的离子强度高时，病毒向滤液中的漏出最多。
[0144]如后述的实施例所示，过滤前溶液的pH(X)和盐的离子强度(Y(mM))满足上述式I及式5、或者式4及式5中的任意一种组合时，可以以LRV4以上的病毒去除率进行低压过滤工序，而另一方面，上述式I及式5、或者式4及式5的组合都不满足时，病毒去除滤率降低，病毒漏出到滤液中。进而，X和Y满足上述式2及式5、或者式4及式5中的任意一种组合时，可以以LRV5以上的病毒去除率进行低压过滤工序，X和Y满足上述式3及式5、或者式4及式5中的任意一种组合时，可以以滤液中的病毒浓度为检测限以下的进一步高的病毒去除率进行低压过滤工序。因此，通过进行调整以使过滤前溶液的PH(X)和盐的离子强度(Y(mM))满足上述式的组合，即使是低过滤压力，病毒也不会漏出到滤液侧，可以得到病毒被去除的溶液。
[0145]低压过滤工序中，过滤前溶液的PH(X)优选为3.5以上且8.0以下，更优选为4.0以上且8.0以下。pH不足3.5以及超过8.0时，有可能产生蛋白质的变性、分解。[0146]过滤前溶液的盐的离子强度(Y(mM))，是对于源自溶液中离解的盐的全部离子种类，将各离子的摩尔浓度(Ci)与离子的电荷数(Zi)的二次方之乘积相加、进而乘以1/2得到的值，以下述式8表示。
[0147]Υ=1/2Σ (CiXZi2) (式 8)
[0148]作为源自盐的离子种类的例子，可列举出源自无机盐的离子、源自构成缓冲液成分的盐的离子。溶液不含有缓冲液成分、仅含有无机盐时，盐的离子强度可以仅由无机盐的离子强度算出。另外，无机盐为NaCl时，盐的离子强度与NaCl的盐浓度相同。
[0149]通常，对于含有缓冲液成分的溶液而言，缓冲液成分具有pH调整的作用，盐的离子强度的调整大多通过加入无机盐(例如NaCl)进行。
[0150]低压过滤工序中，作为不会带来蛋白质变性、聚集体形成这种影响的范围，过滤前溶液的盐的离子强度(Y(禮))期望为500mM以下。优选为300mM以下，更优选为150mM以下。
[0151]本实施方式的一方案中，过滤前溶液的pH(X)和盐的离子强度(Y(mM))处于以下的范围内时，也可以以高病毒去除率进行低压过滤工序。
[0152]为3.5≤X<4并且Y=O的情况；
[0153]4 ≤ X<4.6并且O≤Y≤50、优选O≤Y≤10、更优选Y=O的情况；
[0154]4.6 ≤ X<5并且O≤Y≤100、优选O≤Y≤50、更优选O≤Y≤10、进一步优选Y=O的情况；
[0155]5 ≤ X<6并且O≤Y≤150、优选O≤Y≤100、更优选O≤Y≤50、进一步优选Y=O的情况；以及
[0156]6≤X≤8并且O≤Y≤300、优选O≤Y≤150、更优选O≤Y≤100的情况。
[0157]过滤前溶液的pH调整，可以通过醋酸盐缓冲液、柠檬酸盐缓冲液、磷酸盐缓冲液、Tris-HCl缓冲液等缓冲液成分的选择及增减、NaOH等碱的添加、HCl等酸的添加进行。过滤前溶液的盐的离子强度的调整可以通过NaCl、缓冲盐等盐的增减进行。另外，过滤前溶液的PH以及盐的离子强度的测定也可以用本领域技术人员公知的手法进行。
[0158]作为工序(q)中过滤的过滤前溶液，只要过滤前溶液的PH(X)和盐的离子强度(Y(mM))满足上述式I及式5、或者式4及式5则没有特别限定，除了上述含病毒的蛋白质溶液之外，还可列举出缓冲液(例如后述的洗涤用缓冲液)、水等。对缓冲液的组成也没有特别限定，除了上述缓冲液成分之外，还可以含有上述碱性氨基酸、无机盐、表面活性剂、糖类等。优选含有与工序(a)中的含病毒的蛋白质溶液重复的成分。
[0159]本实施方式的一方案中，工序(q)中的过滤前溶液为含病毒的蛋白质溶液，通过过滤工序(a)过滤的全部含病毒的蛋白质溶液的50%以上被低压过滤工序(q)过滤。
