自缓冲蛋白制剂的制作方法

专利名称：自缓冲蛋白制剂的制作方法
相关申请的参考
本申请是2005年6月14日提交的美国临时申请序列号60/690,582的部分继续申请并要求全部的优先权，其在此整个引入作为参考。
发明领域 本发明涉及蛋白制剂，尤其是药物蛋白制剂。特别地，本发明涉及自缓冲的生物药物蛋白组合物，以及设计、制备和使用该组合物的方法。此外，本发明涉及用于兽医学和/或人医学的药物蛋白组合物，以及其相关的方法。

背景技术：
药物制备和制剂加工的许多方面是pH敏感的。维持成品药物产品的正确的pH对它的稳定性、有效性和贮存期限是关键的，pH在设计可接受的、以及有效的和安全的制剂中将是一个重要考虑因素。
为了维持pH，药物加工和制剂使用一种或多种缓冲剂。各种缓冲剂可用于药物用途。对于给定用途的缓冲剂，必须在所需的pH下是有效的。只要必要，它们还必须提供足够的缓冲能力以维持所需的pH值。对于药物组合物来说，一种良好的缓冲剂同时必须满足许多其它要求。它必须是适当地可溶的。它必须不与金属离子形成有害的络合物，是毒性的，或过度渗透、溶解或吸收在膜或其它表面上。它应该不会以任何方式与组合物的其它组分发生相互作用，其将降低它们的利用度或有效性。在产物配制和存储期间的条件范围内，在维持pH方面，它必须是稳定的和有效的。它必须不受发生在它的环境中，例如发生在组合物加工过程中的氧化或其它反应的有害影响，其中它提供缓冲作用。如果负载到或掺入最终产品中，缓冲剂必须对给药是安全的，并且在产品的贮藏期限内对组合物的其它组分是相容的，并且适合于给予最终用户。
虽然在普遍使用中有许多缓冲剂，但是仅有有限的数目适合于生物学应用，并且在这些当中，更少的适用于药物加工和配制。因此，经常面临挑战去找到一种缓冲剂，其不仅在维持pH上是有效的，而且将满足给定药物加工、配制或产品的其它所有要求。
找到一种合适的缓冲剂对于药物用途所面临的挑战对药物蛋白来说是尤其尖锐的。蛋白质的构象和活性关键地取决于pH。蛋白质易受各种pH敏感的反应影响，并且对它们的效力是有害的，典型地比小分子药物受影响要严重很多。例如，仅提及少数几个例子，天门冬酰胺和谷氨酰胺的侧链酰胺在低pH值(小于4.0)以及在中性或更高的pH值(大于6.0)时被脱去酰胺基。天冬氨酸残基在低pH值时促进相邻肽键的水解。二硫键的稳定性和分布高度取决于pH值，特别是在硫醇存在下。蛋白质的溶解度、絮凝、凝集、沉淀和纤丝化精确地取决于pH值。对一些药物制剂来说重要的结晶习性也关键地取决于pH值。pH在许多药物肽和蛋白的表面吸附中还是一个重要因素。
而且，催化失活和/或降解一种或多种其它组分的反应的缓冲剂不能被用于药物制剂中。药物用途的缓冲剂必须不仅满足缓冲能力以维持正确的pH，而且它们必须是这样的一种缓冲剂，即它们的给予不会强烈地扰乱受试者的生理pH。药物制剂的缓冲剂还必须与典型地复杂的配制过程不矛盾。例如，升华或蒸发的缓冲剂，例如乙酸盐和咪唑，通常在冷冻干燥期间和在重新构成的冷冻干燥产品中不能依赖其保持pH。其它从蛋白质无定形相中结晶出来的缓冲剂，例如磷酸钠，在需要冷冻的工艺中不能被依赖以保持pH。
在药物终产品中用于保持pH的缓冲剂还必须不仅在保持的pH下是有效的，而且必须是安全的和适合于给予患者。例如，一些其它有用的缓冲剂，例如在低或高浓度下的柠檬酸盐和在高浓度下的乙酸盐，当胃肠外给药时是不希望地产生痛苦的。
一些缓冲剂，例如乙酸盐、琥珀酸盐、柠檬酸盐、组氨酸(咪唑)、磷酸盐和Tris已经被发现用于配制药物蛋白。它们所有都具有不希望的限制和缺点。并且它们所有都具有固有的缺点，即是制剂中的额外的组分，其使配制过程变得复杂，增加了有害地影响其它组分、稳定性、贮存期限和最终用户可接受性的风险。
因此，需要其它的和改善的方法以在制备和配制药物和药物组合物，特别是在制备和配制生物药物蛋白和生物药物蛋白组合物中的过程中保持pH。
发明概述 因此，在本发明的各种目的和方面当中，在某些优选的实施方案中，本发明提供包含蛋白质的蛋白制剂，特别是包含药物蛋白质的药学上可接受的制剂，其通过蛋白本身提供缓冲作用，并且其不需要额外的缓冲剂以维持所需的pH，并且其中所述的蛋白基本上是唯一的缓冲剂(即，其它组分，如果有的话，在该制剂中基本上不作为缓冲剂起作用。
在这方面及其他方面，在本发明的各种目的和方面当中，在某些优选实施方案中，本发明提供蛋白的自缓冲制剂，特别是药物蛋白的自缓冲制剂，其特征在于所配制的蛋白的浓度提供所需的缓冲能力。
在本发明的各种目的和方面当中，在某些特别优选的实施方案中，本发明提供自缓冲蛋白制剂，特别是药物蛋白制剂，其中总盐浓度小于150mM。
在本发明的各种目的和方面当中，在某些特别优选的实施方案中，本发明提供自缓冲蛋白制剂，特别是药物蛋白制剂，其还包含一种或多种多元醇和/或一种或多种表面活性剂。
此外，在本发明的各种目的和方面当中，在某些特别优选的实施方案中，本发明提供包含蛋白的自缓冲制剂，特别是包含药物蛋白的自缓冲制剂，其中总盐浓度小于150mM，其此外还包含一种或多种赋形剂，包括，但不局限于，药学上可接受的盐；渗透平衡剂(张度剂)；表面活性剂、多元醇、抗氧化剂；抗生素；抗霉菌剂；填充剂；冻干保护剂；消泡剂；螯合剂；防腐剂；着色剂；和止痛药。
在本发明的各种目的和方面当中，在某些特别优选实施方案中，本发明提供自缓冲的蛋白制剂，特别是药物蛋白制剂，除所述的蛋白外，其还包含一种或多种其它药学上的活性剂。
本发明的各种其它的方面和实施方案被说明性地描述在下面数目的段落中。本发明通过参考在这些段落中阐述的每一项进行描述，单独地和/或以任何组合。申请人特别保留要求基于任何这些组合的权利要求的权利。
1.根据下列任何一种的组合物，其中所述的组合物已经由国家或国际机构根据法律被批准用于药物用途，这些机构优选为欧洲医疗产品评价署、日本健康、劳动者和福利部、中国国家医药管理总局、美国食品药物管理局或它们的后继者，特别优选美国食品与药物管理局或其继承者。
2.上述或下列任何一种的组合物，其中所述的组合物按照适用于供人体使用的药物生产优良制造规范进行制备。
3.上述或下列任何一种的组合物，其包含蛋白，所述的蛋白在pH5.0-4.0或pH5.0-5.5的范围内的的每单位体积每pH单位的缓冲能力至少大约为2.0或3.0或4.0或5.0或6.50或8.00或10.0或15.0或20.0或30.0或40.0或50.0或75.0或100或125或150或200或250或300或350或400或500mM乙酸钠缓冲剂在纯水中的每单位体积每pH单位的缓冲能力，这种缓冲能力优选地按照实施例1和2中所述的方法进行测定，特别优选地在至少2.0mM，尤其特别优选地在至少3.0mM，非常尤其特别优选地在至少4.0mM或至少在5.0mM，尤其特别优选地在至少7.5mM，特别优选地在至少10mM，优选地在至少20mM下测定。
4.上述或下列任何一项的组合物，其中，不包括蛋白的缓冲能力在内，在pH4.0-5.0或pH5.0-5.5范围内，组合物的每pH单位每单位体积的缓冲能力等于或小于1.0或1.5或2.0或3.0或4.0或5.0mM乙酸钠缓冲剂在纯水中的缓冲能力，优选按照实施例1和2中所述的方法进行测定，特别优选具有小于1.0mM的缓冲能力，尤其特别优选小于2.0mM的缓冲能力，尤其特别优选小于2.5mM的缓冲能力，特别优选小于3.0mM的缓冲能力，优选小于5.0mM的缓冲能力。
5.根据任何上述或下列的包含蛋白的组合物，其中在从该组合物的pH中加或碱1pH单位的范围内，该蛋白的缓冲能力至少约为1.00或1.50或1.63或2.00或3.00或4.00或5.00或6.50或8.00或10.0或15.0或20.0或30.0或40.0或50.0或75.0或100或125或150或200或250或300或350或400或500或700或1,000mEq每升每pH单位，优选至少为约1.00，特别优选1.50，尤其特别优选1.63，甚至尤其特别优选2.00，甚至非常尤其特别优选3.00，甚至尤其特别优选5.0，尤其特别优选10.0，特别优选20.0。
6.根据任何上述或下列的包含蛋白的组合物，其中在从该组合物的pH中加或减1 pH单位的范围内，不包括该蛋白在内，该组合物的每单位体积每pH单位的缓冲能力等于或小于0.50或1.00或1.50或2.00或3.00或4.00或5.00或6.50或8.00或10.0或20.0或25.0mM乙酸钠缓冲剂在纯水中在pH5.0至4.0的范围内或pH在5.0-5.5的范围内的缓冲能力，特别优选根据实施例1和/或实施例2进行测定。
7.根据任何上述或下列的组合物，其中在从所需的pH中加或减1pH单位的范围内，所述的蛋白提供该组合物的缓冲能力的至少约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％的该组合物的缓冲能力，优选提供至少约75％，特别优选提供至少约85％，尤其特别优选提供至少约90％，甚至尤其特别优选提供至少约95％，甚至非常尤其特别优选提供至少约99％。
8.根据任何上述或下列的组合物，其中所述的蛋白的浓度约在下列之间20至400，或20至300，或20至250，或20至200，或20至150mg/ml，优选约在20至400mg/ml之间，特别优选约在20至250之间，尤其特别约在20至150mg/ml之间。
9.根据任何上述或下列的组合物，其中通过蛋白的缓冲作用维持的所述的pH在下列之间3.5至8.0，或4.0至6.0，或4.0至5.5，或4.0至5.0，优选约在3.5至8.0之间，尤其特别优选约在4.0至5.5之间。
10.根据任何上述或下列的组合物，其中所述的盐浓度为小于150mM或125mM或100mM或75mM或50mM或25mM，优选150mM，特别优选125mM，尤其优选100mM，尤其特别优选75mM，特别优选50mM，优选25mM。
11.根据任何上述或下列的组合物，进一步包含一种或多种药学上可接受的盐；多元醇；表面活性剂；渗透平衡剂；渗透剂；抗氧化剂；抗生素；抗霉菌剂；填充剂；冻干保护剂；消泡剂；螯合剂；防腐剂；着色剂；止痛药；或另外的药物试剂。
12.根据任何上述或下列的组合物，包含一种或多种药学上可接受的多元醇，其数量是低渗的、等渗的或高渗的，优选约等渗的，特别优选等渗的，尤其优选山梨糖醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖或甘油中的任何一种或多种，特别尤其优选约5％山梨糖醇、5％甘露醇、9％蔗糖、9％海藻糖或2.5％甘油，在这方面甚至尤其优选5％山梨糖醇、5％甘露醇、9％蔗糖、9％海藻糖或2.5％甘油。
13.根据任何上述或下列的组合物，还包含表面活性剂，优选聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、脱水山梨糖醇的其它脂肪酸酯、聚乙氧基化物和泊洛沙姆188中的一种或多种，特别优选聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80，优选约0.001-0.1％聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80，甚至优选约0.002-0.02％聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80，尤其是0.002-0.02％聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80。
14.根据任何上述或下列的组合物，其中所述的蛋白是药物试剂并且所述的组合物是无菌制剂，其适合于治疗非人或人患者。
15.根据任何上述或下列的组合物，其中所述的蛋白是药物试剂有效的治疗疾病，并且所述的组合物是无菌制剂，其适合于给予所治疗的患者。
16.根据任何上述或下列的组合物，其中在给予患者后，所述的蛋白不诱导显著有害的抗原应答。
17.根据任何上述或下列的组合物，其中给予患者后，所述的蛋白不诱导显著有害的免疫应答。
18.根据任何上述或下列的组合物，其中所述的蛋白是一种人蛋白。
19.根据任何上述或下列的组合物，其中所述的蛋白是一种人化蛋白。
20.根据任何上述或下列的方法，其中所述的蛋白是一种抗体，优选IgA、IgD、IgE、IgG或IgM抗体，特别优选IgG抗体，尤其特别优选IgG1、IgG2、IgG3或IgG4抗体，尤其是IgG2抗体。
21.根据任何上述或下列的组合物，其中所述的蛋白包含Fab片段、Fab2片段、Fab3片段、Fc片段、scFv片段、二-scFv片段、小体、双抗体、三抗体、四抗体、VhH区域、V-NAR域、VH域、VL域、骆驼Ig、Ig NAR或肽抗体或任何上述的变体、衍生物或修饰。
22.根据任何上述或下列的组合物，其中所述的蛋白包含Fc片段或其部分或衍生物或Fc片段的变体或其部分。
23.根据任何上述或下列的组合物，其中所述的蛋白包含一对同源物结合部分的第一结合部分，其中所述的第一结合部分特异性地与第二部分结合。
24.根据任何上述或下列的组合物，其中所述的蛋白包含(a)Fc片段或其部分或其Fc片段或部分的衍生物或变体，和(b)一对同源物结合部分的第一结合部分。
25.根据权利要求1、5、7、9、11、13或14中任一项的组合物，其中所述的蛋白选自与一种或多种CD蛋白、HER受体家族蛋白、细胞粘附分子、生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因子(TGF)、胰岛素样生长因子、骨诱导因子、胰岛素和与胰岛素相关的蛋白、凝固蛋白和与凝固相关的蛋白、克隆刺激因子(CSFs)、其他血液和血清蛋白血型抗原；受体、与受体有关的蛋白、生长激素受体、T-细胞受体；神经营养因子、神经营养蛋白、松弛肽、干扰素、白细胞介素、病毒抗原、脂蛋白、整联蛋白、类风湿因子、免疫毒素、表面膜蛋白、转运蛋白、归巢受体、地址素、调节蛋白和免疫粘附素特异性地结合的蛋白。
26.根据任何上述或下列的组合物，其中所述的蛋白选自OPGL特异性结合蛋白、肌肉抑制素特异性结合蛋白，IL-4受体特异性结合蛋白、IL1-R1特异性结合蛋白、Ang2特异性结合蛋白、NGF-特异性结合蛋白、CD22特异性结合蛋白、IGF-1受体特异性结合蛋白、B7RP-1特异性结合蛋白、IFNγ特异性结合蛋白、TALL-1特异性结合蛋白、干细胞生长因子、Flt-3配体和IL-17受体。
27.根据任何上述或下列的组合物，其中所述的蛋白选自与下列物质中的一种或多种特异性结合的蛋白CD3，CD4，CD8，CD19，CD20，CD34；HER2、HER3、HER4、EGF受体；LFA-1、Mol、p1 50、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、αv/β3整联蛋白；血管内皮细胞生长因子(“VEGF”)；生长激素、促甲状腺激素、促卵泡激素、促黄体生成激素、生长激素释放因子、甲状旁腺素、副中肾管抑制物质、人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)、红细胞生成素(EPO)、NGF-β、血小板衍生生长因子(PDGF)、aFGF、bFGF、表皮生长因子(EGF)、TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、IGF-I、IGF-II、脱(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素、胰岛素A-链、胰岛素B-链、胰岛素原、胰岛素样生长因子结合蛋白；例如，因子VIII、组织因子、假血友病因子、蛋白C、α-1-抗胰蛋白酶、血纤维蛋白溶解酶原活化剂，例如尿激酶和组织纤溶酶原激活物(“t-PA”)、邦巴辛毛葛、凝血酶和促血小板生成素；M-CSF、GM-CSF、G-CSF、白蛋白、IgE、flk2/flt3受体、肥胖症(OB)受体、骨衍生的神经营养因子(BDNF)、NT-3、NT-4、NT-5、NT-6)；松弛肽A-链、松弛肽B-链、松驰素原；干扰素-α、-β和-γ；IL-1至IL-10；AIDS包膜病毒抗原；降钙素、胰高血糖素、心钠素、肺表面活性剂、肿瘤坏死因子-α和-β、脑啡肽酶、RANTES、小鼠促性腺激素-有关的肽、脱氧核糖核酸酶、抑制素和活化素；蛋白A或D、骨形态发生蛋白(BMP)、超氧化物歧化酶、衰变加速因子(DAF)。
28.根据任何上述或下列的组合物，其中所述的蛋白选自阿克体每(干扰素-γ-1b)、活化酶(蛋白溶酶素)、艾杜糖醛酸苷酶(拉罗尼酶)、基因癣康(阿法塞特)、阿伏尼克斯(干扰素β-1a)、重组DNA源凝血因子IX(诺那凝血酶α)、百若木恩(他索纳明)、Beatseron(干扰素-β-1b)、BEXXAR(托西莫单抗)、Tev-Tropin(促生长激素)、重组抗血友病因子浓缩物或RECOMBINATE(重组体)、重组葡糖脑苷脂酶(伊米苷酶)、恩利(依那西普)、红细胞生成素(依泊丁α)、怡泼津/异丙嗪(红细胞生成素α)、法布里酶(α半乳糖苷酶β)、Fasturtec/Elitek ELITEK(拉布立酶)、副甲状腺激素(特立帕肽)、健豪宁(促生长激素)、果开康(胰高血糖素)、胰高血糖素(胰高血糖素，rDNA源)、果纳芬(促滤泡素α)、凝血因子VIII(辛凝血素α)、HERCEPTIN(曲妥单抗)、HUMATROPE(促生长激素)、HUMIRA(阿达木单抗)、在溶液中的胰岛素、INFERGEN(干扰素αcon-1)、KINERET(阿那白滞素)、Kogenate FS(抗血友病因子)、白细胞素(沙莫司亭重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhuGM-CSF))、坎帕斯(阿仑单抗)、RITUXAN(美罗华)、TNKase(替奈普酶)、MYLOTARG(吉姆单抗奥佐米星)、NATRECOR(奈西立肽)、ARANESP(促红细胞生成素α)、NEULASTA(聚乙二醇化非格司亭)、NEUMEGA(奥普瑞白介素)、NEUPOGEN(非格司亭)、NORDITROPINCARTRIDGES(促生长激素)、NOVOSEVEN(依他凝血素α)、NUTROPINAQ(促生长激素)、Oncaspar(培门冬酶)、ONTAK(地尼白介素2)、ORTHOCLONE OKT(莫罗单抗-CD3)、OVIDREL(绒膜促性腺激素α)、PEGASYS(聚乙二醇干扰素α-2a)、PROLEUKIN(阿地白介素)、PULMOZYME(去氧核糖核酸酶α)、纤溶酶原激活因子(瑞替普酶)、含有REBETOL(利巴韦林)和INTRONA(干扰素α-2b)的REBETRON联合治疗、REBIF(干扰素β-1a)、REFACTO(抗血友病因子)、REFLUDAN(重组水蛭素)、REMICADE(英夫利昔单抗)、REOPRO(阿昔单抗)ROFERON-A(干扰素α-2a)、SIMULECT(baasiliximab)、SOMAVERT(Pegivisomant)、SYNAGIS(帕利珠单抗)、Stemben(Ancestim，干细胞因子)、THYROGEN、INTRONA(干扰素α-2b)、PEG-INTRON(聚乙二醇干扰素α-2b)、XIGRIS(Drotrecoginα活化的)、XOLAIR(Omalizumab)、ZENAPAX(达克珠单抗)和ZEVALIN(替伊莫单抗)。