[0160]通常，使用小孔病毒过滤膜的含病毒的蛋白质溶液的过滤尽可能以高过滤压力进行以提高处理效率，但是也有优选以低过滤压力进行过滤的蛋白质。作为这种蛋白质的一例，可列举出抗体。作为抗体，可列举出单克隆抗体、多克隆抗体。含有这种蛋白质的情况下，优选的是，通过过滤工序(a)过滤的全部含病毒的蛋白质溶液的50%以上、优选75%以上、更优选90%以上、进一步优选95%以上被低压过滤工序(q)过滤。
[0161]本实施方式的一方案中，通过过滤工序(a)过滤的全部含病毒的蛋白质溶液全部被低压过滤工序(q)过滤时，过滤工序(a)为使用小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下过滤压力过滤含病毒的蛋白质溶液，从而得到病毒去除蛋白质溶液的工序，过滤工序(a)中的过滤前溶液的PH(X)和盐的离子强度(Y(mM))满足以下的式I及式5:
[0162]O ≤ Y ≤ 150X-590 (式 1)
[0163]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)
[0164]或者满足以下的式4及式5:
[0165]Y=O (式 4)
[0166]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)
[0167]关于此时的过滤压力、式1、式4以及式5，如对于工序(q)记载所述。另外，适于这种过滤的含病毒的蛋白质溶液为单克隆抗体溶液。
[0168]本实施方式的一方案中，过滤工序(a)包括在上述低压过滤工序(q)之前进行的以下的工序(P):
[0169](P)使用小孔病毒去除膜，以超过0.30kgf/cm2的过滤压力过滤含病毒的蛋白质溶液，从而得到病毒去除蛋白质溶液的高压过滤工序。
[0170]工序(P)与工序(q)同样地是上述工序(a)所包括的工序，指的是工序(a)中以高于0.30kgf/cm2的过滤压力进行过滤的工序。
[0171]工序(P)中的小孔病毒去除膜、含病毒的蛋白质溶液以及过滤方法如对于上述工序(a)说明所述。
[0172]工序(P)中的过滤压力虽然取决于小孔病毒去除膜的材质，但是只要高于0.30kgf/cm2、并且处于膜的耐压以下的范围内则没有特别限定。例如由纤维素形成的小孔病毒去除膜的情况下，0.50kgf/cm2 (4.9 X IOkPa)~1.00kgf/cm2 (9.8 X IOkPa)的范围是最合适的。由亲水化PVDF、亲水化PES或亲水化PS形成的小孔病毒去除膜的情况下，1.0Okgf/cm2 (9.8 X IOkPa)~5.00kgf/cm2 (4.9 X 102kPa)的范围是最合适的。
[0173]进行使用小孔病毒过滤膜的含病毒的蛋白质溶液的连续过滤(尽可能以高过滤压力进行以提高处理效率)时，随着过滤量增加而蛋白质颗粒残留于膜的内部(与滤液相反一侧)，有可能产生堵塞。因此，有时进行通过过滤不含有蛋白质的溶液(洗涤液)来将膜内部的蛋白质洗出到滤液侧的被称为后洗涤工序的作业。本实施方式中，后洗涤工序指的是为了回收残留于小孔病毒去除膜的内部的蛋白质，而在蛋白质过滤后追加进行的过滤。进行后洗漆工序时，为了过滤洗漆液来替代含蛋白质的溶液，转换导入过滤前溶液的管路。该转换时，若过滤压力仍然高则溶液倒流到洗涤液侧，因此暂时释放过滤压力、达到0.0kPa0转换管路后，再次施加过滤压力过滤洗涤液。对于直至压力为零后、再次施加过滤压力开始洗涤液的过滤为止的时间没有特别限定。充分产生压力降低的是例如5秒以上，I分钟以上、5分钟以上、30分钟以上时更充分地产生压力降低。另外，从作业性的观点考虑，例如大多在7天以内、5天以内、3天以内、或24小时以内开始。转换管路时，过滤压力暂时降低，因此根据过滤前溶液的组成，病毒会漏出到滤液侧。该病毒的漏出可以如上所述通过工序(q)防止。