29.根据任何上述或下列的组合物，其中所述的蛋白是Ab-hCD22或其片段，或Ab-hCD22或其片段的变体、衍生物或修饰物；Ab-hIL4R或其片段，或Ab-hIL4R或其片段的变体、衍生物或修饰物；Ab-hOPGL或其片段，或Ab-hOPGL或其片段的变体、衍生物或修饰物；Ab-hB7RP1或其片段，或Ab-hB7RP1或其片段的变体、衍生物或修饰物。
30.根据任何上述或下列的组合物，其中所述的蛋白是Ab-hCD22或Ab-hIL4R或Ab-hOPGL或Ab-hB7RP1。
31.根据任何上述或下列的组合物，其包含蛋白和溶剂，所述的蛋白在pH4.0至5.0或pH5.0至5.5的范围内的每单位体积每pH单位的缓冲能力至少为4.0mM乙酸钠在水中的每单位体积每pH单位的缓冲能力，这种缓冲能力通过实施例1和2中所述的方法测定，其中在相同的范围内，优选以同样的方式测定，不包括所述蛋白在内的所述的组合物的每单位体积的缓冲能力等于或小于2.0mM乙酸钠在水中的每单位体积的缓冲能力。
32.根据任何上述或下列的组合物，其包含蛋白和溶剂，其中在组合物的pH下，对于组合物的pH变化加或减1pH单位的pH变化，蛋白的缓冲能力至少为1.63mEq每升，其中在组合物的pH下，对于加或减1pH单位的pH变化，所述不包括蛋白质在内的组合物的缓冲能力等于或小于0.81mEq每升。
33.一种冻干制剂，当其重建时提供任何上述或下列一种组合物。
34.一种试剂盒，其在一个或多个容器中包含含有上述或下列的组合物或冻干制剂以及有其使用的说明书。
35.制备任何上述或下列组合物或冻干制剂的方法，包括使用反离子除去残余的缓冲剂。
36.制备任何上述或下列的组合物或冻干制剂的方法，包括在反离子存在下使用下列中的一种或多种以除去残余的缓冲剂色谱、透析和/或切向流过滤。
37.制备任何上述或下列组合物或冻干制剂的方法，包括使用切向流过滤除去残余的缓冲剂。
38.制备根据任何上述或下列的组合物或冻干制剂的方法，包括对着处在在制剂的pH以下的pH下的溶液进行透析的步骤，以及，如果必要的话，其后通过加入稀酸或稀碱来调节所述的pH。
39.一种治疗患者的方法，包括以治疗有效量并且以治疗有效的途径给予患者任何上述或下列组合物，包括重建的冻干制剂。
附图的简要说明

图1描述了在pH5.0-4.0的范围内滴定数据和缓冲能力作为乙酸钠标准缓冲液浓度的函数。组A是描述当对如实施例1中所述的若干不同浓度的标准乙酸钠缓冲液进行酸滴定时pH变化的图表。pH被标示在纵坐标上。加入到每种溶液中的酸的数量以每ml溶液加入的HCl的微当量(μEq/ml)标示在横坐标之上。对于每一数据集描述了线性最小二乘方趋势线。乙酸盐浓度被标示在内插图中。组B是描述乙酸盐缓冲液在酸性pH范围内的缓冲能力，如实施例1中所述，其由组A中所述的滴定数据确定。以每ml缓冲溶液每单位pH变化酸的微当量数(μEq/ml-pH)的形式将缓冲能力标示在垂直轴上。将乙酸盐浓度以mM标示在水平轴上。
图2描述在pH5.0-5.5的范围内滴定数据和缓冲能力作为乙酸钠标准缓冲液浓度的函数。组A是如实施例2中所述的当对不同浓度的标准乙酸钠缓冲液进行碱滴定时描述pH变化的图。pH被标示在垂直轴之上。将加入到每一溶液中的碱的数量以每ml溶液加入的NaOH的微当量数(μEq/ml)标示在水平轴之上。针对每一数据集，描绘了线性最小二乘方趋势线。乙酸盐浓度被标示在内插图中。组B是描述乙酸盐缓冲液在碱性pH范围内的缓冲能力，如实施例2中所述，其由组A中所述的滴定数据确定。以每ml缓冲溶液每单位pH变化的碱的微当量数(μEq/ml-pH)的形式将缓冲能力标示在垂直轴上。将乙酸盐浓度以mM标示在水平轴上。
图3描述如实施例3中所述的乙酸盐缓冲液标准中乙酸盐浓度的测定。该图表示测定的标准曲线，其中峰面积被标示在垂直轴上，乙酸盐浓度被标示在水平轴上。将用于经验测定缓冲能力的溶液中乙酸盐的标称数量和测量数量制表在下图中。
图4是如实施例4中所述，在pH5.0-4.0范围内当对若干不同浓度的Ab-hOPGL进行酸滴定时描述pH变化的图。pH被标示在垂直轴上。将加入到溶液中的酸的数量以每ml缓冲溶液加入的HCl的微当量数(μEq/ml)的形式标示在水平轴上。针对每一数据集，描绘了线性最小二乘方趋势线。Ab-hOPGL浓度被标示在内插图中。
图5是如实施例5中所述，在pH5.0-6.0范围内当对若干不同浓度的Ab-hOPGL进行碱滴定时描述pH变化的图。pH被标示在垂直轴之上。将加入到该溶液中的碱的数量以每ml缓冲溶液加入的NaOH的微当量数(μEq/ml)的形式标示在水平轴上。针对每一数据集，描绘了线性最小二乘方趋势线。Ab-hOPGL浓度被标示在内插图中。
图6表示用于测定缓冲能力的Ab-hOPGL溶液中的残余乙酸盐含量。该图表示如实施例6中所述用于乙酸盐测定的标准曲线。将溶液中标称和试验测定的乙酸盐浓度制表在下图中。
图7是描述Ab-hOPGL加或减残余乙酸盐在pH5.0-4.0的范围内的缓冲能力。如实施例7中所述获得数据。上面的线表示具有残余乙酸盐的Ab-hOPGL的缓冲能力。底下的线表示用残余乙酸盐调节的Ab-hOPGL的缓冲能力。垂直轴标示以每ml Ab-hOPGL溶液每单位pH的酸微当量数(μEq/ml-pH)表示的缓冲能力。水平轴标示以mg/ml表示的Ab-hOPGL的浓度。如实施例1中所述的不同浓度的标准乙酸盐缓冲液的缓冲能力如水平线所示。缓冲液的浓度如上面的线所示。
图8是描述Ab-hOPGL加或减残余乙酸盐在基本的pH5.0-6.0的范围内的缓冲能力。数据如实施例8中所述获得。上面的线描述具有残余乙酸盐的Ab-hOPGL的缓冲能力。底下的线描述用残余乙酸盐调节的Ab-hOPGL的缓冲能力。垂直轴标示以每ml缓冲溶液每单位pH加入的碱的微当量数(μEq/ml-pH)表示的缓冲能力。水平轴标示以mg/ml表示的Ab-hOPGL的浓度。如实施例2中所述的若干浓度的标准乙酸钠缓冲液的缓冲能力如水平线所示。乙酸盐浓度如上面每根线所示。
图9描述，在一对图中，在自缓冲和常规缓冲制剂中pH和Ab-hOPGL的稳定性。组A描述在4℃下在6个月的时间内自缓冲Ab-hOPGL、在乙酸盐缓冲液配制的Ab-hOPGL中和在谷氨酸盐中配制的Ab-hOPGL的稳定性作为存储时间的函数。垂直轴标示以通过SE-HPLC测定的Ab-hOPGL单体的百分比表示的Ab-hOPGL的稳定性。存储时间被标示在水平轴上。组B描述在相同的时段测得的相同三种制剂的pH。蛋白质稳定性的测定和pH的测定被描述在实施例9中。
图10描述在pH5.0-4.0的范围内若干浓度的自缓冲Ab-hB7RP1制剂的滴定曲线和缓冲能力。组A显示了滴定数据。pH被标示在垂直轴上。将加入到溶液中的酸的数量以每ml缓冲溶液加入的HCl的微当量数(μEq/ml)形式标示在水平轴上。每一数据集描述线性最小二乘方趋势线。Ab-hB7RP1浓度被标示在内插图中。组B描述Ab-hB7RP1制剂的缓冲能力。上面的线显示包括残余乙酸盐的贡献的制剂的缓冲能力。底下的线显示减去残余乙酸盐的贡献后的制剂的缓冲能力，其基于如实施例3中所述的SE-HPLC测定。针对两种数据集显示了线性最小二乘方趋势线。垂直轴以每ml缓冲溶液每单位pH的酸微当量数(μEq/ml-pH)标示缓冲能力。水平轴以mg/ml形式标示Ab-hB7RP1的浓度。如实施例1中所述的若干浓度的标准乙酸钠缓冲液的缓冲能力如虚水平线所示。乙酸盐缓冲液的浓度如下每根线表示。结果如实施例10中所述获得。
图11描述在pH5.0-6.0的范围内若干浓度的自缓冲Ab-hB7RP1制剂的滴定曲线和缓冲能力。组A表示滴定数据。pH被标示在垂直轴上。将加入到溶液中的碱的数量以每ml缓冲溶液加入的NaOH的微当量数(μEq/ml)标示在水平轴之上。针对每一数据集，描绘了线性最小二乘方趋势线。Ab-hB7RP1浓度被标示在内插图中。组B描述Ab-hB7RP1制剂的缓冲能力。上面的线标示含有残余乙酸盐的制剂的缓冲能力。较低的线表示被调节以除去残余乙酸盐的贡献的制剂的缓冲能力。针对两种数据集，显示了线性最小二乘方趋势线。垂直轴标示以每ml缓冲溶液每单位pH的碱微当量数(μEq/ml-pH)表示的缓冲能力。水平轴标示以mg/ml表示的Ab-hB7RP1的浓度。如实施例2中所述的若干浓度的标准乙酸钠缓冲液的缓冲能力如虚水平线所示。乙酸盐缓冲液的浓度如上每根线表示。如实施例11中所述获得结果。
图12描述在4℃和29℃下自缓冲制剂和常规缓冲制剂中的Ab-hB7RP1稳定性。组A描述自缓冲Ab-hB7RP1、在乙酸盐缓冲剂中配制的Ab-hB7RP1和在谷氨酸盐中配制的Ab-hB7RP1的稳定性作为在4℃下在6个月内贮存的函数。垂直轴描述样品中Ab-hB7RP1单体，其通过SE-HPLC测定。时间被标示在水平轴上。组B描述相同三种制剂的稳定性作为在29℃下存储相同时间的函数。组B中的轴与组A相同。通过HPLC-SE测定蛋白的稳定性被描述在实施例12中。
图13描述在4℃和29℃下Ab-hB7RP1的自缓冲制剂中的pH稳定性。垂直轴标示pH。时间，以周为单位，被标示在水平轴之上。数据集的温度被标示在内插图中。数据是如实施例13中所述获得的。
图14描述在pH4.0至6.0范围内Ab-hCD22的自缓冲制剂的缓冲能力作为Ab-hCD22浓度的函数。组A描述在pH4.0至5.0范围内Ab-hCD22的自缓冲制剂的缓冲能力作为Ab-hCD22浓度的函数。组B描述在pH5.0至6.0范围内Ab-hCD22的自缓冲制剂的缓冲能力作为浓度的函数。在两个组中，垂直轴标示以每ml缓冲溶液每单位pH碱的微当量数(μEq/ml-pH)表示的缓冲能力，以及水平轴标示以mg/ml表示的Ab-hCD22浓度。作为参考，在两个组中如实施例1中所述的10mM乙酸钠缓冲液的缓冲能力如虚水平线所示。图中所示的结果如实施例14中所述获得。
图15描述在pH5.0-4.0的范围内若干浓度的自缓冲Ab-hIL4R制剂的滴定曲线和缓冲能力。组A显示滴定数据。pH被标示在垂直轴上。将加入到溶液中的酸的数量以每ml缓冲溶液加入的HCl微当量数(μEq/ml)标示在水平轴之上。针对每一数据集，描绘了线性最小二乘方趋势线。Ab-hIL4R浓度被标示在内插图中。组B描述Ab-hIL4R的缓冲能力作为浓度的函数。针对该数据集，显示了线性最小二乘方趋势线。垂直轴标示以每ml缓冲溶液每单位pH的碱微当量数(μEq/ml-pH)表示的缓冲能力。将Ab-hIL4R的浓度以mg/ml标示在水平轴上。如实施例1中所述的若干浓度的标准乙酸钠缓冲液的缓冲能力如虚水平线所示。乙酸盐缓冲液的浓度如上每根线所示。结果如实施例15中所述获得。
图16描述在pH5.0-6.0的范围内若干浓度的自缓冲Ab-hIL4R制剂的滴定曲线和缓冲能力。组A表示滴定数据。pH被标示在垂直轴上。将加入到溶液中的碱的数量以每ml缓冲溶液加入的NaOH的微当量数(μEq/ml)标示在水平轴上。针对每一数据集，描绘了线性最小二乘方趋势线。Ab-hIL4R浓度被标示在内插图中。组B描述Ab-hIL4R的缓冲能力作为浓度的函数。针对该数据集，显示了线性最小二乘方趋势线。垂直轴标示以每ml缓冲溶液每单位pH的碱的微当量数(μEq/ml-pH)表示的缓冲能力。将Ab-hIL4R的浓度以mg/ml标示在水平轴上。如实施例2中所述的若干浓度的标准乙酸钠缓冲液的缓冲能力如虚水平线所示。乙酸盐缓冲液的浓度如上每根线所示。结果如实施例16中所述获得。
图17描述在37℃下在Ab-hIL4R的乙酸盐缓冲制剂和自缓冲制剂中Ab-hIL4R和pH稳定性作为时间的函数。组A是显示Ab-hIL4R稳定性在四周内在37℃下的柱状图。垂直轴标示以通过SE-HPLC测定的单体Ab-hIL4R百分数表示的稳定性。水平轴标示以周为单位的存储时间。内插入图确定乙酸盐缓冲制剂和自缓冲制剂的数据的身份。组B显示对于相同条件和时间周期的相同制剂的pH稳定性。pH被标示在垂直轴上。以周为单位的存储时间被标示在水平轴上。乙酸盐缓冲制剂和自缓冲制剂的数据被标示在内插图中。数据如实施例17中所述获得。
术语 在此所使用的各种术语和措词的含义说明性地如下解释。
在此“一个”或“一种”是指“至少一个”；“一个或多个”。
除非在此另有明确说明，“约”是指20％。例如，约100在此是指80-120，约5是指4-6，约0.3是指0.24-0.36，以及约60％是指48％-72％(不是40％-80％)。
“激动剂”在此是指一种分子实体，其不同于相应的刺激性配体，但是具有相同的刺激效应。例如(虽然激动剂通过其它机理工作)，对于一种通过与相应的激素受体结合而激发活性的激素，激动剂是化学上不同的实体，其结合该激素受体并激发它的活性。
“拮抗剂”在此是指一种分子实体，其不同于相应的配体并具有一种相反的效应。例如(虽然拮抗剂通过其它机理工作)，通过与相应的激素受体结合来激发活性的激素的一个类型的拮抗剂，是一种化学个体，该化学个体不同于激素并结合激素受体，但是该化学个体不激发由激素结合产生的活性，并且通过这种作用抑制激素的效应子活性。
在此使用的“抗体”符合它在生化和生物工艺领域中的常规含义。
在抗体当中，在如在此使用的术语的含义内，是从生物源分离的那些，包括单克隆和多克隆抗体，通过重组DNA技术得到的抗体(有时在此也称为重组体抗体)，包括通过涉及激活内源性基因和涉及外源性表达构造体的表达的方法得到的那些，包括在细胞培养中获得的抗体和在转基因植物和动物中产生的那些，以及通过涉及化学合成(包括肽合成和半合成)制得的抗体。也在如在此使用的术语的范围内的，除非另有明确的说明，还有嵌合抗体和杂交抗体。
原型抗体是由两个相同的通过二硫键连接在一起的轻链-重链二聚体组成的四聚体糖蛋白。存在两种类型的脊椎动物轻链，κ和λ。每一轻链由恒定区和可变区组成。两种轻链通过恒定区序列区分。存在五种类型的脊椎动物重链α、δ、ε、γ和μ。每一重链由可变区和三个恒定区组成。所述的五种重链类型定义了五类脊椎动物抗体(同种型)IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。每一同种型分别由(a)两种α、δ、ε、γ或μ重链，和(b)两种κ或两种λ轻链组成。每一类型的重链与两种类型的轻链缔合；但是，在给定分子中的两个轻链都是κ或都是λ。IgD、IgE和IgG通常以“游离的”杂四聚体糖蛋白的形式存在。IgA和IgM通常以包含与“J”链多肽缔合的几个IgA或几个IgM杂四聚体的复合物的形式存在。一些脊椎动物同种型被分为亚类，这些亚类通过恒定区序列的差异相互区别。存在四种人IgG亚类IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，并且存在两种IgA亚类，例如，IgA1和IgA2。如上所述，所有这些及其它设有特别描述的都被包括在在此所使用的术语“抗体”的含义中。
术语“抗体”进一步包括如在此其它地方所述的任何上述氨基酸序列变体。
在此所使用的“抗体-衍生的”是指由抗体产生的任何蛋白，以及基于抗体设计的任何蛋白。该术语在它的含义内包括使用所有或部分抗体生产的蛋白，包含所有或部分抗体的那些，以及完全或部分基于所有或部分抗体设计的那些。
“抗体-衍生的”蛋白包括，但不局限于Fc、Fab和Fab2片段以及包含Fab2片段的蛋白、VH域和VL域片段以及包含这些的蛋白、包含抗体的可变区和/或恒定区的其它蛋白、整个或部分scFv细胞内抗体、最大抗体、小体、双抗体、上述的氨基酸序列变体以及各种其它这些分子，包括但不局限于在此其它地方所述的。
在此所使用的“与抗体有关的”是指任何蛋白或模拟物，其在它的结构、功能或设计方面与抗体或抗体的任何部分相似。在此使用的术语“与抗体有关的”蛋白是如上所述的“抗体衍生的”蛋白。应当注意，术语“抗体衍生的”和“与抗体有关的”大体上是重叠的；两个术语都适用于许多这样的蛋白。“与抗体有关的”蛋白的实例，在这方面在没有隐含限制的情况下，是肽抗体和受体抗体。“与抗体有关的”蛋白的其它实例在本文其它地方描述。
在此所使用的“抗体多肽”，除非另有说明，是指一种多肽，其为抗体的一部分，例如轻链多肽、重链多肽和J链多肽，仅举例说明，尤其包括其片段、衍生物和变体以及相关的多肽。
除非另有说明，“约”是指大致相同。
“结合部分”是指分子或分子的复合物的一部分，其与另一种分子或分子的复合物的一部分特异性结合。该结合部分可以是相同的或不同于与其结合的分子或分子的络合物的一部分。所述的结合部分可以是所有分子或分子的络合物。
在此使用的“特异性结合”是按照它在本领域中的常规含义，并且除非另有说明地，是指与某些特异性部分比通常其它部分更强地结合，它比可能存在于各种部分的非特异性结合更强，并且该结合对于某些部分是选择性的并且不会强到与其它部分结合的程度。在特异性结合的极端情况中，非常强的结合出现在单一类型的部分，其不存在与任何其它部分的非特异性结合。
“共同给药”是指两种或多种药剂互相一起给药，包括同时和/或顺序给药。
“同源物”在此是指互补的、配合在一起的、匹配的，例如，互相拟合的两个七巧板、锁和打开锁的钥匙的圆筒机构、酶的底物结合部位和酶的底物以及靶和特异性地结合靶的靶结合蛋白。