[0174]即，本实施方式的一方案中，在进行上述工序(P)的过程中，残留于膜的内部的蛋白质颗粒通过包括低压过滤工序(q)的后洗涤工序洗涤。低压过滤工序(q)为后洗涤工序(的一部分)时，工序(q)中的过滤前溶液优选为不含有蛋白质的洗涤液。对洗涤液的组成没有特别限定，优选含有与工序(a)或(P)中的含病毒的蛋白质溶液重复的成分，更优选为洗涤用缓冲液。洗涤用缓冲液指的是制造工序(a)中的含病毒的蛋白质溶液时溶解蛋白质的缓冲液。后洗涤工序根据需要可以进行多次。
[0175]需要说明的是，工序(a)包括后洗涤工序时，根据过滤工序(a)前的含病毒的蛋白质溶液中的病毒浓度(Ctl)与过滤后的病毒去除蛋白质溶液中的病毒浓度(Cf)使用上述式6算出的LRV为4以上(优选为5以上)，根据过滤工序(a)前的含病毒的蛋白质溶液中的病毒浓度(Ctl)与过滤工序(a)后的洗涤用缓冲液滤液中的病毒浓度(Cw)使用以下的式7算出的LRV’优选为4以上(优选为5以上)。
[0176]LRVj =1g10 (C0/Cff)(式 7) [0177]病毒浓度可以使用对于式6的上述手法测定。
[0178]需要说明的是，上述式7中，过滤工序(a)后的洗涤用缓冲液滤液中的病毒浓度(Cw)指的是仅后洗涤工序中过滤的洗涤用缓冲液的滤液的病毒浓度。在小孔病毒过滤膜内部残留源自在后洗涤工序前过滤的含病毒的蛋白质溶液的病毒，在包括低过滤压力下的过滤的后洗涤工序中，根据过滤前溶液的PH和盐的离子强度，病毒有可能漏出到洗涤用缓冲液滤液中。通过进行调整以使过滤前溶液的PH(X)和盐的离子强度(Y(mM))满足上述式I及式5、或者式4及式5，在后洗涤工序中也可以防止病毒的漏出。
[0179]另外，作为与后洗涤工序同样地，在用病毒去除膜过滤时的过滤压力降低的情况，可列举出包括过滤中途暂时中断加压、然后恢复加压的事例的工序(起止工序)。作为例子，可以考虑以下事态:使用小孔病毒过滤膜的含病毒的蛋白质溶液的过滤时，由于电源脱落等缘故而未施加过滤压力，然后再次接通电源，由此施加过滤压力。对于压力为零后、直至再次施加过滤压力开始洗涤液的过滤为止的时间没有特别限定。充分产生压力降低的是例如5秒以上，I分钟以上、5分钟以上、30分钟以上时更充分地产生压力降低。另外，从作业性的观点考虑，例如大多在7天以内、5天以内、3天以内、或24小时以内开始。这种情况下，由于过滤压力暂时降低，根据过滤前溶液的组成，病毒有可能漏出到滤液侧。该病毒的漏出可以如上所述通过工序(q)防止。
[0180]即，本实施方式的一方案中，进行上述工序(P)、过滤压力降低时，进行过滤前溶液的pH(X)和盐的离子强度(Y(mM))处于规定范围内的低压过滤工序(q)，由此可以切实地得到病毒去除蛋白质溶液。
[0181]本实施方式的一方案中，过滤工序(a)包括在上述低压过滤工序(q)之前进行的工序(P)时，可以包括工序(q)中的过滤压力大致为0.0kPa的情况。例如上述后洗涤工序中、转换导入过滤前溶液的管路的情况，起止工序中电源脱落的情况，过滤压力有可能大致为0.0kPa。此时，对于再加压的方法而言，可以封闭小孔病毒去除膜与过滤前溶液供给容器之间后，将供给容器侧的压力设定为对于工序(a)记载的最合适的过滤压力后，打开小孔病毒去除膜与过滤前溶液供给容器之间，以恒压过滤，也可以打开小孔病毒去除膜与过滤前溶液供给容器之间，缓慢地升高至规定压力并进行过滤。例如若将过滤压力为0.0kPa的放置时间(进行低过滤压力下的过滤的时间)为3小时、然后再加压进行过滤时的病毒去除率作为基准，则预想短于3小时的放置时间的病毒去除率高于3小时的情况。
[0182]本实施方式的病毒去除蛋白质制剂的制造方法中，在工序(a)之前，也可以用由孔径大于小孔病毒去除膜的孔径尺寸的膜形成的过滤器进行预备过滤。在此，作为大孔径的过滤器，可以使用Planova (注册商标)35N、Planova (注册商标)75N(以上Asahi KaseiMedical C0.，Ltd制)、0.1 ii m过滤器、0.2 ii m过滤器等。也可以不进行预备过滤,直接使
用小孔病毒去除膜进行工序(a)。