“同源物结合部分”在此是指彼此特异性结合的结合部分。典型地，但不是总是，它是指互相特异性结合的一对结合部分。引起特异性配体和配体受体高选择性结合的该部分提供一种同源物结合部分的说明性实例。另一实例是由结合抗原和抗体的部分提供。
“组合物”是指包含一种或多种组分的物质的任何组合物，例如一种制剂。
“由...组成”是“包含”的同义词(参见下文)。“包含”是指包括，没有进一步限定、限制或排除可能或不可能包括的东西。例如，“包含x和y的组合物”是指含有x和y的任何组合物，不管它是否还含有其它组分。同样，“一种包含x的方法”是任何方法，其中进行x，不管是否存在其它。
在此使用的“浓度”是根据在本领域中它的公知含义，是指在含有该物品的一定量的混合物中该物品的数量，典型地以比例表示。例如，溶质的浓度，例如溶液中的蛋白，可以用许多方法表示，例如(但不局限于)(A)重量％(i)＝溶质的重量/100单位的溶剂体积；(B)重量％(ii)＝溶质的重量/100单位的总重；(C)重量％(iii)＝溶质的重量/100单位的溶剂重量；(D)质量％＝溶质的质量/100质量单位的溶液；(E)摩尔分数＝溶质的摩尔数/所有组分的总摩尔数；(F)摩尔浓度＝溶质的摩尔数/每升溶液(即，溶质加溶剂)；(G)重量摩尔浓度＝溶质的摩尔数/Kg溶剂；和(H)体积摩尔浓度＝溶质的摩尔数/每升溶剂。
在此使用的“控制区域”是按照它在本领域中的公知含义，除非另有所指外，是指对控制一种或多种功能或其作用负责的DNA或蛋白中的区域。例如，“表达控制区域”在基因表达控制的背景下，是指使转录适当发生所需的DNA中的区域，并且其涉及调节啥时发生转录、发生转录的效率、啥时停止转录，等。
在此使用的“新的”是根据它在本领域中的公知含义，表示新制得的一些东西。例如，新的氨基酸序列是不来源于天然存在的氨基酸序列的一种，虽然，这样一种新的序列可能与天然存在的序列具有相似性。新的氨基酸序列例如可以通过先验设计、通过组合方法、通过选择法生成。例如，它们可以通过化学合成、通过半合成和通过各种重组DNA技术制备，所有这些对本领域熟练技术人员来说都是公知的。
在此所使用的“有害的”是指有害的。举例说明，“有害的”过程包括，例如，疾病过程的有害影响和治疗的有害副作用。
在此使用的“衍生物”是指来源于、在本质上、在形式上或在设计上，例如，基于但不同于参考多肽的多肽，通过改变它的氨基酸序列、通过与另一种多肽融合或通过共价修饰。
“疾病”是指对患者的健康有有害影响的病状、病症。
“障碍”是指有害地改变健康的疾病、病症。
在此所使用的“功能障碍”是指不同于正常过程的障碍、疾病或有害作用。
“有效量”通常是指提供所需的局部或全身效应的数量。例如，有效量是足以实现有益的或所需的临床结果的数量。所述的有效量可以在单一给药中提供或在若干给药中一起提供有效量。有效量的精确确定可能基于患者个体的因素，包括他们的大小、年龄、损伤，和/或所治疗的疾病或损伤，以及自从损伤出现或疾病开始的次数量。基于这些领域常规的考虑，本领域熟练技术人员将能确定对于给定患者的有效量。在此所使用的“有效剂量”的含义与“有效量”相同。
“有效途径”通常是指一种途径，其将试剂释放到所需的室、系统或位置。例如，一种有效途径是在所需的作用部位处提供足够实现有益的或所需的临床结果的试剂量。
在此使用的“内源性的”(例如内源性基因)是指，例如，基因和DNA的其它方面，例如控制区域，其天然存在于基因组和生物体中，除非另有说明。
在此使用的“外源性的”(例如外源性基因)，除非另有说明，通常是指，例如，来自外部来源的DNA，例如引入到细胞中并结合到它的基因组中的DNA。
“FBS”是指胎牛血清。
“制剂”是指至少一种活性组分与一种或多种其它组分的组合，用于一种或多种特定的用途，例如存储、进一步加工、销售和/或给予患者，例如，通过特定的途径，以特定数量给予患有特定疾病的患者一种特定试剂。
在此“片段”是指较大实体的一部分，例如蛋白的一部分；例如，由在少于较大多肽的整个氨基酸序列组成的多肽。在此所使用的该术语包括由末端缺失形成的片段和由内部删除形成的片段，包括那些其中多肽的两个或多个非邻接部分连接在一起而形成作为原始多肽的片段的较小的多肽的那些片段。
“融合蛋白”在此是指由两个多肽的所有或部分形成的蛋白，其可以是相同的或不同的。典型的融合蛋白是通过重组DNA技术、通过编码两个(或以上)多肽的核苷酸的末端与末端连接而制备的。
“基因工程的”在此是指使用有目的基因改变工艺产生的，例如通过重组DNA技术、遗传操作的经典方法、化学方法、所有三种的组合或其它方法产生的。
“同系物”在此是指与另一个实体具有同源性，例如和另一种蛋白同源的蛋白。同源的是指在结构和功能上类似。
“电离”在此是指物质上净电荷改变至少一个，包括失去或获得电荷，例如在低pH溶液中乙酸的电离，从HOAc到OAc-和H+。
“k”在此表示平衡系数，符合它在化学中的标准含义。
“ka”在此表示分子的特定氢的解离常数，根据它在化学中的标准含义，例如，乙酸的酸性氢的解离常数。
“kd”在此表示一对化学实体(或部分)的解离常数，符合它在化学中的标准含义。
“试剂盒”是指一起使用的许多物品的集合，以用于给定的用途或目的。
“配体”在此是指与在一个或多个其它分子实体上的一个或多个特异性位置选择性地并且化学计量地结合的分子实体。典型地，结合是非共价的，但也可以是共价的。其中一些例子是(a)抗原，其典型地与同源抗体上的结合部位非共价地结合；(b)激素，其典型地非共价地结合激素受体；(c)凝集素，其非共价地结合特异性糖；(d)生物素，其非共价地结合在卵白素以及其它卵白素状蛋白上的多个位置；(e)激素拮抗剂，其结合激素受体并抑制它们的活性和/或相应的激素的活性；和(f)激素激动剂，其类似地结合激素受体但激发它们的活性。
“配体-结合部分”在此是指分子实体，其结合配体，典型地，结合配体的较大分子实体的一个部分或由其衍生的分子实体。
“配体-结合蛋白”在此是指结合配体的蛋白。
“配体部分”在此是指一种分子实体，其以和相应的配体大致相同的方式与配体结合分子实体结合。配体部分可以是所有的配体，或来源于配体或新生成的一部分。典型地，然而，所述的配体部分或多或少不包括其与相应的配体-结合实体结合的方面在内。所述的配体部分不需要包含，并且所述的术语通常不表示，除需要配体结合的那些以外的结构特征。
“mEq”在此是指毫当量。
“μEq”在此是指微当量。“模拟物”在此是指具有另一种结构或功能特征的化学个体，通常是不相关的化学个体。例如，一类激素模拟物是非肽有机分子，其与相应的受体以与相应的激素相同的方式结合。
“mM”是指毫摩尔浓度；10-3摩尔每升。
“修饰的蛋白”，“修饰的多肽”或“修饰的片段”在此是指蛋白或多肽或者蛋白或多肽的片段，其包含除二十种天然存在的氨基酸那些以外的化学部分(结构)，所述的二十种天然存在的氨基酸形成天然存在的蛋白。修饰大多数经常是共价连接的，但是也可以是与蛋白或其它多肽，例如蛋白的片段非共价连接的。
“部分”在此是指分子实体，其体现特定的结构和/或功能，没有外来的组分。例如，在大多数情况下，仅小部分的配体-结合蛋白负责配体结合。这部分蛋白，不管是连续编码或不连续编码，是配体-结合部分的一个实例。
“天然存在的”是指存在于自然界中，没有人的干预。
“非天然存在的”是指没有存在于自然界中，或者如果存在于自然界中，但是它不处于天然存在的状态、环境、情况等等。
“PBS”是指磷酸盐缓冲的盐水。
“肽抗体”是指包含抗体Fc区域的分子(即，CH2和CH3抗体区域)，其不包括抗体CH1、CL、VH和VL区域以及Fab和F(ab)2在内，其中所述的Fc区域附着于一种或多种肽，优选药理学活性肽，特别优选随机产生的药理学活性肽。肽抗体的产生被一般性地描述在PCT公开号WO00/24782中，其于2000年5月4日公开，其在此整个引入作为参考，特别是关于肽抗体的结构、合成、性质和用途。
“肽”在此的意思与多肽相同；经常，而不是必须地，它在相对短的多肽中使用。
“pH”是根据它的公知的和通用的如下定义被使用的 pH＝-log[H3O+]. 在此所使用的“药物的”是指可以被接受用于在人或非人受试者中使用用于其治疗，特别是用于人使用，并且由被赋予了权力的制定规章的当局批准以控制其使用，例如，美国食品和药品管理局、欧洲医疗产品评价署、日本健康、劳动者和福利部或其它管理机构，例如在R.Ng，DRUGSFROM DISCOVERY TO APPROVAL，Wiley-Liss(Hoboken，NJ)(2004)中所列的那些，其在此整个引入作为参考，特别是关于与药物批准有关的管理当局，尤其是列在第7章中。在此所使用的术语″其中所述的组合物已经由在法律上被赋予了授权批准药物使用权力的当局批准用于药物使用″是指实体或机构等，其通过法律或通过法律所赋予的职责和权利以管理和批准在人体(并且在一些情况中是在非人中)中药物的使用。任何地方的任何一个这种机构作出的批准满足这种资格。它不需要批准权利机构成为处于巫术的状态的机构，例如，出现侵权。这些实体的实例包括美国食品与药品管理署和上面所列的其它机构。
在此所使用的“药物”还可以指根据优良制造实践生产的产品，例如在R.Ng，DRUGSFROM DISCOVERY TO APPROVAL，Wiley-Liss(Hoboken，NJ)(2004)中描述的那些，尤其是第9章和第10章，其在此整个引入作为参考，特别是与药物蛋白制剂的优良制造实践有关的部分，特别是如第9章和第10章中所述那样。
在此使用的“药学上可接受的”是根据它在本领域中的公知含义，表示其适用于医学或兽医用途，优选适用于人医学用途，特别是被美国食品与药品管理局或如上所述的其它权力当局批准使用的“药物”。
“多肽”参见“蛋白”。
在此使用的“前体”是根据它在本领域中的公知含义，表示其中另一个实体由其衍生的实体。例如，前体蛋白是发生加工的蛋白，例如蛋白酶解或修饰，由此产生另一种前体蛋白(其将经历其它的加工)或成熟蛋白。
在此使用的“蛋白”是指多肽或多肽的复合物，根据它在本领域中的公知含义。在此所使用的“蛋白”包括直链和分枝多肽。它包括未修饰的和修饰的多肽，包括天然存在的修饰物和没有天然出现的那些。这些修饰物包括末端的、肽骨架和氨基酸侧链的化学修饰物；氨基酸替换、删除和增加；和掺入异常氨基酸以及其它部分，仅举例这些修饰物。它还包括“工程”多肽及其络合物，例如，但不局限于，例如通过重组DNA技术、化学合成和/或共价修饰它的结构被故意改变的任何多肽或多肽的络合物，包括氨基酸序列和/或转录后修饰的故意改变。
“质子化”是指加入至少一个氢。
“自缓冲的”是指在没有其它缓冲剂的情况下，物质如药物蛋白足以抵制某个应用的pH变化的能力。
“半新的”在此是指(a)根据特定标准设计的与或由前体产生的部分，和(b)与特定标准无关的(例如只通过一般原理与非基于任何特定标准设计的)设计的部分。例如，通过在细菌表达系统中产生的第一种肽，通过化学合成产生的第二种肽，然后将该两种肽连接一起形成所述的多肽。
在此所使用的“半合成”是指合成化学方法和非化学合成方法的组合。
“受试者”是指脊椎动物，例如哺乳动物，例如人。哺乳动物包括，但不局限于，人、农场动物、运动动物和宠物。需要通过本发明的方法和/或组合物进行治疗的受试者包括患有障碍、功能障碍或疾病或其副作用或患者治疗副作用的那些。
在此使用的“基本上”是根据它的普通的和常规的定义，是指在很大程度上。例如，基本上完全的是指在很大程度上彻底的。通过进一步说明，基本上无残余是指在很大程度上没有残余。如果需要数值准确，取决于上下文，在此所使用的“基本上”是指至少80％或以上，特别是90％或以上，尤其特别95％或以上。
在此使用的“治疗有效的”是根据它在本领域中的公知含义，表示实现受试者的预后或情况的改善或达到治疗目标，包括，例如，疾病进程速率的降低，虽然患者的病症仍然继续恶化。
“治疗有效量”通常用来限定试剂的数量，包括实现改善障碍严重程度的那些数量。例如，有效的肿瘤治疗剂延长受试者的生命力，抑制与肿瘤有关的快速增殖的细胞生长，或起退化肿瘤的作用。在此所使用的术语的含义内，作为治疗有效的治疗，包括改善患者的生活质量的治疗，即使它们没有改善该疾病本身的结果。
“治疗”被广泛用于本发明中，每个此术语包括，预防、改善、抑制或治愈缺陷、功能障碍、疾病或其它有害的过程，包括干扰和/或由治疗引起的那些过程。
“变体”在此是指天然存在的或合成形式的，例如，蛋白，其结构不同于最初的但是在结构和/或功能上是相关的，例如等位变体、旁系同源物或蛋白的同源物。
发明既述 本发明第一次提供自缓冲的蛋白制剂，特别是生物药物蛋白制剂、制备所述制剂的方法以及使用所述制剂的方法。在适合于它的指定用途的浓度下，在所需的pH范围内，提供足够缓冲能力的任何蛋白可以被制备成本发明的自缓冲蛋白制剂。本发明可以用各种蛋白实施，这些蛋白包括自然存在的蛋白和“人工”蛋白，特别是如下所述的生物药物蛋白。
蛋白，特别是生物药物蛋白，将要被配制在自缓冲的组合物中，特别是以在药学上可接受的组合物中的实用性，在本发明公开之前还没有被认识。蛋白在调节生理pH中的影响已经是公知的并且有时被研究。然而，迄今为止还没有认识到，蛋白，特别是生物药物蛋白，在没有额外缓冲剂的情况下，可以具有足够的缓冲能力以维持制剂在所需的pH范围内。
在美国使用的生物药物蛋白被配制成缓冲溶液、无缓冲的溶液、无定形或晶形悬浮液和冻干制剂。
大部分缓冲溶液制剂使用常规的缓冲剂。两种蛋白，Pulmozyme和Humulin，在没有常规缓冲剂的情况下被配制成溶液。在这些蛋白中没有一种在所述的制剂中提供显著的自缓冲能力。
Pulmozyme具有约37,000道尔顿的分子量并在它的260个氨基酸中含有5个组氨酸、22个天冬氨酸和12个谷氨酸。在pH6.3的0.5个pH单位内，该蛋白的缓冲能力基本上由它的组氨酸含量确定。在此基础上，该制剂的自缓冲能力的上限由组氨酸残基的有效浓度确定，0.15mM。在形成中天冬氨酸和谷氨酸的摩尔浓度为0.9mM。因此，所有三种氨基酸的总摩尔浓度，刚好超过在该制剂浓度时的1mM。
以3.5g/ml配制蛇麻素。它具有大约6,000道尔顿的分子量并含有2个天冬氨酸、8个谷氨酸和2个组氨酸。在pH7.0-7.8的制剂中，这些氨基酸都不是特别有效的缓冲剂。在此浓度下，组氨酸的摩尔浓度，最接近该制剂pH的pKa，为1.16mM。
在使用前将生物药物冻干制剂重建溶液或悬浮液。大部分冻干制剂含有常规的缓冲剂，其维持重建的制剂的合适pH。少数其它的，其中所述的蛋白浓度是低的或pH必须是低的(小于3)或高的(大于9.5)，实际上是无缓冲的。
因此，在本发明的生物药物蛋白制剂中使用常规的缓冲剂达到缓冲作用。蛋白自身缓冲药物蛋白制剂的能力没有被完全理解，并且没有被用来制备蛋白药物。
典型地，蛋白缓冲能力的确定对开发本发明的自缓冲蛋白制剂是重要的。与此相关的，测定蛋白缓冲能力的方法和确定蛋白缓冲能力的方法被描述在下面。为了使数据具有可比性，蛋白缓冲能力必须用可比较的单位表示和/或与缓冲标准相关。因此，根据本发明，下列部分描述满足这些要求的pH计量和标准。
1.缓冲 缓冲的普遍接受的定义是当加入酸或碱时对抗组合物pH的改变。因此，缓冲能力经常被定义为组合物抵抗pH变化的能力。
典型地，用使组合物的pH变化给定量所需的强酸或碱的数量表示缓冲能力。Van Slyke提供了最通常使用的缓冲能力的定量标准，根据该标准，对于一种溶液，将缓冲能力用在温度与压力的标准条件下使1升溶液的pH改变一个pH单位所需的强酸或碱的数量来表示。
依据这种测定方法，例如，1升5mM HOAc、5mM NaOAc，pH4.76在纯水中的缓冲能力为4.09×10-3摩尔的一价强碱(即4.09×10-3当量的碱)，其可以按照如下进行计算。
溶液的汉-哈二氏方程式为 pH＝log{[5mM]NaOAc/[5mM]HOAc}+4.76 因此，增加这种缓冲所需的一价强碱的浓度X为 4.76-5.76为5.76＝log{[5mM+XmM]NaOAc/[5mM-XmM]HOAc}+4.76 因而 1.00＝log{[5mM+XmM]NaOAc/[5mM-XmM]HOAc} 10.0＝[5mM+XmM]NaOAc/[5mM-XmM]HOAc 10.0＝(5mM+XmM)/(5mM-XmM) 50mM-10XmM＝5mM+XmM 11XmM＝45mM X＝4.09mM， 其，对于1升得到 (4.09×10-3摩尔/升)(1升)(1当量/摩尔)＝4.09×10-3当量 因此，依据这种测定，含有5mM NaOAc和5mM HOAC在pH4.76在纯水中的1升10mM乙酸盐缓冲的缓冲能力是4.09×10-3当量的碱每升每pH单位。作为其它方法，溶液的缓冲能力为4.09毫当量的碱每升每pH单位、4.09微当量的碱每毫升每pH单位、0.409微当量的碱每100微升每pH单位、40.9纳摩尔的碱每10微升每pH单位以及4.09纳摩尔的碱每微升每pH单位。
相同的计算得到这种乙酸盐缓冲液的其它浓度在pH4.76的下列缓冲能力。如同上述的2mM乙酸盐缓冲液具有0.818mEq每升每pH单位的缓冲能力。在4mM下，所述的缓冲能力为1.636mEq每升每pH单位。在5mM下，所述的缓冲能力为2.045mEq每升每pH单位。在7.5mM下，所述的缓冲能力为3.068mEq每升每pH单位。在10mM下，所述的乙酸盐缓冲液具有4.091mEq每升每pH单位的缓冲能力。在15mM下，它的缓冲能力为6.136mEq每升每pH单位。
值得注意的是，在乙酸的pKa(pH4.76)下的乙酸盐缓冲溶液在乙酸和乙酸盐碱中是等摩尔的(即，在该pKa下酸和碱以等量存在)。因此，乙酸盐缓冲液在乙酸的pKa处对于加入酸和碱其抗pH改变(缓冲能力)是相同的。酸和碱平衡是缓冲剂在缓冲液中在pH等于它们的pKa处的一般特性。
在任何其它pH处，缓冲剂将含有不同数量的酸和碱形式，因此，它的抗变化(即，它的缓冲能力)当加入酸时将不会与当加入碱时它的抗变化相同。结果，最好根据下面定义这些缓冲剂的能力(i)pH降低一个单位所需的酸的数量，和(ii)pH升高一个单位所需的碱的数量。
在给定的组合物中，例如在pH标准中，在酸和碱形式之间的缓冲液中的分配，可以在任何pH和缓冲液浓度下，使用在上面描述的在处于pH4.76加或减(含有等摩尔数量的乙酸和乙酸钠)10mM NaOAc的缓冲能力中提出的方法的步骤进行计算。并且结果可以用于定义参考使用标准的缓冲能力。