[0183]在工序(a)之前，可以进行色谱处理、S/D处理、浓缩处理、和浓缩/缓冲液交换处理中的任意一种以上。
[0184]作为色谱处理，可例示出离子交换树脂、凝胶过滤树脂装入柱子而成的柱色谱、对多孔膜表面赋予了离子交换基团的膜色谱。作为色谱的分离模式，可列举出凝胶过滤色谱、离子交换色谱(阳离子交换:CEX、阴离子交换:AEX)、疏水色谱(HIC)、亲和色谱、金属螯合亲和色谱、羟基磷灰石色谱等。作为色谱的配体，可以使用离子交换和疏水相互作用复合而成的色谱。
[0185]关于S/D处理，可以根据公知的方法，通过使用磷酸三正丁酯(TNBP、tr1-n-butylphosphate)等作为有机溶剂，使用TweenSO等作为表面活性剂，将病毒灭活来进行。
[0186]关于浓缩处理，可以根据公知的方法，通过使用超滤(UF)膜的方法进行。可以通过离心浓缩进行。
[0187]缓冲液交换处理也可以根据公知的方法，使用超滤膜与浓缩同时进行。也可以通过凝胶过滤法进行。还可以通过使用透析膜的透析法进行。
[0188]在工序(a)之后，对于所得到的病毒去除蛋白质溶液，可以利用色谱处理进行精制处理。另外，也可以通过UF处理进一步高浓度化。对于工序(a)中得到的病毒去除蛋白质溶液、其精制物或浓缩物，可以以原来的液体组成最终制剂化。另外，也可以添加糖类、表面活性剂等，最终制剂化。还可以与其它组成的溶剂进行缓冲液交换。另外，还可以进一步进行冷冻干燥处理。
[0189]本实施方式的一方案中，涉及一种病毒去除蛋白质制剂的制造方法，其包括以下的工序(a):
[0190](a)使用小孔病毒去除膜过滤含病毒的蛋白质溶液，从而得到病毒去除蛋白质溶液的过滤工序，
[0191]过滤工序(a)包括以下的工序(q):
[0192](q)使用小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下的过滤压力过滤溶液，从而得到病毒去除蛋白质溶液的低压过滤工序，
[0193]在低压过滤工序(q)之前包括调整过滤前溶液的工序以使工序(q)中的过滤前溶液的PH⑴及盐的离子强度Y(mM)满足以下的式I及式5:
[0194]0 ≤ Y ≤ 150X-590 (式 I)
[0195]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)
[0196]或者满足以下的式4及式5:
[0197]Y=O (式 4)
[0198]3.5 ≤ X≤ 8.0 (式 5)。
[0199]本实施方式还涉及由上述制造方法得到的病毒去除蛋白质制剂。另外，本实施方式还涉及含病毒的蛋白质溶液中的病毒去除方法，其特征在于，其进行上述工序(a)(包括工序(q))。
[0200]实施例
[0201]以下基于实施例对本发明进行说明，但是本发明的范围并不限于以下的实施例来解释。
[0202]以下所示的实施例中，作为小孔病毒去除膜，使用由纤维素中空纤维膜形成的Planova (注册商标)20N (Asahi Kasei Medical C0.，Ltd 制)。pH 使用 pH 计测定。盐的离子强度由制造各溶液时使用的盐的量(盐浓度)算出。
[0203](i)蛋白质溶液的制造
[0204]使用多克隆抗体(人IgG) (Venoglobulin-1H>benesis corporation 制),用注射用水(大塚制药)稀释以使抗体浓度为10mg/mL。另外，使用IM NaCl水溶液制造以达到以下的各实施例所示的盐的离子强度。进而，PH使用0.1M HCl或0.1M NaOH，调整成以下的各实施例所示的pH。
[0205](ii)病毒去除率(LRV)的测定