因此，例如，在处于pH5.0的溶液中乙酸分配成乙酸和乙酸盐碱可以很容易地使用上述方法进行计算，并由此可以计算加入碱和酸的缓冲能力。用这种方式计算，在pH5.0至5.5范围内的10mM乙酸钠缓冲液的理论缓冲能力约为2.1mM每0.5pH单位和4.2mM每pH单位。用另一种方法计算，该缓冲液的理论缓冲能力约为4.2μEq每ml缓冲溶液每单位pH变化。类似地，在pH5.0至4.0范围内的10mM乙酸钠缓冲液的理论缓冲能力为4.9mM，按另一种方法进行计算，在给定的pH范围内4.9μEq每ml缓冲液每单位pH变化。
虽然这些计算通常在许多情况下是非常有用的，但是优选经验标准和经验测定。特别优选的经验标准是如在实施例1和2中举例说明的，在pH5.0至4.0和pH5.0至5.5范围内的乙酸钠缓冲液。尤其优选的是乙酸钠缓冲液，其中总乙酸盐浓度为，特别是，10mM，优选5mM，尤其是4mM，如本文其它地方所述。
如上所述，在pH5.0时当加入酸时比当加入碱时乙酸盐缓冲液更抗pH变化。在缓冲能力的优选经验标准中，例如这些标准乙酸盐缓冲液的缓冲能力被定义为(i)对于pH5.0至pH5.5的缓冲液对于碱滴定数据所计算的最小二乘回归线的斜率，和(ii)对于pH5.0到pH4.0的缓冲液对于酸滴定数据所计算的最小二乘回归线的斜率。标准的乙酸盐缓冲液的制备和它们的缓冲能力的测定被描述在实施例1、2和3中。应当理解，使用其它合适的缓冲剂非常相同的方法可以被用来确定和使用缓冲标准。
在测定根据本发明的自缓冲蛋白组合物的缓冲能力中，经常用在相同的pH下具有相同的缓冲能力的标准缓冲液的浓度来方便地表示缓冲能力。当使用不处在缓冲剂的pKa处的标准时，例如起初处在pH5.0的乙酸钠缓冲剂时，根据本发明，自缓冲的组合物被定义为具有等于或大于该标准的缓冲能力，如果当碱滴定时它的缓冲能力或当酸滴定时它的缓冲能力(或两者)等于或超过该标准的相应缓冲能力的话。
还应当进一步理解，根据本发明的自缓冲蛋白组合物的pH通常不会处在该自缓冲蛋白或其任何酸碱代替物的pKa处。的确，蛋白是多质子的，如在此所述，经常将具有若干取代基，每个取代基具有稍微不同的pKa，其在给定的pH范围内对它的缓冲能力有贡献。因此，本发明的自缓冲蛋白制剂的缓冲能力优选凭经验通过在该组合物的所需pH的给定的pH变化范围内酸滴定和碱滴定来确定。关于这一点，在优选的实施方案中，所述的缓冲能力通过在从该制剂的起始pH分别变化+1和-1个pH单位上单独用酸和碱滴定来确定。在特别优选的实施方案中，对于pH变化正或负0.5pH单位收集滴定数据。如实施例中所述，所述的缓冲能力是pH数据的最小二乘回归线作为在给定滴定范围内被加到组合物中的酸或碱当量的函数的斜率。
a.缓冲能力的经验测定和标准 在本发明的某些优选实施方案中，缓冲能力的量度是一种经验标准。在这方面，优选的经验标准是在具体的温度和具体的pH下水溶液的具体体积，所述的水溶液含有处在具体浓度下的具体缓冲剂并且除水之外没有其它组分，或者每种在具体浓度下含有一种或多种其它具体的组分。
用于测定根据本发明的各种方面和优选实施方案的缓冲能力的特别优选的特定标准是10mM乙酸钠pH5.00在不含其它组分的纯水中在21℃下，与在1大气压下的环境空气平衡，如实施例1和2中所述，优选用每单位体积每pH单位的当量数表示，例如μEq/ml-pH。该标准的缓冲能力应该凭经验如实施例1、2和3中所述进行测定，在此将在别的地方进一步讨论。
用于测定本发明的各种方面和优选实施方案的缓冲能力的特别优选的特定标准是10mM乙酸钠pH 4.76在不含其它组分的纯水中，在21℃与在1大气压下的周围空气平衡，如实施例1和2中所述，优选用每pH单位每单位体积的当量数表示，例如μEq/ml-pH。该标准的缓冲能力应该凭经验如实施例1、2和3中所述测定，在此将在别的地方进一步讨论。如上所述，根据汉-哈二氏方程式，此标准在pH4.76加或减1pH单位范围内的计算的缓冲能力为4.09微当量每毫升每pH单位(4.09μEq/ml-pH)。
在这方面，在根据本发明的各种方面和优选实施方案其它pH范围内，各种其它缓冲剂可以被用作标准。在这方面，参考缓冲剂是特别优选的，例如公知的和通常用于分析化学测定的那些。这些各种缓冲剂被阐述在分析化学教科书和精确测定pH和缓冲能力的专著中。
在这方面，还可以使用在本发明中的有生物缓冲剂，例如在下面文献中描述的那些TEITZ TEXTBOOK OF CLINICAL CHEMISTRY，3rdEd.Burtis and Ashwood，eds.W.B.Saunders Company，Philadelphia，PA(1999)，特别是表50-13至50-16中，在这方面，关于缓冲剂和它们周作pH和/或本发明的缓冲能力标准，其在此整个引入作为参考；THETOOLS OF BIOCHEMISTRY，Terrance G.Cooper，John Wiley & Sons，New York，NY(1977)，特别是第1章，第1-35页，关于缓冲剂及其它们用作本发明的pH和缓冲能力标准，其在此整个被引入作为参考，最特别是表1-3、1-4和1-5及其相关文字部分，以及PROTEIN PURIFICATIONPRINCIPLES AND PRACTICE，3rd Ed.Robert K.Scopes，Springer-Verlag，New York，NY(1994)，特别是第160-164页，尤其是其中表6.4和6.5及其相关文字，第12章，第3节，第324-333页，尤其是其中表12-4和12-5及其相关文字，以及所有的附录C在蛋白质化学中使用的缓冲剂，关于缓冲剂及其它们在本发明的用途，其在此整个被引入作为参考。
由于一些溶解在水中的气体与OH-和/或H3O+反应，然而，凭经验测定的标准溶液的缓冲能力可以与理论值有某种改变。因此，标准的定义要求溶液在1大气压的压力下与大气压相平衡。此外，缓冲标准还必须被保持在并且仅与不会改变它的组成或它的缓冲能力的物质接触，例如滤出酸、碱或其它反应物的那些，其可能改变乙酸盐缓冲液的有效浓度或活性，并以任何方式改变它的缓冲能力。考虑到上述两者的大气平衡和容器的惰性，标准的缓冲能力将直接和线性地与它的体积成比例。因此，100ml的缓冲能力将为1.00升的1/10，10ml的缓冲能力将为1.00升的1/100。因此，可以方便地对标准的体积进行调节，然后根据意愿将其归一化至1升。
要制备上述10mM乙酸盐缓冲能力标准用于现场应用并不总是方便的。然而，使用各种其它缓冲剂可以制备各种其它缓冲能力标准并以相同的方式用作乙酸盐缓冲液。条件只要是该缓冲标准被适当地制备，可以采用如上所述的乙酸盐缓冲标准来校准它们，然后将它们用于该领域。然后，在没有实质性偏差或误差的情况下，可以用上述乙酸盐标准表示由这些可供选择的标准所获得的结果。
也可以通过计算对这些可供选择的标准的缓冲能力进行校准。为了这样做，该可供选择的标准的缓冲能力被直接测定并用每单位体积每单位pH的mEq表示。然后，使用在可供选择的标准和乙酸盐标准之间的用mEq每单位体积每单位pH表示的缓冲能力的比例，可以将基于可供选择的标准的测定归一化为乙酸盐标准。
使用这些通常在计量中用于涉及回到参考标准的领域标准的方法，如上所述的乙酸盐缓冲标准提供了一种轻便的、可度量的、可靠的和精确的参考，用于测定任何组合物的缓冲能力，可以容易地将所述的任何组合物与使用类似方法针对其它组合物所做的不同的测定相比。
b.缓冲能力标准的制备 可以使用分析化学的公认方法来制备缓冲能力标准。例如参见，ANALYTICAL CHEMISTRY，3rd Ed.Douglas A.Skoog和Donald M.West，Holt，Rinehart and Winston，New York(1979)，特别是第9章(第186-226页)，第10章(第227-233页)，以及描述在第583-588页上的方法；TEITZ TEXTBOOK OF CLINICAL CHEMISTRY，3rd Ed.Burtis和Ashwood，eds.W.B.Saunders Company，Philadelphia，PA(1999)，特别是第1章关于制备和校准缓冲液的一般实验技术和表50-13至50-16；THETOOLS OF BIOCHEMISTRY，Terrance G.Cooper，John Wiley & Sons，New York，NY(1977)，特别是第1章，第1-35页，和表1-3，1-4和1-5及其相关文字；PROTEIN PURIFICATION PRINCIPLES AND PRACTICE，3rd Ed.Robert K.Scopes，Springer-Verlag，New York，NY(1994)，特别是第160-164页，尤其是其中表6.4和6.5及其相关文字，第12章，第3节，第324-333页，尤其是其中表12-4和12-5及其相关文字，以及所有的附录C在蛋白质化学中使用的缓冲液；和REMINGTONTHESCIENCE AND PRACTICE OF PHARMACY，21st Ed.Beringer et al.Editors，Lippincott，Williams & Wilkins，Philadelphia，PA(2005)，特别是关于缓冲剂、缓冲液、缓冲能力等的部分； 其每个在此整个被引入作为参考，特别是关于本发明的缓冲液和缓冲能力标准品的制备和使用。
制备缓冲能力标准所使用的水应该是非常纯的，优选I型水，例如milliQ水或三次蒸馏水。所述的缓冲试剂应该是纯的，特别是其没有任何可能改变标准溶液的pH或缓冲能力的物质，例如适合分析化学分析使用的标准级或ACS试剂级试剂，特别是如上述参考文献TEITZ和REMINGTON中所述，其在此被整个引入作为参考，特别是关于分析级水和试剂的部分。
缓冲剂的准确组成必须是被很好地确定的。缓冲剂的分子量对于每个缓冲剂来说是准确已知的。该分子量对于将要使用的试剂来说必须是准确的，并且必须包括加合物的重量例如存在于试剂中的水合物的重量。对于每种缓冲剂，每分子中氢供体或氢受体的有效数必须是准确已知的。不同形式，例如水合物的比例分配，对于含有这些形式的混合物的每种试剂来说必须是已知的。液体缓冲剂的浓度必须是准确已知的，优选以摩尔/体积和摩尔/质量(例如，摩尔/升和摩尔/gm或kg的形式。必须对吸湿剂进行干燥以除去水分，这样试剂可以被准确地称重。
一般而言，由试剂的公认卖主提供的信息和标准级化学试剂对于制备如上所述的缓冲能力标准品是足够准确的。通常在分析化学中使用的公知标准技术可以被用于干燥“吸湿试剂”，以便它们可以被准确地称重。
如在此所述，可以使用公知的和通常使用的分析化学方法以制备和校准酸和碱溶液，例如对于标准溶液和样品蛋白溶液缓冲能力的滴定，使用1N HCl和1N NaOH(仅举此两例)以确定缓冲能力。人们注意到，应该这样制备用于滴定的NaOH溶液，以便消除由某些溶解气体与碱性溶液相互作用而产生的不准确以及它们的溶解所引起的改变的pH影响。例如参见上述关于缓冲液和缓冲液标准品的制备和校准的Skoog和West(1979)以及其它参考文献，其在此整个引入作为参考，特别是如上所述与制备滴定标准溶液有关的部分。
c.缓冲能力的经验测量 用来确定缓冲能力的标准品和样品的滴定可以使用公知的常用方法进行。滴定可以手工进行，也可以使用自动滴定仪进行。在这方面，适合在本发明中使用的各式各样的自动滴定仪购自许多卖主。在这方面，适合在本发明中使用的方法是与在上面所述的参考文献中所述的关于制备和校准缓冲液标准品的那些相同的，其每个在此被整个引入作为参考，特别是关于已知和未知溶液滴定以确定它们的缓冲能力的部分。
2.被蛋白缓冲和蛋白缓冲能力 a.蛋白氢平衡和缓冲能力的测定 蛋白总含有许多酸性和碱性组分。因此，蛋白的氢离子平衡是高度复杂的。事实上，在给定环境中，关于蛋白氢离子平衡的完整的描述超出了电流理论和计算方法的范围。因此，蛋白缓冲能力的经验测量是优选的。为蛋白氢平衡所开发的精确经验测量的方法，其可以并且通常被本领域熟练技术人员使用，是适用于测定与本发明的自缓冲蛋白制剂的开展有关的蛋白的缓冲性能。因此，本发明的蛋白的pH滴定曲线可以按照公知方法进行测定，例如Tanford及其同事在核糖核酸酶上进行的pH滴定研究所述的和举例说明的那些。参见C.Tanford，“Hydrogen IonTitration Curves of Proteins，”在T.Shedlovsky(ed.)，ELECTROCHEMISTRY IN BIOLOGY AND MEDICINE中，John Wileyand Sons，New York，1955，Ch.13，C.Tanford和J.D.Hauenstein，J.Am.Chem.Soc.78，5287(1956)，C.Tanford，PHYSICAL CHEMISTRY OFMACROMOLECULES，John Wiley and Sons，New York，1961，特别是第554-567页，所有在此加入作为参考，特别是与蛋白的氢离子滴定有关的以及与蛋白的缓冲作用和缓冲能力的测定有关的部分。
但是，本发明不需要这些精确的测定，例如在上述参考文献中所述的那些。相反，本发明蛋白的缓冲性能和缓冲能力可以使用标准参考文献分析化学和生物化学中所述的方法确定，例如，上面所引用的Skoog(1979)，Cooper(1977)和Scopes(1994)，其每个在此整个引入作为参考，特别是滴定曲线的经验测定，特别是根据本发明在给定pH范围内蛋白的经验测定。
在下面的实施例中，本发明的滴定曲线和缓冲能力的确定被详细描述在许多乙酸盐缓冲液和各种药物蛋白中。因此，在给定制剂中的关心的特定有限的pH范围内，蛋白的pH滴定曲线可以凭经验按照如上述参考文献中所述的这些方法测定。在许多方面，这些方法与分析化学中用于滴定小分子例如乙酸盐缓冲液(如实施例中所述)使用的那些相同。但是，在操作蛋白以保持有效制剂所需的结构和功能的情况下，必须更加小心。
蛋白滴定可以手工或使用自动滴定仪进行。用于手工滴定的仪器和自动滴定仪容易地可以从许多供应商和卖主处获得。在实施例中举例说明了适合于测定pH滴定曲线和蛋白的缓冲能力的方法，参考乙酸盐缓冲标准的滴定和在指定pH范围内若干不同治疗蛋白的滴定。可以使用这些方法以测定本发明的任何其它蛋白的氢电离性能和缓冲能力。
本发明的一种具体的方面是测定作为溶液中浓度函数的蛋白的缓冲能力。在这方面的一种优选方法中，制备一系列等级系列浓度的给定蛋白的溶液。在使人感兴趣的pH范围内，测定每一浓度下蛋白的pH滴定曲线。优选地，使用碱滴定和酸滴定同时测定关心范围的滴定曲线。在某些优选实施方案中，将加入的酸或碱的当量数对每一溶液的测定的pH绘在图上。典型地，对于约0.5-1.0pH单位的范围，每一浓度的滴定数据非常接近一条直线，优选通过最小二乘回归分析进行确定。在这方面的优选实施方案中，每一浓度下的蛋白的缓冲能力等于回归线的斜率，用每pH单位每ml当量的单位(或其馏分)表示。在这方面，在本发明中还使用蛋白的缓冲能力及其浓度之间的关系。在某些优选实施方案中，这种关系通过对缓冲能力数据的最佳直线拟合进行最小二乘回归分析来确定，所述的缓冲能力数据按照上述缓冲能力对蛋白浓度的绘图确定。
本发明蛋白缓冲能力的经验数据优选与标准乙酸盐缓冲液的缓冲能力有关。即，在这方面的本发明特别优选实施方案中，在给定浓度下在给定制剂中的给定蛋白的缓冲能力，如上确定，其等于具有相同缓冲能力的标准乙酸盐缓冲液的浓度。
虽然如在此所述的经验测定通常是配制本发明的各种方面和优选实施方案的自缓冲组合物的一种重要的方面，但是如下所述的理论和计算方法也可以被有效地使用以指导这些组合物的设计、制造和使用(与经验测定结合)。
b.蛋白氢离子平衡和缓冲能力的预测 蛋白中氢的电离是复杂的，但是可以大体上分解到pH范围内，所述的pH范围由氨基酸侧链和末端氨基和羧基的能电离的氢所限定。多肽中末端羟基的pKa典型地为3.1左右。天冬氨酸和谷氨酸的侧链中的酸性氢的pKa范围为4.4左右。多肽中组氨酸的pKa范围为6.0左右。末端氨基氢电离pKa的典型范围为7.5左右。半胱氨酸中巯基的pKa范围为8.5左右。酪氨酸羟基和赖氨酸胺两者具有的pKa范围在10左右。精氨酸的pKa范围在12左右。
构象折叠典型地将在极性溶剂中的大的多肽和蛋白分配到暴露的溶剂-可进人区域中以及几乎没有与周围环境接触的近乎非极性中心区域。折叠在这两个端值之间产生许多环境。此外，在蛋白中给定氨基酸侧链周围的小环境典型地受一种或多种下面因素的影响溶剂效应；离子的结合；螯合；络合；与辅因子结合；以及翻译后修饰；仅举几种可能性。这些中间的每一个可能影响蛋白中给定氨基酸电离的pKa。因此，给定蛋白中特异性残基的pKa可以与游离氨基酸的pKa相比有戏剧性的变化。
的确，被蛋白中氨基酸的小环境扰动的pKa已经被用于研究蛋白的折叠和折叠蛋白中特异性氨基酸的分布和电荷状况。由Tanford及其它人报道的蛋白滴定曲线是复杂的，其共有具有一些宽的特征。典型地，仅仅解释了滴定曲线中的一些可电离的质子。其它显然地位于核中并不能接近溶剂。可以在一些情况中被检测到的相同类型的个体侧链的pKa可能彼此相互不同。但是，虽然是可检测地不同的，它们的pKa通常接近于游离氨基酸的pKa。
蛋白的最强缓冲作用通常不发生在等电点，这一点可能被错误地假定了。事实上，缓冲取决于氨基酸侧链氢和末端氢，因此如上所述，发生在游离氨基酸中的可电离氢的pKa的范围内。对于配制蛋白的组合物，尤其是在弱酸性pH(pH4-6)下更可溶的和/或更稳定的某些药物蛋白的组合物，这些中最重要的是发生在氨基酸天冬氨酸和谷氨酸的羧基氢的pKa即pH4.0-5.5，特别是约4.5范围内的缓冲作用。
有多种方法可用于有效估计给定蛋白在给定溶液中在给定pH下的缓冲能力。这些方法包括高度技术和复杂的计算机模型以及可以在手动计算器上进行的那些。这些方法中没有一个是彻底的或完全准确的；但是，它们在有些情况下可以提供有用的估计。
例如，在有些情况下，基于它的氨基酸组成，可以计算溶液中蛋白的缓冲能力的潜在有用的概念，末端氨基和羧基以及氨基酸侧氢供体和受体的pKa(在所述的溶剂中)、蛋白的浓度和溶液的pH。
例如，在在谷氨酸(作为游离氨基酸)的侧链羧基氢的pKa的pH范围内，对蛋白的潜在有用的缓冲能力的估计，可以由蛋白的分子量和它含有的谷氨酸残基的数目来获得。前者除以后者提供每当量谷氨酸的重量，并因此得到在谷氨酸的pKa下每当量可电离氢的重量。由于谷氨酸和天冬氨酸侧链羧基具有几乎相同的pKa，这两者的计算结果应该加在一起得到在约它们pKa周围范围内的估计的缓冲能力。在pKa下，溶液中蛋白的估计缓冲能力可以由溶液中蛋白的浓度和刚才提供的内因子计算而得，所述的内因子即为每当量的可电离氢的重量。该浓度除以每当量的重量得到估计的缓冲能力，其单位为Eq/体积。这些估计经常太高，由于一些残基通常被掩蔽在不易被溶剂到达的蛋白区域中，因此，对它的实际缓冲能力没有贡献。在某些情况中，这可能用于解释对缓冲能力的掩蔽作用。例如，可以使用反映掩蔽的理论或经验估计值的分数系数来修正最初的计算。
按照在本文其它地方所述的方法，这些计算通常是较少有用的，并且比经验测定蛋白的缓冲能力具有更低的准确性。但是它们可以用于提供对溶液中蛋白的缓冲能力的粗略的最大估计。
3.蛋白质 在本文中公开的本发明可以采用任何蛋白进行，所述的蛋白在所需的pH范围内在所需制剂所需的蛋白浓度等的参数内提供足够的缓冲能力。在这方面，在优选的蛋白当中是用于兽医和/或人治疗用途的药物蛋白，特别是人治疗用途的蛋白。同样，在优选的蛋白当中是可溶于含水溶液的蛋白，特别是在相对高浓度下可溶的那些以及较长时间稳定的那些。此外，优选的蛋白是具有比较高数目的溶剂易受影响的氨基酸的那些，其中侧链氢电离常数接近所需缓冲作用的pH。
此外，本发明的优选蛋白是用于药物制剂的蛋白，其在给予患者后没有诱导非常有害的抗原反应。在这方面，在优选的蛋白是用于兽医和/或人医学用途的蛋白，特别是关于人医学用途，人性化的蛋白和人蛋白。
本发明的优选蛋白是与特定靶标特异性结合的蛋白，包括配体-结合蛋白和蛋白配体。在这方面，抗原-结合蛋白、由其衍生的蛋白和与其有关的蛋白是本发明的特别优选实施方案。在这方面，本发明的高度优选的蛋白是抗体和来源于抗体或掺入了抗体的蛋白、整个或部分，包括，但不限于这样的实体单克隆抗体、多克隆抗体、基因工程抗体、杂合体抗体、双特异性抗体、单链抗体、遗传改变的抗体(包括具有一个或多个氨基酸取代、加入和/或删除的抗体(抗体突变蛋白))、嵌合抗体、抗体衍生物、抗体片段，其可以来自任何上述并且还可以是其类似地加工或修饰的衍生物、包含抗体或来源于抗体或来源于抗体片段的部分的融合蛋白，其可以是任何上述或其修饰物或衍生物，包含抗体或来源于抗体部分的缀合物，包括任何上述或其修饰物或衍生物以及化学修饰抗体、抗体片段、抗体融合蛋白等，包括所有上述。
a.抗体、抗体衍生的和与抗体有关的蛋白等 本发明的特别优选的蛋白是抗体多肽，例如重链和轻链多肽，其具有那些与出现在和构成自然存在的抗体相同的氨基酸序列，例如存在于血清和抗血清中的那些，包括这些多肽和从天然源中分离得到的蛋白以及如下制得的那些通过杂交瘤技术、通过激活内源性基因(通过同源的或非同源重组，例如)、通过在内源性转录控制区域控制下外源基因表达、通过外源性表达构造表达、通过半合成以及通过从头合成，通常用于制备抗体和与抗体相关的多肽和可以用于产生抗体多肽和蛋白的蛋白的一些技术。
在这些当中包括与抗体有关的多肽和蛋白是整个或部分具有新氨基酸序列的那些、包含抗体的所有部分或一个或多个部分(即具有与天然存在的抗体多肽的氨基酸序列中的任何四个或以上的残基相同序列的氨基酸的连续链)的那些、具有以某种方式与天然存在的抗体匹配但是在其他方面不同的氨基酸序列的那些、具有与天然存在的对应物或其有关序列相同的但不同的氨基酸序列，但在一个或多个翻译后修饰中不同于对应物的那些，以及部分地由与一个或多个多肽区域稠合的上述任何构成的那些(在部分或整个中)，所述的一个或多个多肽区域可以是或来源于或与第二种不同的抗体多肽相关，并且可以是或来源于任何其它多肽或蛋白，不管是否天然存在的、与其类似但不同的，具有半新的氨基酸序列和/或新的序列。这些杂交体通常在此被称为融合多肽和/或融合蛋白。
在本文中所述的本发明的优选蛋白是按照上述所有的修饰蛋白。这些修饰蛋白是通过非共价键、共价键或共价键和非共价键化学修饰的蛋白。还包括进一步包含一个或多个翻译后修饰的上述所有，这种修饰可以通过细胞修饰系统或通过酶和/或化学方法体外引入的或以其它方式引入修饰来进行。
在这方面，本发明的优选蛋白是Fab片段，例如通过用某些蛋白酶裂解典型的二聚(LH)2抗体而产生的那些，所述的某些蛋白酶完整地保留轻链而裂解在可变区和相邻恒定区的重链、“上面的”将重链结合一起的二硫键。这种裂解释放一种Fc片段，所述的Fc片段包含连接在一起的重链的剩余部分，两个二聚的Fab片段每个包含完整的轻链和重链的可变区。Fab片段也可以通过其它技术生产，所述的其它技术不需要分离天然存在的抗体和/或用蛋白酶裂解。
还优选的是Fab2片段，例如以如Fab片段几乎相同方式产生的，使用裂解“之间或下面的″二硫键的蛋白酶。因此，两个Fab片段通过二硫键被保持在一起，并以单个Fab2片段的形式被释放。Fab2片段可以通过许多其它技术产生，包括不需要分离完整抗体或用具有所需专一性的蛋白酶裂解的那些技术。此外，现在，两个单-和二-特异性Fab2片段可以通过各种常规技术来制备。
在这方面，还优选的蛋白是Fab3片段，其是工程化的抗体片段，其中三个Fab片段被连接在一起。Fab3片段可以是单-、双-或三-特异性的。它们可以通过本领域熟练技术人员公知的各种方法进行制备。
在这方面，其中其它优选的蛋白是Fc片段，例如通过用蛋白酶以与用来产生Fab片段或Fab2片段的同样方式裂解产生的那些片段。然而，对于Fc片段的产生，含有片段的二聚重链而不是含有片段的轻链被分离。Fc片段缺少抗原结合部位，但包含在涉及抗体的生理学过程中起作用的效应子区域。Fc片段可以通过本领域熟练技术人员公知的和通常使用的各种技术来产生。
在这方面，优选的蛋白是单链可变片段(“scFv”)。scFv是融合蛋白，它是通过将免疫球蛋白的重链和轻链的可变区连接而制备的。在scFv中所述的重链和轻链典型地通过短丝氨酸、甘氨酸连接子连接。scFv具有与衍生出的抗体相同的专一性。最初通过噬菌体展示产生，scfv目前可以通过各种公知方法制备。
还优选的是双-scFv，其是两个scFv的融合。双-scFv可以是单-特异性的或二-特异性的。各种方法是公知的并可以在制备本发明的双-scFv中使用。
在这方面，本发明还优选的是小体；单-特异性抗体和二-特异性双抗体；单-、二-和三-特异性的三抗体；单-、二-、三-和四-特异性的四抗体；VhH域；V-NAR域；VH域；VL域；骆驼Igs；Ig NARs；及其他。
在这些以及其它方面中，根据本发明的各种方面和优选实施方案是蛋白，其包含抗体的一种或多种CDR和/或CDR-衍生的和/或与CDR-相关的区域或抗体的一个或多个FR和/或FR-衍生的和/或与FR-相关的区域。在这方面，CDR是指互补决定区；即，抗体的轻链或重链的高可变区，典型地为约9-12个氨基酸长度，其通常是抗体的抗原特异性结合部分的一个重要部分。在这方面，FR是指抗体的框架区；即，约15-20个氨基酸的区域，所述的氨基酸在抗体的抗原特异性结合部分中分离CDR。术语CDR-衍生的和与CDR-相关的以及术语FR-衍生的和与FR-相关的分别具有与CDR和FR相同的含义，如在上面词汇中关于术语抗体-衍生的和与抗体-相关的针对术语抗体阐述的那样。
根据在此公开的本发明的上述和其它方面，关于抗体、抗体衍生的和与抗体相关的蛋白，例如，参见，Protein EngineeringPrinciples andPractice，Jeffrey L.Cleland and Chares S.Craik，eds.Wiley-Liss，Inc.NewYork(1996)，特别是其中Kelley，Robert F.“Engineering TherapeuticAntibodies，”Chapter 15，pp.399-434 and Hollinger，P.& Hudson，P.“Engineered antibody fragments and the rise of single domains，”NatureBiotechnology，September 2005，1126-1136，其每个在此被整个引入作为参考，特别是与抗体的结构和工程化有关的部分，特别是生物药物抗体以及抗体衍生的和与抗体相关的蛋白，特别是根据本发明在此所述的抗体-衍生的和与抗体相关的药物蛋白。
关于所有上文，本发明特别优选的是人、人化的以及其它蛋白，当给予人时其不产生显著有害的免疫反应。本发明还优选的是根据所有上文的蛋白，当给药非人时，其类似地不引起显著有害的免疫反应。
在这方面，根据本发明的尤其特别优选的蛋白是融合蛋白，其包含抗体和/或抗体-衍生的蛋白、多肽或片段等等，包括所有如上所述的那些。在这方面，本发明的尤其特别优选的融合蛋白是融合蛋白，其包含抗体或抗体-衍生的蛋白或片段，例如如上所述的那些和配体-结合部分，例如在此所述的举例说明地描述那些。
b.靶结合蛋白 在这方面，同样在本发明的优选蛋白当中的是抗体以及其它类型的靶结合蛋白以及与其相关的蛋白或从其衍生出的蛋白，以及蛋白配体和由其衍生或与其相关的蛋白。在这方面，在尤其优选的配体-结合蛋白当中有结合信号蛋白和效应子蛋白的蛋白以及与其相关或由其衍生的蛋白。
在这些结合蛋白当中，包括抗体，包括由其衍生的蛋白以及与其相关的蛋白，是与下列一种或多种(单独或任何组合)结合的那些蛋白 (i)CD蛋白，包括但不局限于CD3、CD4、CD8、CD19、CD20和CD34； (ii)HER受体家族蛋白，包括，例如，HER2、HER3、HER4和EGF受体； (iii)细胞粘附分子，例如，LFA-1、Mol、p150、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM和αv/β3整联蛋白； (iv)生长因子，包括，但不局限于，例如，血管内皮细胞生长因子(“VEGF”)；生长激素、促甲状腺激素、促卵泡激素、促黄体生成激素、生长激素释放因子、甲状旁腺素、副中肾管抑制物质、人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)、红细胞生成素(EPO)、神经生长因子，例如NGF-β、血小板衍生生长因子(PDGF)、成纤维细胞生长因子，包括，例如，aFGF和bFGF，表皮生长因子(EGF)、转化生长因子(TGF)，其中包括，TGF-α和TGF-β，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4或TGF-β5、胰岛素样生长因子-I和-II(IGF-I和IGF-II)、脱(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)和骨诱导因子； (v)胰岛素和胰岛素相关的蛋白，包括，但不局限于胰岛素、胰岛素A-链、胰岛素B-链、胰岛素原和胰岛素样生长因子结合蛋白； (vi)凝固蛋白和与凝固有关的蛋白，例如，其中有因子VIII、组织因子、假血友病因子、蛋白C、α-1-抗胰蛋白酶、纤维蛋白溶酶原活化因子，例如尿激酶和组织纤溶酶原激活物(“t-PA”)、邦巴辛毛葛、凝血酶和促血小板生成素； (vii)克隆刺激因子(CSFs)，其中包括下列M-CSF、GM-CSF和G-CSF； (viii)其它血液和血清蛋白，包括，但不局限于白蛋白、IgE和血型抗原； (ix)受体和与受体有关的蛋白，包括，例如，flk2/flt3受体、肥胖症(OB)受体、生长激素受体和T-细胞受体； (x)神经营养因子，包括，但不局限于，骨衍生的神经营养因子(BDNF)和神经营养蛋白-3、-4、-5或-6(NT-3、NT-4、NT-5或NT-6)； (xi)松弛肽A-链、松弛肽B-链和松驰素原； (xii)干扰素，包括例如，干扰素-α、-β、和-γ； (xiii)白细胞介素(ILs)，例如，IL-1至IL-10； (xiv)病毒抗原，包括但不局限于AIDS包膜病毒抗原； (xv)脂蛋白、降钙素、胰高血糖素、心钠素、肺表面活性剂、肿瘤坏死因子-α和-β、脑啡肽酶、RANTES(通常在T-细胞表达和分泌被激活时被调节)、小鼠促性腺激素有关的肽、DNA酶、抑制素，和activin； (xvi)整联蛋白、蛋白A或D、类风湿因子、免疫毒素、骨形态发生蛋白(BMP)、超氧化物歧化酶、表面膜蛋白、衰变加速因子(DAF)、AIDS包膜、转运蛋白、归巢受体、地址素、调节蛋白、免疫粘附素，抗体；和 (xvii)生物学活性片段或上面的任何变体。
关于所有上文，特别优选的是作为有效的治疗剂的那些，特别是通过结合靶而发挥作用的那些，特别是在上来所列的靶，包括由其衍生的靶、与其相关的靶以及其修饰。
c.具体的举例说明的蛋白 在具体的举例说明的蛋白当中有某些抗体和与抗体相关的蛋白，包括肽抗体，例如，在下表以及其它地方所列的那些 OPGL特异性抗体和肽抗体等(也称为RANKL特异性抗体、肽抗体等)，包括完全人性化的和人OPGL特异性抗体，特别是完全人性化的单克隆抗体，包括，但不局限于在国际公开号WO 03/WO 03/002713中所述的抗体，关于OPGL特异性抗体和与抗体有关的蛋白，其在此整个引入，特别是具有在此所述序列集的那些，特别是，但不局限于，在其中用下列符号表示的那些9H7；18B2；2D8；2E11；16E1；和22B3，包括具有如图2中所述的SEQ ID NO2轻链和/或如图4中所述的SEQ IDNO4的重链的OPGL特异性抗体，其每个分别地和具体地在此整个被引入作为参考，如同上面出版物中完全公开那样。在pH 4.5至5.0以及5.0至5.5范围内，对OPGL特异性抗体(“Ab-hOPGL”)的酸和碱滴定被描述在下面的实施例中。在这些pH范围内，Ab-hOPGL的缓冲能力的计算也被描述在下面的实施例中。
肌肉抑制素结合剂或肽抗体，包括肌肉抑制素特异性肽抗体，特别是在美国申请公开号2004/0181033中所述的那些，其在此整个引入作为参考，特别是与肌肉抑制素特异性肽抗体有关的部分，包括，但不局限于mTN8-19家族的肽抗体，包括SEQ ID NOS305-351的那些，包括TN8-19-1至TN8-19-40、TN8-19con1和TN8-19con2；SEQ ID NOS357-383的mL2家族的肽抗体；SEQ ID NOS384-409的mL15家族；SEQ ID NOS410-438的mL17家族；SEQ ID NOS439-446的mL20家族；SEQ ID NOS447-452的mL21家族；SEQ ID NOS453-454的mL24家族；以及SEQ ID NOS615-631的那些，其每个分别地和具体地在此被整个引入作为参考，如完全在上述出版物中公开的那样。
IL-4受体特异性抗体，特别是抑制通过IL-4和/或IL-13与受体的结合而节导的活性的那些抗体，包括在国际申请号PCT/US2004/03742的国际公开号WO 2005/047331中所述的那些，其在此整个引入作为参考，特别是与IL-4受体特异性抗体有关的部分，特别是如在此所述的这些抗体，但不限于，在本文中指出的那些L1H1；L1H2；L1H3；L1H4；L1H5；L1H6；L1H7；L1H8；L1H9；L1H10；L1H11；L2H1；L2H2；L2H3；L2H4；L2H5；L2H6；L2H7；L2H8；L2H9；L2H10；L2H11；L2H12；L213；L2H14；L3H1；L4H1；L5H1；L6H1，其每个分别地和具体地在此被整个引入作为参考，如完全在上述出版物中公开的那样。在4.5至5.0以及5.0至5.5的pH范围内的酸和碱滴定以及IL-4受体特异性抗体(“Ab-hIL4R”)在此范围内缓冲能力的计算被描述在下面的实施例中。
白细胞介素1-受体1(″IL1-R1″)特异性抗体、肽抗体和有关的蛋白等，包括，但不局限于在美国申请公开号US2004/09771 2A1中所述的那些，其在此整个引入作为参考，特别是与IL1-R1特异性结合蛋白、单克隆抗体有关的部分，特别是但不限于在本文中称为如下的那些15CA、26F5、27F2、24E12和10H7，其每个分别地和具体地在此被整个引入作为参考，如完全在上述美国申请公开出版物中公开的那样。
Ang2特异性抗体和肽抗体和有关的蛋白等包括但不局限于在国际公开号WO 03/057134和美国申请公开号US2003/0229023中所述的那些，其每个在此被整个引入作为参考，特别是与Ang2特异性抗体和肽抗体等有关的部分，尤其是在那里所述的序列的那些，并且包括，但不局限于L1(N)；L1(N)WT；L1(N)1K WT；2xL1(N)；2xL1(N)WT；Con4(N)，Con4(N)1K WT，2xCon4(N)1K；L1(C)；L1(C)1K；2xL1(C)；Con4(C)；Con4(C)1K；2xCon4(C)1K；Con4-L1(N)；Con4-L1(C)；TN-12-9(N)；C17(N)；TN8-8(N)；TN8-14(N)；Con 1(N)，还包括抗-Ang 2抗体和制剂，例如在国际公开号WO 2003/030833中所述的那些，其在此被整个引入作为参考，特别是Ab526；Ab528；Ab531；Ab533；Ab535；Ab536；Ab537；Ab540；Ab543；Ab544；Ab545；Ab546；A551；Ab553；Ab555；Ab558；Ab559；Ab565；AbF1AbFD；AbFE；AbFJ；AbFK；AbG1D4；AbGC1E8；AbH1C12；Ab1A1；Ab1F；Ab1KAb1P和Ab1P，他们的各种排列如在那里所述，其每个分别地和具体地在此被整个引入作为参考，如上述出版物中公开的那样。
NGF特异性抗体，包括，特别是，但不局限于在美国申请公开号US2005/0074821中所述的那些，其在此整个引入作为参考，特别是关于NGF-特异性抗体和有关蛋白，特别地，包括但不限于，在此被称为4D4、4G6、6H9、7H2、14D10和14D11的NGF-特异性抗体，其每个分别地和具体地在此被整个引入作为参考，如完全在上述出版物中公开的那样。
CD22特异性抗体和相关蛋白，例如在US 5,789,554中所述的那些，关于CD22特异性抗体和相关蛋白，其在此整个引入作为参考，特别是人CD22特异性抗体，例如但不局限于人化和完全人抗体，包括，但不局限于人化和完全人单克隆抗体，特别包括，但不局限于人CD22特异性IgG抗体，例如，与人-小鼠单克隆hLL2κ-链连接的人-小鼠单克隆hLL2γ-链二硫化物的二聚体，包括，但不限于，例如，在依帕珠单抗中的人CD22特异性完全人化抗体，CAS登记号为501423-23-0。为了说明本发明，在4.5至5.0和5.0至5.5的pH范围内的CD22-特异性抗体(“Ab-hCD22”)的酸和碱滴定被描述在下面的实施例中。Ab-hCD22在这些pH范围内的缓冲能力的计算也被描述在下面的实施例中。