[0206]用含有牛血清(Upstate公司制、56°C的水浴中加热30分钟灭活后使用)3体积％和青霉素/链霉素(+10000单位(Units)/mL青霉素(Penicillin)、+10000 u g/mL链霉素(Streptomycin) > Invitrogen Corporation 制)I 体积％ 的 D_MEM(Invitrogen Corporation制、高葡萄糖(high-glucose))(该混合液以后记载为“3%FBS/D-MEM”)，将培养的PK-13细胞(由ATCC获得、ATCCN0.CRL-6489)稀释，制造细胞浓度2.0 X IO5 (cells/mL)的稀释悬浮液。准备10块96孔(well)圆底细胞培养板(Falcon公司制)，将该细胞悬浮液向全部孔中各分注IOO(UL)0
[0207]接着，对于下述各实施例中进行了过滤的滤液，制造它们的利用3%FBS/D_MEM的10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍及IO5倍稀释液，进而，对于即将过滤之前采集的各原液(含病毒的蛋白质溶液)，制造它们的利用3%FBS/D-MEM的IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍及IO7倍稀释液。向分注有上述细胞悬浮液的96孔细胞培养板，将各滤液及滤液的10倍、IO2倍、IO3倍、IO4倍及IO5倍稀释液`，和原液的IO2倍、IO3倍、IO4倍、IO5倍、IO6倍及IO7倍稀释液，分别向8孔中各分注100 (uL), 37°C、5% 二氧化碳气氛下，培养箱中培养10天。
[0208]接着，对于培养了 10天的上述细胞培养板，利用红血球吸附法(参照病毒实验学(々^ 7実験学)总论国立预防卫生研究所学友会编、P.173)进行TCID50(50%传染性滴度)的测定。将鸡保存血(Nippon Biotest Laboratories inc.制)用PBS(-)(日水制药株式会社制、用制品随附的说明书中记载的方法制造)稀释到5倍后，以2500 (rpm)、4°C离心分离5分钟，使红血球沉淀后，吸引去除上清液，将所得到的含红血球的沉淀物再次用上述PBS(-)稀释到 200倍。
[0209]接着，将所制造的红血球沉淀物的PBS(-)稀释液向上述细胞培养板的全部孔中各分注100(i! L)，静置2小时后，肉眼确认红血球对于所培养的细胞组织的表面的吸附的有无，将确认到吸附的情况作为产生了病毒感染的孔进行计数，将未确认吸附的情况作为没有感染的孔进行计数。关于各所得到的培养液的病毒感染的有无，对于滤液或其各稀释液、或者原液的各稀释液，确认比例，通过Reed-Muench法(参照病毒实验学(々4 ^実験学)总论国立预防卫生研究所学友会编、P.479-480)，作为传染性滴度，算出log(TCID5Q/mL)，使用以下的式算出病毒去除率LRV。
[0210]LRV=1g10 (C0/CF)
[0211]在此，Ctl=用小孔病毒去除膜过滤前的原液(含病毒的蛋白质溶液)中的传染性滴度、[0212]Cf=用小孔病毒去除膜过滤后的溶液中的传染性滴度。
[0213](实施例1:不同过滤压力下使用病毒去除膜的过滤)
[0214]用上述(i)中记载的方法制造pH4、4.6、5、6、7或8、盐的离子强度全部为IOOmM的各蛋白质溶液(多克隆抗体溶液)(实验例I~16)。然后分别添加0.5vol%的PPV (猪细小病毒、社团法人动物用生物学的制剂协会、以下对于实施例2~4也同样)，充分搅拌，得到含病毒的蛋白质溶液。
[0215]对于所得到的各溶液，使用膜面积0.001m2的小孔病毒去除膜(Planova(注册商标)20N)，以0.10,0.20,0.50或0.80kgf/cm2的过滤压力进行死端式过滤直至过滤量达到50L/m2。对于过滤压力，在供给液容器侧设置压力计来测定。用上述(ii)中记载的方法测定50L/m2池(pool)下的PPV的去除率。
[0216]各过滤压力和pH与病毒去除率(LRV)的关系如以下的表1所示。如表1所示可知，过滤压力高时，即使PH变化也能维持高的病毒去除率，但是过滤压力低时，随着过滤前的含病毒的蛋白质溶液的pH降低，病毒去除率降低，病毒漏出。