IGF-1受体特异性抗体和相关蛋白，例如在国际专利申请号PCT/US2005/046493中所述的那些，其在此被整个引入作为参考，关于IGF-1受体特异性抗体和相关蛋白，其包括，但不局限于所述的IGF-1特异性抗体，其被称为L1H1、L2H2、L3H3、L4H4、L5H5、L6H6、L7H7、L8H8、L9H9、L10H10、L11H11、L12H12、L13H13、L14H14、L15H15、L16H16、L17H17、L18H18、L19H19、L20H20、L21H21、L22H22、L23H23、L24H24、L25H25、L26H26、L27H27、L28H28、L29H29、L30H30、L31H31、L32H32、L33H33、L34H34、L35H35、L36H36、L37H37、L38H38、L39H39、L40H40、L41H41、L42H42、L43H43、L44H44、L45H45、L46H46、L47H47、L48H48、L49H49、L50H50、L51H51和L52H52，其每个分别地和特定地在此被整个引入作为参考，如上述国际申请公开一样。
B-7关联蛋白1(“B7RP-1”)特异性抗体，(B7RP-1在文献中也被称为B7H2、ICOSL、B7h和CD275)特别是B7RP-特异性完全人单克隆IgG2抗体，特别是完全人IgG2单克隆抗体，其在B7RP-1的第一免疫球蛋白样结构域中结合抗原表位，尤其是抑制B7RP-1与它的天然受体ICOS在激活的T细胞上的相互作用的那些，尤其是，在所有上述方面，在2005年7月18日提交的美国临时申请号60/700,265中公开的那些，其在此被整个引入作为参考，关于这些抗体和相关蛋白，包括，但不局限于在此被称为下面的抗体16H(其中分别具有轻链可变和重链可变序列SEQID NO1和SEQ ID NO7)；5D(其中分别具有轻链可变和重链可变序列SEQ ID NO2和SEQ ID NO9)；2H(其中分别具有轻链可变和重链可变序列SEQ ID NO3和SEQ ID NO10)；43H(其中分别具有轻链可变和重链可变序列SEQ ID NO6和SEQ ID NO14)；41H(其中分别具有轻链可变和重链可变序列SEQ ID NO5和SEQ ID NO13)；和15H(其中分别具有轻链可变和重链可变序列SEQ ID NO4和SEQ ID NO12)，其每个分别地和特定地在此被整个引入作为参考，如上述美国临时申请公开一样。对B7RP-1特异性抗体(“Ab-hB7RP1”)的缓冲能力的酸和碱滴定和测定被描述在下面的实施例中。
IL-15特异性抗体、肽抗体和有关蛋白，例如，特别是，人化单克隆抗体，特别是例如在美国申请公开号US2003/0138421；US2003/023586；US2004/0071702中公开的那些抗体，其每个在此被整个引入作为参考，关于IL-15特异性抗体和有关蛋白，包括肽抗体，包括特别是，例如，但不局限于，HuMax IL-15抗体和有关蛋白，例如，146B7。
IFNγ特异性抗体，尤其是人IFNγ特异性抗体，特别是全人抗-IFNγ抗体，例如，在美国申请公开号US2005/0004353中所述的那些，其在此被整个引入作为参考，关于IFNγ特异性抗体，特别是，例如，该抗体在那里被称为1118；1118*；1119；1121；和1121*，其每个分别地和具体地在此被整个引入作为参考，如完全在上述美国申请公开出版物中公开的那样。
TALL-1特异性抗体以及其它TALL特异性结合蛋白，例如在美国申请公开号2003/0195156中所述的那些，关于TALL-1结合蛋白，其在此被整个引入作为参考，特别是表4和5B的分子，其每个分别地和具体地在此被整个引入作为参考，如完全在上述美国申请公开出版物中公开的那样。
干细胞因子(“SCF”)和相关蛋白，例如美国专利号6,204,363和6,207,802中所述的那些，关于干细胞因子和有关蛋白，其每个在此被整个引入作为参考，特别是，例如，所述的干细胞因子“STEMGENTM”。
Flt3-配体，(“Flt3L”)和有关蛋白，例如在美国专利号6,632,424中描述的那些，在这方面，关于Flt3-配体和有关蛋白，其在此被引入作为参考。
IL-17受体和有关蛋白(“IL-17R”)，例如美国专利号6,072,033中所述的那些，在这方面，关于Flt3-配体和有关蛋白，其在此被引入作为参考。
依那西普，也称为恩利，和有关的蛋白。
阿克体每(干扰素-γ-1b)、活化酶(蛋白溶酶素)、艾杜糖醛酸苷酶(拉罗尼酶)、基因癣康(阿法赛特)、阿伏尼克斯(干扰素β-1a)、重组DNA源凝血因子IX(诺那凝血酶α)、百若木恩(他索纳明)、Beatseron(干扰素-β-1b)、BEXXAR(托西莫单抗)、Tev-Tropin(促生长激素)、重组抗血友病因子浓缩物或RECOMBINATE(重组体)、重组葡糖脑苷脂酶(伊米苷酶)、恩利(依那西普)、红细胞生成素(依泊丁α)、怡泼津/异丙嗪(红细胞生成素α)、法布里酶(α半乳糖苷酶β)、Fasturtec/Elitek ELITEK(拉布立酶)、副甲状腺激素(特立帕肽)、健豪宁(促生长激素)、果开康(胰高血糖素)、胰高血糖素(胰高血糖素，rDNA源)、果纳芬(促滤泡素α)、凝血因子VIII FS(辛凝血素α)、HERCEPTIN(曲妥单抗)、HUMATROPE(促生长激素)、HUMIRA(阿达木单抗)、在溶液中的胰岛素、INFERGEN(干扰素αcon-1)、KINERET(阿那白滞素)、Kogenate FS(抗血友病因子)、白细胞素(沙莫司亭重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(rhuGM-CSF))、坎帕斯(阿仑单抗)、RITUXAN(美罗华)、TNKase(替奈普酶)、MYLOTARG(吉姆单抗奥佐米星)、NATRECOR(奈西立肽)、ARANESP(促红细胞生成素α)、NEULASTA(聚乙二醇化非格司亭)、NEUMEGA(奥普瑞白介素)、NEUPOGEN(非格司亭)、NORDITROPINCARTRIDGES(促生长激素)、NOVOSEVEN(依他凝血素α)、NUTROPINAQ(促生长激素)、Oncaspar(培门冬酶)、ONTAK(地尼白介素2)、ORTHOCLONE OKT(莫罗单抗-CD3)、OVIDREL(绒膜促性腺激素α)、PEGASYS(聚乙二醇干扰素α-2a)、PROLEUKIN(阿地白介素)、PULMOZYME(去氧核糖核酸酶α)、纤溶酶原激活因子(瑞替普酶)、含有REBETOL(利巴韦林)和INTRONA(干扰素α-2b)的REBETRON联合治疗、REBIF(干扰素β-1a)、REFACTO(抗血友病因子)、REFLUDAN(重组水蛭素)、REMICADE(英夫利昔单抗)、REOPRO(阿昔单抗)ROFERON-A(干扰素α-2a)、SIMULECT(baasiliximab)、SOMAVERT(Pegivisomant)、SYNAGIS(帕利珠单抗)、Stemben(Ancestim，干细胞因子)、THYROGEN、INTRONA(干扰素α-2b)、PEG-INTRON(聚乙二醇干扰素α-2b)、XIGRIS(Drotrecoginα活化的)、XOLAIR(Omalizumab)、ZENAPAX(达克珠单抗)和ZEVALIN(替伊莫单抗)。
d.序列变化 关于所有上述及下列特别优选的蛋白，包括包含70％以上，尤其是80％以上，更尤其是90％以上，更尤其是95％以上，特别是97％以上，更特别是98％以上，更特别是99％以上的在氨基酸序列方面与结合蛋白的标准氨基酸序列相同的区域的那些，如上所示，特别是药物结合蛋白，例如GenBank或对照蛋白的其它标准序列。
在这方面，可以使用各种公知的和容易得到的氨基酸序列分析软件确定同一性。优选的软件包括实施Smith-Waterman算法的软件，其考虑了满意解决检索和比对序列的问题的办法。还可以使用其它算法，特别是当速度是一个重要考虑因素时。可以用于这一方面的DNA、RNA和多肽的比对和同源性配对的通常使用的程序包括FASTA、TFASTA、BLASTN、BLASTP、BLASTX、TBLASTN、PROSRCH、BLAZE和MPSRCH，后者是Smith-Waterman算法的设备，其在由MasPar制造的大规模并行处理机上运行。
所述的BLASTN、BLASTX和BLASTP程序是用于这种测定的优选程序，前者用于多聚核苷酸序列比较，后两者用于多肽序列比较BLASTX用于来自所有多聚核苷酸序列的三种阅读框的多肽序列的比较，以及BLASTP用于单一多肽序列。
BLAST提供各种用户可定义的参数，其在执行比较前被设定。它们中的一些比其它在图形用户接口上更显而易见，例如由NCBI BLAST以及其它在互联网上获取的序列对比程序提供的那些。所述的设定和它们的值被解释在服务网址上，并且在各种很容易得到的文本中详细解释和阐述，这些文本包括但不局限于BIOINFORMATICSSEQUENCE ANDGENOME ANALYSIS，2nd Ed.David W.Mount，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(2004)，尤其是第3、4、5和6章，其涉及一般地蛋白和核酸序列的比较，并关于BLAST比较和研究，特别是；SEQUENCE ANALYSIS IN A NUTSHELLA GUIDETO COMMON TOOLS AND DATABASES，Scott Markel and Darryl León，O’Reilly & Associates，Sebastopol，California(2003)，尤其特别是关于BLAST的第7章，其每个在此被整个引入作为参考，特别是与核苷酸和多肽序列比较有关的部分，并为了测定它们的同一性、相似性、同源性等程度，尤其是关于试验顺序和参考序列的比较以计算它们间同一性的程度(百分比)。
关于这一点，在本发明的优选实施方案中，序列的相关性被定义为通过上述BLAST比较调查的任何一种或另一种获得的以百分比表示的同一性得分，其中e＝10以及所有其它参数在NCBI网络服务器上被设定为它们的缺省值，如在SEQUENCE ANALYSIS IN A NUTSHELL中所述A GUIDE TO COMMON TOOLS AND DATABASES，Scott Markel和Darryl León，O’Reilly&Associates，Sebastopol，California(2003)，第47-51页，其在此整个引入作为参考，使用BLAST，例如NCBI BLAST上的那些对本发明的优选设定参数的所有细节进行比较序列。
在这方面以及其它方面，以下参考文献提供了序列比较的附加信息。GUIDE TO HUMAN GENOME COMPUTING，Ed.Martin J.Bishop，Academic Press，Harcourt Brace & Company Publishers，NewYork(1994)，关于上述其在此被整个引入作为参考，特别是与测定氨基酸或多聚核苷酸序列的同一性和/或同源性有关的部分，尤其是第7章。所述的BLAST程序被描述在Altschul等，“Basic Local AlignmentResearch Tool，”J Mol Biol 215403-410(1990)中，其在此整个引入作为参考。涉及序列分析和同源性和身份测定的附加信息被提供在许多其它本领域公知的其它参考文献中并且容易地由本领域熟练技术人员得到的NUCLEIC ACID AND PROTEIN SEQUENCE ANALYSISAPRACTICAL APPROACH，Eds.M.J.Bishop and C.J.Rawings，IRL Press，Oxford，UK(1987)；PROTEIN STRUCTUREA PRACTICAL APPROACH，Ed.T.E.Creighton，IRL Press，Oxford，UK(1989)；Doolittle，R.F.“Searching through sequence databases，”Met Enz.18399-110(1990)；Meyers and Miller“Optimal alignments in linear space”Comput.Applica.in Biosci 411-17(1988)；Needleman and Wunsch“A general methodapplicable to the search for similarities in amino acid sequence of twoproteins，”J Mol Biol 48443-453(1970)and Smith and Waterman“Identification ofcommon molecular subsequences，”J Mol Biol 1471950et seq.(1981)，关于上述，其每个在此被整个引入作为参考，特别是与序列比较和身份和同源性测定有关的部分。
在这方面，特别优选实施方案具有上述参比蛋白的活性的50％-150％，在这方面，特别高度优选实施方案具有参比蛋白的活性的60％-125％，尤其更高度优选实施方案具有对照蛋白的活性的75％-110％，尤其更高度优选实施方案具有参比蛋白的活性的85％-125％，尤其更高度优选实施方案具有对照蛋白的活性的90％-110％。
4制剂 通常用于蛋白药物制剂的许多试剂和方法可用于本发明各种方面和优选实施方案中的自缓冲蛋白组合物的配制。但是，在本发明的自缓冲蛋白制剂中，缓冲基本上完全由蛋白本身提供，而不是由缓冲剂提供，正如常规制剂的情况那样。此外，本发明的各种方面和优选实施方案的自缓冲蛋白制剂基本上没有这些缓冲剂。
在许多其它方面中，但是，本发明的各种方面和实施方案的自缓冲蛋白组合物可以使用通常在蛋白制剂中使用的试剂和方法配制，特别是，适用于配制药物，包括兽医和人使用的药物的试剂和方法，尤其是适合于配制兽医和尤其是人使用的蛋白药物的那些试剂和方法。
根据本发明，用于配制和使用在相关领域中的公知和常规的药物的许多方法和组分可以被用于设计、制备和使用本发明的各种方面和优选实施方案的自缓冲蛋白制剂。这些方法和组分被描述在很容易可以获得的参考文献中，例如REMINGTONTHE SCIENCE AND PRACTICE OFPHARMACY，21st Ed.Beringer等.Editors，Lippincott，Williams&Wilkins，Philadelphia，PA(2005)；ANSEL’S PHARMACETICALDOSAGE FORMS AND DRUG DELIVERY SYSTEMS，8th Ed.Allen等，Editors，Lippincott，Williams & Wilkins，Philadelphia，PA(2005)；和PHARMACEUTICAL FORMULATION OF PEPTIDES AND PROTEINS，Sven Frokjaer and Lars Hovgaard，Editors，CRC Press，Boca Raton，Florida(2000)，其每个在此被整个引入作为参考，特别是与常规的组分和方法相关的部分，所述的组分和方法可以在本发明的各种方面和优选实施方案的蛋白的自缓冲制剂中使用。
可以用于这方面的另外的方法和组分在US 6,171,586；WO2005/044854；US 6,288,030；US 6,267,958；WO 2004/055164；US4,597,966；US 2003/0138417；US 6,252,055；US 5,608,038；US6,875,432；US 2004/0197324；WO 02/096457；US 5,945,098；US5,237,054；US 6,485,932；US 6,821,515；US 5,792,838；US 5,654,403；US 5,908,826；EP 0 804 163；和WO 2005/063291中公开，其每个在此被整个引入作为参考，特别是与本发明的药学上可接受的自缓冲蛋白制剂有关的部分。
制剂的组分和具体类型的各个特定的方面被进一步举例如下所述。因此，在此提供的说明不是可能用于本发明的各种方面和实施方案的自缓冲蛋白制剂的方法和组合物的穷举，也不是以任何方式排外。
在本发明的各种方面的优选实施方案中，自缓冲蛋白制剂包含蛋白和载体，其在此也是指，视情况而定，下面的一种或多种赋形剂、主要赋形剂、稀释剂、主要稀释剂、主要载体、溶剂和/或主要溶剂。广义来说，所述的载体可以是气体、液体或固体，以与组合物的相和/或它的用途相适应。在这方面，在本发明的一些实施方案中，所述的载体是固体，例如粉末，其中蛋白可以分散在该粉末中。在这方面，在优选实施方案中，所述的载体是液体，特别是一种液体，所述的自缓冲蛋白在该液体中是高度可溶的，特别是在提供所需缓冲能力的浓度下是高度可溶的。液体载体可以是有机的或非有机的。优选地，它们是含水的，最优选它们是基本上或完全地由纯水组成。
可以理解，根据本发明的各种方面和实施方案用于药物用途的制剂必须与过程和所述患者的情况不矛盾，例如，灭菌方法(通常在与有效剂混合前使用)，以及存储期间的情况。
几乎不变地，根据本发明的许多方面和实施方案的制剂将含有其它的组分，以任何方式包括但不限于赋形剂以及其它药物试剂。然而，可以理解，本发明的制剂是自缓冲制剂，其中所述的缓冲能力大体上或完全地主要通过蛋白本身提供，如在此其它地方所述的那样。
本发明的各种方面和实施方案的制剂可以含有赋形剂，如下所述，包括，但不局限于用于修饰、维持或保存的组分，例如，制剂和/或主要多肽和/或蛋白的渗透性、粘度、透明度、颜色、渗透性、气味、无菌、稳定性、溶解或释放速度、吸附或渗透。
当然，制剂例如将随所配制的具体蛋白、其余的活性剂，例如将包含在该制剂中的其它药物、给药的指定途径、所使用的给药方法、剂量、剂量频率以及释放形式而定。
在本发明的各种方面中，根据某些优选实施方案的制剂提供组合物，所述的组合物包含蛋白优选药物蛋白以及溶剂，所述的蛋白每单位体积至少具有约如下的缓冲能力2.0或3.0或4.0或5.0或6.50或8.00或10.0或15.0或20.0或30.0或40.0或50.0或75.0或100或125或150或200或250或300或350或400或500或700或1,000或1,500或2,000或2,500或3,000或4,000或5,000mM乙酸钠缓冲剂，如实施例1或2及其它地方中所述的在pH5.0至4.0或pH5.0至5.5的范围内测定。
在本发明的各种方面中，根据某些优选实施方案的制剂提供自缓冲蛋白组合物，特别是药物蛋白组合物，其中，不包括所述的蛋白的缓冲能力在内，所述组合物的每单位体积的缓冲能力等于或小于1.0或1.5或2.0或3.0或4.0或5.0mM乙酸钠缓冲剂的单位体积的缓冲能，如实施例1或2及其它地方中所述的在pH5.0至4.0范围内或pH5.0至5.5范围内测定。
在本发明的各种方面中，根据某些优选实施方案的制剂提供自缓冲的蛋白组合物，特别是药物蛋白组合物，其包含蛋白和溶剂，其中在组合物的pH处，蛋白的缓冲能力至少为约1.00或1.50或1.63或2.00或3.00或4.00或5.00或6.50或8.00或10.0或15.0或20.0或30.0或40.0或50.0或75.0或100或125或1 50或200或250或300或350或400或500或700或1,000或1,500或2,000或2,500或3,000或4,000或5,000mEq每升和每pH单位的pH变化。
在各种方面中，根据本发明的某些优选实施方案的制剂提供自缓冲的蛋白组合物，特别是药物蛋白组合物，其包含蛋白和溶剂，其中在组合物的pH下，除该蛋白外，在如实施例1或2以及在此其它地方中所述的pH5.0-4.0或pH5.0-5.5范围内，该组合物的每单位体积的缓冲能力等于或小于0.50或1.00或1.50或2.00或3.00或4.00或5.00或6.50或8.00或10.0或20.0或25.0mM乙酸盐缓冲液的单位体积的缓冲能力。
在本发明的各种方面中，根据某些优选实施方案的制剂提供自缓冲的蛋白组合物，特别是药物蛋白组合物，其包含蛋白和溶剂，其中在所需的pH下，该蛋白提供至少该组合物的缓冲能力的约55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或99.5％的。
在本发明的各种方面中，根据某些优选实施方案的制剂提供自缓冲的蛋白组合物，特别是药物蛋白组合物，其包含蛋白和溶剂，其中蛋白的浓度约在下列之间20至400，或20至300，或20至250，或20至200，或20至150mg/ml。
在本发明的各种方面中，根据某些优选实施方案的制剂提供自缓冲的蛋白组合物，特别是药物蛋白组合物，其包含蛋白和溶剂，其中通过蛋白的缓冲作用保持的pH约在下列之间3.5至8.0，或4.0至6.0，或4.0至5.5，或4.5至5.5。
在本发明的各种方面中，根据某些优选实施方案的制剂提供自缓冲的蛋白组合物，特别是药物蛋白组合物，包含蛋白和溶剂，其中所述的盐浓度小于150mM或125mM或100mM或75mM或50mM或25mM。
在本发明的各种方面中，根据某些优选实施方案的制剂提供自缓冲的蛋白组合物，特别是药物蛋白组合物，其包含蛋白和溶剂，并且进一步包含一种或多种药学上可接受的盐；渗透平衡剂(渗透剂)；抗氧化剂；抗生素；抗霉菌剂；填充剂；冻干保护剂；消泡剂；螯合剂；防腐剂；着色剂；止痛药；或其它药物试剂。
在本发明的各种方面中，根据某些优选实施方案的制剂提供自缓冲的蛋白组合物，特别是药物蛋白组合物，其包含蛋白和溶剂，并且进一步包含一种或多种药学上可接受的多元醇，其数量是低渗的、等渗的或高渗的，优选约等渗的，特别优选等渗的，尤其优选山梨糖醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖或甘油中的任何一种或多种，特别尤其优选约5％山梨糖醇、5％甘露醇、9％蔗糖、9％海藻糖或2.5％甘油，在这方面甚至尤其5％山梨糖醇、5％甘露醇、9％蔗糖、9％海藻糖或2.5％甘油。
在本发明的各种方面中，根据某些优选实施方案的制剂提供自缓冲的蛋白组合物，特别是药物蛋白组合物，其包含蛋白和溶剂，并且还包含一种或多种药学上可接受的表面活性剂，优选聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、脱水山梨糖醇的其它脂肪酸酯、聚乙氧基化物和泊洛沙姆188中的一种或多种，特别优选聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80，优选约0.001-0.1％聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80，甚至优选约0.002-0.02％聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80，尤其是0.002-0.02％聚山梨酸酯20或聚山梨酸酯80。
在本发明的各种方面中，根据某些优选实施方案的制剂提供自缓冲的蛋白组合物，特别是药物蛋白组合物，其包含蛋白和溶剂，其中所述的蛋白是药物试剂以及所述的组合物是适合于治疗兽医或人医学患者的该蛋白的无菌制剂。
在此所述的根据本发明的各种方面和实施方案的制剂是根据上述的冻干组合物，特别是冻干组合物，其当重建时提供如上以及其它地方所述的制剂。
a.赋形剂以及其它额外的组分 如上所述，本发明的某些实施方案提供自缓冲的蛋白组合物，特别是药物蛋白组合物，其除了包含所述的蛋白特别是药物蛋白外，还包含一种或多种赋形剂如在本节以及其它章节中说明性描述的那些。在这方面，赋形剂可以以各种目的被用于本发明，例如调节制剂的物理、化学或生物学特性，例如调整粘度，和/或被用于本发明的方法中以改善效力和/或稳定这些制剂和方法以防止由于应激而降解和损坏，例如在制造、装运、存储、使用前制备、给药及其此后期间发生的应激。
在这方面，各种对蛋白稳定和制剂材料和方法有用的说明例如可以在Arakawa等Solvent interactions in pharmaceutical formulations，”PharmRes.8(3)285-91(1991)；Kendrick等“Physical stabilization of proteins inaqueous solution，”inRATIONAL DESIGN OF STABLE PROTEINFORMULATIONSTHEORY AND PRACTICE，Carpenter and Manning，eds.Pharmaceutical Biotechnology.1361-84(2002)，以及Randolph等，“Surfactant-protein interactions，”Pharm Biotechnol.13159-75(2002)中找到，其每个在此整个引入作为参考，特别是与本发明的自缓冲蛋白制剂相同的赋形剂和方法有关的部分，尤其是用于兽医学和/或人医学用途的蛋白质药物产品和方法。
在本发明中使用的各种赋形剂列在表1中并进一步如下讨论。
表1赋形剂的类型和它们的功能 i.盐 盐可以用于本发明的某些优选实施方案中，例如，用于调节自缓冲制剂的离子强度和/或等渗性和/或用于改善本发明的自缓冲的蛋白组合物中的自缓冲蛋白或其它组分的溶解度和/或物理稳定性。
众所周知，通过与蛋白表面上的带电残基结合以及通过屏蔽蛋白中的带电极性基团以及减少它们的库伦相互作用、相互吸引和互相推斥作用的强度，离子可以稳定蛋白的天然状态。特别地，通过与蛋白的变性肽键(-CONH)结合，离子还可以稳定蛋白的变性状态。此外，蛋白中的带电和极性基团间的离子相互作用还可以减少分子间的库伦相互作用，并由此阻止或减少蛋白的凝集和不溶解。
离子种类在它们对蛋白的作用上差别很大。已经形成了一些明确的离子等级以及它们对蛋白的作用，并且它们可被用于配制本发明的自缓冲蛋白组合物。一个实例是霍夫麦斯特序，其通过它们对溶液中蛋白质的构象稳定性的影响来将离子性的和极性非离子溶质分等级。起稳定作用的溶质也被称为“全感胶的”。起不稳定作用的溶质被称为离液的。全感胶剂通常在高浓度(例如，＞1M的硫酸铵)下被使用以使蛋白从溶液中沉淀(“盐析”)。离液剂通常用来吸附和/或溶解蛋白(“盐助溶”)。离子“盐溶”和“盐析”的相对效力规定了它们在霍夫麦斯特序中的位置。
除它们的有用性和它们的缺点(如上所述)外，盐对于减少蛋白制剂的粘度也是有效的，并因此可以用于本发明中。
为了在本发明的优选实施方案的肠胃外制剂中保持等渗性、改善蛋白溶解度和/或稳定性、改善粘度特性、避免对蛋白质稳定性和凝集的有害盐效应以及阻止盐介导的蛋白质降解，本发明的各种优选实施方案的自缓冲制剂中的盐浓度小于150mM(对于单价离子)和150mEq/升对于多价离子。在这方面，在本发明的某些特别优选的实施方案中，总盐浓度约为75mEq/L到约140mEq/L。
ii.氨基酸 游离氨基酸可以被用于本发明的各种优选实施方案的蛋白制剂中，仅举几个例子，填充剂、稳定剂和抗氧化剂。但是，包含在本发明的自缓冲蛋白制剂中的氨基酸不提供缓冲作用。为此，具有显著缓冲能力的那些不被使用，不在它们具有显著缓冲作用的任何pH周围使用或者在低浓度下使用，这样它们在制剂中的缓冲能力不显著。这特别是对于通常在药物制剂中被用作缓冲剂的组氨酸以及其它氨基酸的情况。
根据上述考虑，赖氨酸、脯氨酸、丝氨酸和丙氨酸可用于稳定制剂中的蛋白。甘氨酸用于冷冻干燥中以校正滤饼结构和性能。因此，它在冷冻干燥制剂和重新构成的冷冻干燥制剂例如Neumega、Genotropin和Humatrope中是一种常见的组分。精氨酸可以在液体和冷冻干燥制剂，例如Activase、Avonex和Enbrel液体中用于抑制蛋白凝集。甲硫氨酸被用作抗氧化剂。
iii.多元醇 多元醇包括糖，例如，甘露醇、蔗糖和山梨糖醇以及多元醇例如，甘油和丙二醇，以及，对在此所述的目的来说，聚乙二醇(PEG)及其相关物质。多元醇是全感胶的。它们在液体制剂和冷冻干燥制剂中被用作稳定剂以保护蛋白免受物理和化学降解过程。多元醇还被用于调节制剂的张力。
在这方面，在本发明中使用的多元醇是甘露醇，通常用于保证冷冻干燥制剂中饼的结构稳定性，例如，Leukine、Enbrel-Lyo和Betaseron。它保证饼的结构稳定性。它通常与冻干保护剂一起被使用，例如，蔗糖。山梨糖醇和蔗糖是优选的调节张力的试剂并作为稳定剂以防止制造过程的输送或制备期间的冻融压力。还原糖(其含有游离醛或酮基)，例如葡萄糖和乳糖，可以糖化表面赖氨酸和精氨酸残基。因此，它们通常不是本发明优选的多元醇。此外，在这方面，形成这些活性组分的糖，例如蔗糖，其在酸性条件下水解成果糖和萄萄糖，并因此产生糖化，也不在本发明的优选氨基酸当中。PEG用于稳定蛋白并作为冷冻保护剂并可以被用于本发明，例如它以Recombinate的形式被使用。
iv.表面活性剂 蛋白质分子易被吸附到表面上并变性，随后在气-液、固-液和液-液界面下凝集。这些作用通常与蛋白浓度成反比。这些有害的相互作用大小通常与蛋白浓度成反比，并典型地被物理搅动，例如在产品运输和操作期间产生的物理搅动所恶化。
通常使用表面活性剂来防止、最小化或减少表面吸附。在这方面，本发明的有用的表面活性剂包括吐温20、聚山梨酸酯80、聚乙氧基化的脱水山梨糖醇的其它脂肪酸酯和泊洛沙姆188。
表面活性剂还通常被用于控制蛋白构象的稳定性。在这方面，表面活性剂的使用是蛋白-特异性的，因为任何给定的表面活性剂典型地将稳定一些蛋白并不稳定其余蛋白。
聚山梨酸酯易于氧化降解，其通常含有足够数量的过氧化物以引起蛋白残基侧链，尤其是甲硫氨酸的氧化。因此，聚山梨酸酯应该被小心使用，并且当使用时，应该以它们的最低有效浓度使用。在这方面，聚山梨酸酯示范说明所述的一般规则，即赋形剂应该以它们的最低有效浓度被使用。
v.抗氧化剂 各种过程均可能导致药物制剂中蛋白的有害氧化。在某种程度上，通过保持合适含量的环境氧和温度以及避免曝光，有可能防止药物配制中蛋白的有害氧化。抗氧化剂赋形剂同样可以被使用以防止蛋白的氧化降解。在这方面，有用的抗氧化剂是还原剂、不含氧的自由基清除剂和螯合剂。在本发明的治疗蛋白制剂中使用的抗氧化剂优选是水溶性的并且在整个产品的贮存期限内保持它们的作用。在这方面，EDTA是本发明的一种优选的抗氧化剂，并且以大体上相同的方式可以被用于本发明中，它已经被用于酸性成纤维细胞生长因子的制剂中以及用于产品例如Kineret和Ontak中。
抗氧化剂可能损伤蛋白。例如，还原剂，例如特别是谷胱甘肽，可能破坏分子内的二硫键。因此，尤其，选择在本发明中使用的抗氧化剂以消除或足够地减少它们自身损伤制剂中蛋白的可能性。
vi.金属离子 本发明的制剂可以包括金属离子，所述的金属离子是形成蛋白配合物所需的蛋白辅因子，例如形成某些胰岛素悬浮液所需的锌。金属离子也可能抑制降解蛋白的一些过程。但是，金属离子也催化降解蛋白的物理和化学过程。
镁离子(10-120mM)可以被用于抑制天冬氨酸异构化成异天冬氨酸。Ca+2离子(最高达100mM)可以增加人脱氧核糖核酸酶(rhDNA酶，Pulmozyme)的稳定性。但是，Mg+2、Mn+2和Zn+2可以使rhDNA酶不稳定。类似地，Ca+2和Sr+2可以稳定因子VIII，它可以被Mg+2、Mn+2和Zn+2、Cu+2和Fe+2不稳定，并且它的凝集可以被Al+3离子增加。
vii.防腐剂 当开发多剂量肠胃外制剂时，所述的多剂量肠胃外制剂包括来自相同容器的不止一种萃取物，防腐剂是必须的。它们的主要作用是抑制微生物生长并确保在药物产品的整个贮存期限或使用期限内无菌。通常使用的防腐剂包括苄醇、苯酚和间甲酚。虽然防腐剂作为小分子肠胃外制剂使用具有很长的历史，但是开发包括防腐剂的蛋白制剂可能受到挑战。防腐剂在蛋白上几乎总是具有失稳作用(凝集)，这成为限制它们在多剂量蛋白制剂中使用的一个主要因素。到目前为止，大多数蛋白药物仅配制作为单用途使用。然而，当多剂量制剂成为可能时，它们可以具有方便患者和增加市场竞争力的增加的优点。一个好的实例是人生长激素(hGH)，其中含有防腐剂的制剂可以使更方便的多用途注射笔供应的商业化。含有hGH防腐制剂的至少四种这些笔装置目前可在市场上得到。Norditropin(液体，Novo Nordisk)、Nutropin AQ(液体，Genentech)和Genotropin(冷冻干燥-双室柱，Pharmacia & Upjohn)含有苯酚而Somatrope(Eli Lilly)是用间甲酚配制的。
在配制和开发防腐剂型期间，需要考虑若干方面。药品中有效的防腐剂浓度必须被优化。这需要测试剂型中给定的防腐剂的浓度范围，该浓度范围可以给予抗微生物效力，并没有损害蛋白质的稳定性。例如，在使用差示扫描量热法(DSC)开发白细胞介素-1受体(I型)的液体制剂的过程中，三种防腐剂被成功地筛选出来。通常在销售产品中使用的浓度下，基于防腐剂对稳定性的影响来对它们进行评级。
正如可预料的那样，开发含有防腐剂的液体制剂比冻干制剂具有更大的挑战性。冻干产品可以在没有防腐剂的情况下被冻干，并用含有防腐剂的稀释剂在使用的时候重建。这缩短了防腐剂与蛋白接触的时间，显著地减少了与稳定性有关的风险。对于液体制剂，防腐剂效力和稳定性必须在产品的整个贮存期限内(～18至24个月)被保持。需要注意的要点是，防腐剂效力必须在含有活性药物和所有赋形剂组分的最终制剂中被证明。
根据本发明的自缓冲蛋白制剂，特别是自缓冲生物药物蛋白制剂，通常将被设计用于特定的给药途径和方法，用于特定的给药剂量和给药频率，用于特异性治疗特定的疾病，在生物利用度和持久性的范围内。
因此，根据本发明的制剂可以被设计用于通过任何合适的途径给药，这些途径包括，但不局限于口服、耳内、眼内、直肠和阴道，以及通过肠胃外途径，包括静脉内和动脉内注射、肌内注射和皮下注射给药。
b.肠胃外给药制剂 肠胃外给药制剂可以是含水或非水等渗无菌注射溶液或悬浮液的形式。这些溶液和悬浮液可以由无菌粉末或颗粒使用一种或多种载体或稀释剂进行制备，或通过使用其它合适的分散剂或润湿剂和悬浮剂进行制备，其中所述的一种或多种载体或稀释剂是在口服给药制剂中使用的那些。
当考虑肠胃外给药时，在本发明中使用的治疗组合物可以以无热原的、胃肠外可接受的水溶液的形式存在，所述的水溶液包含在药学上可接受的赋形剂中的所需的蛋白。肠胃外注射用的特别合适的赋形剂是无菌纯水，其中所述的蛋白以无菌的、等渗的自缓冲溶液的形式被配制。
这些制剂还可以包括以可注射的微球体、生物易蚀颗粒、聚合物(聚乳酸、聚乙醇酸)、珠或脂质体形式的所需蛋白的制剂，包括提供控释或缓释的那些。这些制剂可以通过可植入给药装置引入。
肠胃外给药制剂还可以含有调节粘度的物质。例如羧甲基纤维素、山梨糖醇和右旋糖酐。在某些情况中，在所述的自缓冲蛋白制剂中还可以含有增加所需蛋白或其它组分溶解度的组分以及稳定一种或多种这些组分的组分。
c.肺部给药制剂 本发明的某些实施方案的药物组合物可以适合于吸入给药。对于肺部给药，所述的药物组合物可以以气雾剂的形式给药或用包括干粉气雾剂的吸入器给药。例如，粘合剂可以被配制成用于吸入的干粉。吸入溶液还可以用气雾剂递送的推进剂进行配制。在还有另一种实施方案中，溶液可以被雾化。肺部给药进一步被描述在PCT申请号PCT/US94/001875中，其描述了化学改性蛋白的肺部释放。
d.口服给药制剂 对于口服给药，所述的药物组合物例如可以是片剂、胶囊、悬浮液或液体的形式。所述的药物组合物优选被制成含特定量活性成分的剂量单位形式。这些剂量单位的例子是片剂或胶囊。本发明的口服给药制剂可以以常规方式制备，其中制剂中的缓冲由在此所述的自缓冲蛋白提供。