[0217][表1]
【权利要求】
1.一种病毒去除蛋白质制剂的制造方法，其包括以下的工序(a): (a)使用小孔病毒去除膜过滤含病毒的蛋白质溶液，从而得到病毒去除蛋白质溶液的过滤工序， 过滤工序(a)包括以下的工序(q): (q)使用所述小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下的过滤压力过滤溶液，从而得到所述病毒去除蛋白质溶液的低压过滤工序， 低压过滤工序(q)中的所述过滤前溶液的PH(X)及盐的离子强度Y(mM)满足以下的式I及式5: . O ≤ Y ≤ 150X-590 (式 I)
.3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5) 或者满足以下的式4及式5: Y=O (式 4) . 3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述工序(q)中的所述过滤前溶液为所述含病毒的蛋白质溶液， 通过过滤工序(a)过滤的全部含病毒的蛋白质溶液的50%以上被低压过滤工序(q)过滤。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，过滤工序(a)为使用所述小孔病毒去除膜，以.0.30kgf/cm2以下的过滤压力过滤所述含病毒的蛋白质溶液，从而得到所述病毒去除蛋白质溶液的工序，过滤工序(a)中的所述过滤前溶液的PH(X)及盐的离子强度Y(mM)满足以下的式I及式5: . O ≤ Y ≤ 150X-590 (式 I) . 3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5) 或者满足以下的式4及式5: Y=O (式 4) . 3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，过滤工序(a)包括在低压过滤工序(q)之前进行的以下的工序(P): (P)使用所述小孔病毒去除膜，以超过0.30kgf/cm2的过滤压力过滤所述含病毒的蛋白质溶液，从而得到所述病毒去除蛋白质溶液的高压过滤工序。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，低压过滤工序(q)中的所述过滤前溶液为洗涤用缓冲液。
6.根据权利要求4或5所述的方法，其中，低压过滤工序(q)为后洗涤工序或起止工序。
7.根据权利要求1~6中任一项所述的方法，其中，低压过滤工序(q)中的所述过滤溶液的PH⑴及盐的离子强度Y(mM)满足以下的式2及式5: . O ≤ Y ≤ 50X-200 (式 2)
.3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5) 或者满足以下的式4及式5:Y=O (式 4)
.3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
8.根据权利要求1~6中任一项所述的方法，其中，低压过滤工序(q)中的所述过滤前溶液的PH(X)及盐的离子强度Y(mM)满足以下的式3及式5: . O ≤ Y ≤ 50X-250 (式 3) . 3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5) 或者满足以下的式4及式5: Y=O (式 4)
.3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
9.根据权利要求1~8中任一项所述的方法，其中，低压过滤工序(q)为使用所述小孔病毒去除膜，以0.20kgf/cm2以下的过滤压力过滤所述溶液，从而得到所述病毒去除蛋白质溶液的工序。
10.根据权利要求1~4中任一项所述的方法，其中，根据过滤工序(a)前的所述含病毒的蛋白质溶液中的病毒浓度(Ctl)与过滤后的所述病毒去除蛋白质溶液中的病毒浓度(Cf)使用以下的式6算出的对数下降值LRV(Log Reduction Value)为4以上，
LRV=1gltl (CcZCf)(式 6)。
11.根据权利要求5或6所述的方法，其中，根据过滤工序(a)前的所述含病毒的蛋白质溶液中的病毒浓度(Ctl)与过滤后的所述病毒去除蛋白质溶液中的病毒浓度(Cf)使用以下的式6算出的对数下降值LRV (Log Reduction Value)为4以上，
LRV=1gltl (CcZCf)(式 6) 根据过滤工序(a)前的所述含病毒的蛋白质溶液中的病毒浓度(Ctl)与过滤工序(a)后的所述洗涤用缓冲液滤液中的病毒浓度(Cw)使用以下的式7算出的对数下降值LRV’为4以上，
LRVj =1g10 (C0/Cff)(式 7)。
12.根据权利要求1~11中任一项所述的方法，其中，所述小孔病毒去除膜的材质为纤维素或亲水化的合成高分子。
13.根据权利要求1~12中任一项所述的方法，其中，所述小孔病毒去除膜的材质为亲水化的合成高分子，所述合成高分子选自由聚偏二氟乙烯、聚醚砜、聚砜和聚乙烯组成的组中。
14.根据权利要求1~13中任一项所述的方法，其中，所述小孔病毒去除膜的形状为平膜或中空纤维膜。
15.根据权利要求1~14中任一项所述的方法，其中，所述含病毒的蛋白质溶液中的蛋白质浓度为lmg/mL~100mg/mL。
16.根据权利要求1~15中任一项所述的方法，其中，所述含病毒的蛋白质溶液包含选自由单克隆抗体、基因重组血液凝固因子、干扰素、激素、酶、免疫球蛋白、白蛋白、血液凝固第VIII因子、血液凝固第IX因子、纤维蛋白原和抗凝血酶III组成的组中的一种以上的蛋白质。
17.根据权利要求1~15中任一项所述的方法，其中，所述含病毒的蛋白质溶液包含抗体作为蛋白质。
18.根据权利要求1~15中任一项所述的方法，其中，所述含病毒的蛋白质溶液包含血液凝固第VIII因子或纤维蛋白原作为蛋白质。
19.根据权利要求1~18中任一项所述的方法，其中，所述含病毒的蛋白质溶液含有选自由人细小病毒B19(B19)、小鼠微小病毒(MVM)、猪细小病毒(PPV)、牛细小病毒(BPV)、犬细小病毒(CPV)、脊髓灰质炎病毒(Polio)、圆环病毒、甲型肝炎病毒(HAV)和戊型肝炎病毒(HEV)组成的组中的一种以上的病毒。
20.根据权利要求1~19中任一项所述的方法，其中，所述含病毒的蛋白质溶液含有不具有包膜的直径32nm以下的病毒。
21.根据权利要求1~20中任一项所述的方法，其中，所述含病毒的蛋白质溶液含有选自由无机盐、缓冲液成分、表面活性剂和糖类组成的组中的一种以上的成分。
22.—种病毒去除蛋白质制剂的制造方法，其包括以下的工序(a): (a)使用小孔病毒去除膜过滤含病毒的蛋白质溶液，从而得到病毒去除蛋白质溶液的过滤工序， 过滤工序(a)包括以下的工序(q): (q)使用所述小孔病毒去除膜，以0.30kgf/cm2以下的过滤压力过滤溶液，从而得到所述病毒去除蛋白质溶液的低压过滤工序， 在低压过滤工序(q)之前包括调整所述过滤前溶液的工序以使工序(q)中的所述过滤前溶液的PH(X)及盐的离子强度Y(mM)满足以下的式I及式5: O≤ Y ≤ 150X-590 (式 I)
3.5 ≤ X ≤ 8.0(式 5) 或者满足以下的式4及式5: Y=O (式 4)
3.5 ≤ X ≤ 8.0 (式 5)。
23.一种病毒去除蛋白质制剂，其通过权利要求1~22中任一项所述的方法得到。
【文档编号】C07K1/34GK103608352SQ201280030636
【公开日】2014年2月26日 申请日期:2012年6月22日 优先权日:2011年6月24日
【发明者】本乡智子, 林田裕久 申请人:旭化成医疗株式会社