e.控制释放的制剂 可以在本发明中使用的其它制剂是缓释的或控制释放的制剂。制备本发明的各种方面和优选实施方案中使用的这些缓释和控制制剂的技术是本领域熟练技术人员公知的。在这些当中有释放方法，其使用脂质体载体、生物易蚀性微颗粒、多孔珠和半渗透性聚合物基质，例如在PCT/US93/00829；US.3,773,919；EP 58,481；Sidman等，Biopolymers，22547-556(1983)；Langer等，J.Biomed.Mater.Res.15167-277，(1981)；Langer等，Chem.Tech.1298-105(1982)；EP 133,988；Eppstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)，823688-3692(1985)；EP 36,676；EP 88,046；和EP 143,949中所述的那些，其每个整个在此引入作为参考，特别是与在此所述的本发明的自缓冲缓释和控制释放的药物蛋白相关的部分。
f.灭菌 用于体内给药的药物组合物典型地必须是无菌的。这可以通过无菌过滤膜过滤实现。如果所述的组合物是冻干的，可以使用这种方法灭菌或在之前或之后冷冻干燥并重建。肠胃外给药的组合物可以以冻干形式或以溶液的形式贮存。此外，肠胃外组合物通常被放置到一种容器中，其具有无菌进入孔，例如，静脉内溶液袋或具有塞子的管瓶，所述的塞子可以通过皮下注射针头刺入。
g.存储 一旦药物组合物已经被配制成，它可以以溶液、悬浮液、凝胶、乳液、固体或脱水或冻干粉末的形式被贮存在无菌管瓶中。这些制剂可以以现成即可使用的形式被存储或以一种在给药前需要重建的形式(例如，冻干)被存储。
h.另外的药物试剂 除组合物的自缓冲蛋白外，本发明的自缓冲蛋白组合物，特别是自缓冲药物蛋白组合物，可以包含一种或多种另外的药物试剂。这些试剂可以同样是蛋白，或它们可以是其它类型的试剂。这些试剂包括用于预防或治疗任何疾病或障碍的那些试剂。这些试剂包括，例如，抗生素和抗霉菌剂。它们还包括用于治疗人障碍的试剂，包括，但不局限于，用于治疗炎性疾病、癌症、代谢性疾病、神经疾病和肾病等的试剂。在本发明中使用的试剂还包括用于增加自缓冲组合物的作用和/或预防、改善或治疗其给药的任何不希望的副作用。
i.制备自缓冲蛋白制剂的方法 本发明的组合物可以使用公知的、常规的用于制备、配制和使用蛋白(特别是药物蛋白)的方法。在本发明的某些优选实施方案中，制备组合物的方法包括使用反离子以除去残余的缓冲剂。术语反离子是任何极性或带电的组分，其在制备期间用于从组合物中置换缓冲液。在这方面，可用的反离子包括，例如，甘氨酸、氯离子、硫酸根和磷酸根。在这方面，术语反离子被用来意指作为置换离子的许多相同的东西。
残余的缓冲剂可以使用反离子除去，使用各种公知方法，包括，但不局限于，透析的标准方法和基于高性能膜扩散的方法例如切向流渗滤法。在这方面，在一些情况中，使用反离子除去残余缓冲液的方法使用空间排阻层析进行。
在这方面，在某些相关的优选实施方案中，本发明的组合物通过一种方法制备，该方法包括在pH低于含有自缓冲蛋白的制剂的pH值下对着无缓冲溶液进行透析。在这方面，在本发明的特别优选实施方案中，所述的无缓冲溶液包含反离子，特别是促进残余缓冲液除去并且不会不利地影响自缓冲蛋白或其制剂的那些。在这方面，在本发明的另一特别优选实施方案中，在透析后，使用稀酸或稀碱将制剂的pH值调节到所需的pH值。
在这方面，在某些相关的特别优选实施方案中，通过一种方法制备本发明的组合物，该方法包括在pH低于含有自缓冲蛋白的制剂的pH值下，对着无缓冲溶液进行切向流渗滤。在这方面，在本发明的特别优选实施方案中，所述的无缓冲溶液包含反离子，特别是促进残余缓冲液除去并且不会不利地影响自缓冲蛋白或其制剂的那些。在这方面，在本发明的另一特别优选实施方案中，在渗滤法后，使用稀酸或稀碱将制剂的pH值调节到所需的pH值。
5.给药途径 在各种实施方案中，本发明的制剂可以通过多种合适的、本领域熟练技术人员公知的给药途径给予患者。在这方面，在本发明的实施方案中，通过消化道给药如在此所述的一种或多种制剂。在其它实施方案中，通过胃肠外给药如在此所述的一种或多种制剂。在各种实施方案中，可以通过消化道给药一种或多种制剂以及同时通过胃肠外给药一种或多种其它制剂。
在多种实施方案中，这些途径包括但不局限于口服、眼内、口腔、局部、直肠、肺部给药如通过吸入喷雾以及表皮给予组合物。下列肠胃外给药途径也用于本发明的各种实施方案中通过静脉内、动脉内、心脏内、脊柱内、鞘内、骨内、关节内、滑膜内、皮内、皮下、腹膜和/或肌内注射的途径给药。在一些实施方案中，使用静脉内、动脉内、皮内、皮下和/或肌内注射的途径。
在本发明的某些实施方案中，将所述的组合物局部给药，例如通过眼球内注射以治疗眼内新血管形成、视网膜病或与年龄有关的黄斑变性。
6.剂量 所给予的自缓冲蛋白制剂的数量和用该制剂治疗疾病病症的剂量方案取决于若干因素，包括患者的年龄、体重、性别和医学条件，疾病的类型、疾病的严重程度、给药的途径和频率以及所使用的具体制剂。特别地，所述的数量将取决于所给予的蛋白治疗剂以及与其一起给予的任何其它治疗剂。对于本发明的制剂，剂量可以使用公知的常规药物程序来确定。
7.剂量制度 本发明的制剂可以以医学和兽医学领域熟练技术人员公知的剂量和技术给药，并且考虑这些因素如具体患者的年龄、性别、体重和状况以及给药的制剂(例如，固体对液体)。人或其它哺乳动物的剂量可以在没有过度实验的情况下由本领域熟练技术人员根据在此公开的内容、在此引述的文献和本领域的知识确定。
按照各种实施方案，适当的剂量和给药计划将取决于许多因素，并且在许多不同情况下可以改变。测定给药最佳剂量方案的参数将包括下列中的一些或所有所治疗的疾病及其阶段；患者的种类，它们的健康状况、性别、年龄、体重和代谢速度；所给予的其它治疗方法；以及根据患者的病史或基因型预期的潜在并发症。
在给定情况下的最佳给药计划还将考虑制剂的性质、给药的途径和给药后的分布途径，在作用部位和患者身体中的清除率。最后，最佳剂量的确定优选将提供一种有效剂量，其既不低于最大有益作用的阈值，又不超过其中与活性剂的剂量超过增加的剂量的优点有关的有害作用的阈值。
应当理解，“剂量”可以被一次性、分开或在一段时间内连续释放。整个剂量还可以释放至单一位置或在若干位置零星扩散。此外，在整个治疗期间，剂量可以保持不便，或者它们可以变化。
在各种实施方案中，本发明的制剂以初剂量给药，随后通过进一步给药而保持。在一些实施方案中，本发明的制剂最初通过一种方法给药，其后通过相同的方法或通过一种或多种不同的方法给药。可以调节正在进行的给药的剂量，以使其在患者中活性剂的含量保持在某一数值。在一些实施方案中，起初给予该组合物，和/或通过静脉内注射在患者中维持它们的含量。在各种实施方案中，使用其它形式的给药。
本发明的制剂可以在很宽的次数范围内以多次频率给药，包括任何合适的频率和次数范围以释放治疗有效的剂量。剂量可以连续给予，每几小时给予、每天给予一次或多次、每天给予一次、隔日给予一次、每周给予若干次，或频率更少。在一些实施方案中，它们在一天、两天、三天、四天、五天、六天、七天、八天、九天、十天、十一天、十二天、十三天、十四天或更多的天数内给药。在一些实施方案中，它们在一月、两月、三月、四月、五月、六月、七月、八月、九月、十月、十一月、十二月或更多的月数内给药。在各种实施方案中，它们在一年、两年、三年、四年、五年、六年、七年、八年、九年、十年或更多年内给药。对于起初给药和进一步依次给药的合适制度可以相同或者可以是可变的。合适的制度可以由本领域熟练技术人员根据在此公开的内容、在此所引述的文献和本领域的知识来确定。治疗的通常持续时间将与疾病过程的持续时间、所使用的治疗效力和所治疗患者的状况和应答成正比。
8.疾病和治疗 在优选实施方案中，本发明的自缓冲的药物蛋白组合物用于治疗患有各式各样的障碍和疾病的患者。如在此所述的，本发明提供药物抗体、抗体衍生的药物蛋白和与抗体相关的药物蛋白的自缓冲组合物，其可能包含对于各式各样的与疾病相关的靶标特异性的Fc效应子功能和结合区域并用于治疗疾病。这些蛋白及其自缓冲组合物以及它们在治疗各种与它们的靶标有关的障碍和疾病中的用途已经在上面进行了详细描述。使用该组合物的方法，包括配制方法、给药方法、剂量和剂量方法都已经在上面进行了示范性描述。使用本领域公知的和常规的技术，根据本申请说明书提供的指导，本发明的任何特定组合物的配制和给药可以适合于治疗特定的疾病。可以使用本发明的各种方面和优选实施方案的自缓冲药物蛋白制剂治疗的疾病是炎性疾病、癌症、代谢性疾病、神经病和肾病等。
9.包装和试剂盒 本发明还提供包含自缓冲的蛋白制剂的试剂盒，特别是在一个或多个容器中包含自缓冲药物蛋白制剂及其相关的使用说明书的试剂盒，特别是其中所述的制剂是用于人使用的药学上可接受的制剂的这些试剂盒。其中优选的试剂盒是包含本发明的自缓冲蛋白制剂的一个或多个容器和一种或多种分开与试剂盒的内容有关的文件、信息和/或内容物的使用途的那些试剂盒，特别是那些其中所述的蛋白是生物药物蛋白的试剂盒，尤其是那些其中所述的蛋白是用于治疗人疾病的生物药物蛋白的试剂盒。
在这方面，在本发明的某些方面中，优选的试剂盒包括如同上述的试剂盒，其另外还包含一个或多个单室或多室的注射器(例如，液体注射器和冻干注射器)，用于给予本发明的一种或多种自缓冲蛋白制剂。在这方面，在本发明的某些方面中，某些特别优选的试剂盒还包含预加载的注射器。在这方面，在另一种特别优选实施方案中，所述的试剂盒包含用于肠胃外给药的自缓冲药物组合物，在部分真空下密封在管瓶中，以一种准备输入注射器并给予患者的形式存在。在这方面，在尤其优选实施方案中，所述的组合物在被放置在部分真空下。在所有这些方面及其它，在某些另一种特别优选实施方案中，所述的试剂盒含有根据任何上述的一个或多个管瓶，其中每个管瓶含有单一单位剂量以给予患者。在所有这些方面及其他，本发明还涉及包含冻干制剂的试剂盒，如同上述布置，其在重建时提供与其相同的组合物。在这方面，在某些它的优选实施方案中，本发明还提供试剂盒，其含有本发明的冻干制剂和用于重建该冻干制剂的无菌稀释剂。
实施例 此外，本发明通过下列说明性的、非限制性的实施例进行说明。
实施例1酸滴定以及在pH5.0-4.0范围内的乙酸钠缓冲液的缓冲能力。
通过在HPLC级水中稀释超纯冰乙酸，然后用NaOH将pH滴定至所需数值，来制备已知浓度的乙酸储备液。将储备液平衡到空气和21℃。在1N浓度下制备容量标准，并根据需要用HPLC水稀释。
通过将该储备液在HPLC水中进行稀释，来制备1mM、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM和15mM的乙酸钠缓冲液。将溶液用HCl滴定。将0.2N HCl用于1、2.5和5mM溶液，将0.4N HCl用于7.5mM溶液，以及将0.8N HCl用于10和15mM溶液。使用标准分析试验室技术进行滴定。
图1，组A表示滴定数据和由每种溶液数据计算得到的最小二乘方趋势线。由每个数据集计算得到的趋势线的斜率作为相应的乙酸盐缓冲液的缓冲能力。缓冲能力对乙酸盐缓冲液浓度的线性相关性显示在图1，组B中。
实施例2碱滴定以及在pH5.0-5.5范围内的乙酸钠缓冲液的缓冲能力。
如实施例1中所述制备乙酸盐缓冲储备液和滴定溶液。如实施例1中所述滴定所述的溶液，除该溶液的滴定从pH5.0到5.5以及所述的滴定使用NaOH而不是HCl以外。将0.2N NaOH用来滴定1、2.5和5mM溶液，将0.4N NaOH用来滴定7.5、10和15mM溶液。滴定结果显示在图2A中。缓冲能力对乙酸盐缓冲液浓度的线性相关性显示在图2B中。
实施例3通过HPLC确定乙酸盐 使用分析SE-HPLC确定乙酸盐缓冲液样品中的乙酸盐。通过分析在已知乙酸盐浓度的缓冲液中的乙酸盐来确定峰面积作为乙酸盐浓度的标准曲线。根据标准曲线内推在试验样品中的乙酸盐的数量。标准曲线显示在图3中。试验缓冲液中的乙酸盐的标称数量和被测数量被制表图中的标准曲线下。
实施例4Ab-hOPGL制剂在pH5.0-pH4.0范围内的酸滴定 将本体Ab-hOPGL在10mM乙酸盐(标称值)、5％山梨糖醇、pH5.0中对着5.25％山梨糖醇、pH3.2(用HCl调节)在带多倍盒的LABSCALETFF体系(微孔)中渗滤，使用3微孔Pellicon XL 50再生的纤维素超过滤膜。对于每一制剂，在渗滤过程中将渗滤溶液交换8-10次。在渗滤后，测定所得无缓冲液溶液的pH，并使用0.05N HCl或0.05N NaOH将pH调节到pH5.0。
通过稀释，制备用于滴定的1、10、30、60、90和110mg/ml溶液。根据需要，用NaOH或HCl将每一稀释度的pH调节到pH5.0。如上述实施例中所述进行滴定。将0.2N HCl用于滴定1、10和30mg/ml溶液。将0.4N HCl用于滴定60mg/ml溶液。将0.8N HCl用来滴定90和110溶液。
滴定结果被描述在图4中。最小二乘回归线显示每一浓度下的数据集。将缓冲能力作为每一浓度的回归线的斜率。
实施例5Ab-hOPGL制剂在pH5.0-6.0范围内的碱滴定 如实施例4中所述，制备用于滴定的1、10、30、60、90和110mg/ml的Ab-hOPGL溶液。使用NaOH如前面实施例中所述进行碱滴定。将0.2N NaOH用来滴定1、10、30和60mg/ml溶液，将0.4N NaOH用于90和110mg/ml溶液。将滴定结果描述在图5中。线性回归线显示每一浓度的数据。将缓冲能力作为每一浓度的回归线的斜率。
实施例6自缓冲Ab-hOPGL制剂中残余的乙酸盐含量 使用实施例3所述的方法测定在Ab-hOPGL制剂中的残余的乙酸盐的数量。结果被图解描述在图6中，其表示HPLC测定与乙酸盐浓度有关的标准曲线，在下图中，对在不同浓度下在Ab-hOPGL制剂上获得的测定结果进行制表。Ab-hOPGL浓度被标在左侧(“标称的”以及在每一Ab-hOPGL浓度中的乙酸盐的实测浓度被标在右侧。
实施例7在pH5.0至4.0的范围内Ab-hOPGL制剂加或减残余的乙酸盐的缓冲能力 制备自缓冲Ab-hOPGL制剂，接着如之前实施例中所述用HCl进行滴定。此外，通过减去通过如实施例3中所述的由SE-HPLC基于乙酸盐含量测定的残余乙酸盐缓冲液的贡献，调整数据。如上所述测定缓冲能力。在两组数据上进行相同的分析。结果被描述在图7中，该结果显示残余乙酸盐对Ab-hOPGL制剂的缓冲能力的影响。结果清楚地表明，残余乙酸盐的缓冲能力在所分析的自缓冲Ab-hOPGL制剂的缓冲能力中是次要因素。
实施例8Ab-hOPGL加或减残余乙酸盐在pH5.0-6.0的范围内的缓冲能力 制备自缓冲的Ab-hOPGL制剂，接着如之前实施例中所述的用NaOH进行滴定。此外，通过减去通过如实施例3中所述的由SE-HPLC基于乙酸盐含量测定的残余乙酸盐缓冲液的贡献，调整数据。如上所述测定缓冲能力。在两组数据上进行相同的分析。结果被描述在图8中，结果显示残余乙酸盐对Ab-hOPGL制剂缓冲能力的作用。结果清楚地表明，残余乙酸盐的缓冲能力在所分析的自缓冲Ab-hOPGL制剂的缓冲能力中是次要因素。
实施例9在自缓冲和通常缓冲制剂中的pH和Ab-hOPGL稳定性 如上文实施例中所述那样制备Ab-hOPGL的自缓冲制剂。此外，制备含有常规缓冲剂或乙酸盐或谷氨酸盐的制剂。所有的制剂含有60mg/ml Ab-hOPGL。在4℃存储6月，监测制剂中的pH和Ab-hOPGL的稳定性。在存储期间，通过测定制剂中的单体Ab-hOPGL，来监测稳定性。使用如上所述的SE-HPLC进行测定。所有三种制剂的结果显示在图9中。组A表示三种制剂中Ab-hOPGL的稳定性。自缓冲制剂中的稳定性与常规缓冲制剂中的稳定性相当。组B表示三种制剂中的pH稳定性。此外，自缓冲制剂中的pH稳定性与常规缓冲制剂中的pH稳定性相当。
实施例10Ab-hB7RP1-pH5.0-4.0的滴定和缓冲能力 如上述实施例中Ab-hOPGL所述，以1、10、30和60mg/ml的浓度制备Ab-hB7RP1的自缓冲制剂。如上所述，使用HCl进行滴定。此外，通过减去如实施例3中所述的由SE-HPLC基于乙酸盐含量测定的残余乙酸盐缓冲液的贡献，来调整数据。图10，组A表示滴定结果。图10，组B表示减去残余乙酸盐缓冲剂影响前后缓冲能力对Ab-hB7RP1制剂浓度的相关性。结果清楚地表明，Ab-hB7RP1在此pH范围内的自缓冲能力。在40mg/ml下，它提供约与在此pH范围内同10mM乙酸钠缓冲液相同的缓冲能力。在60mg/ml，它提供约与在此pH范围内同15mM乙酸钠缓冲液相同的缓冲能力。
实施例11Ab-hB7RP1-pH5.0-6.0的滴定和缓冲能力 如上述实施例中Ab-hOPGL所述，以1、10、30和60mg/ml的浓度制备Ab-hB7RP1的自缓冲制剂。如上所述，使用NaOH进行滴定。此外，通过减去如实施例3中所述的由SE-HPLC基于乙酸盐含量测定的残余乙酸盐缓冲液的贡献，来调节数据。图11，组A表示滴定结果。图11，组B表示减去残余乙酸盐缓冲剂影响前后缓冲能力对Ab-hB7RP1制剂浓度的相关性。结果清楚地表明，Ab-hB7RP1在此pH范围内的自缓冲能力。在60mg/ml下，它提供约与在此pH范围内同10mM乙酸钠缓冲液相同的缓冲能力。
实施例12在自缓冲和常规缓冲制剂中在4℃下和29℃下的Ab-hB7RP1稳定性 在自缓冲制剂中和在使用常规缓冲剂或乙酸盐或谷氨酸盐的制剂中，制备如上述实施例中所述的Ab-hB7RP1并如上所述配制。所有制剂含有60mg/ml Ab-hB7RP1。在4℃下或在29℃下在二十六周的储存时间内监测该溶液pH的稳定性和溶液中Ab-hB7RP1的稳定性。在存储期间，通过测定制剂中的单体Ab-hB7RP1，来监测稳定性。使用如上所述的SE-HPLC进行测定。结果显示在图 2中。组A表示在4℃下存储的结果。组B表示在29℃下存储的结果。在自缓冲制剂中在4℃下，Ab-hB7RP1与常规缓冲制剂一样至少是稳定的。在29℃下，所述的自缓冲制剂至少是与常规缓冲制剂一样稳定的，并且在10周至最后时间点的期限内可能略微好点。
实施例13自缓冲Ab-hB7RP1在4℃和29℃下的pH稳定性 如上文实施例中所述那样制备60mg/ml的自缓冲Ab-hB7RP1。在时间过程中和如这里所述的相同温度下监测pH。结果显示在图13中。
实施例14Ab-hCD22制剂-pH4.0至6.0的缓冲能力 制备Ab-hCD22的自缓冲制剂并在pH 5.0至4.0范围和5.0至6.0的范围内，如在上述实施例中的Ab-hOPGL和Ab-hB7RP1所述那样进行滴定。同样如上所述，由滴定数据计算缓冲能力。对于这两个pH范围，将缓冲能力作为浓度的函数显示在图14中。组A表示Ab-hCD22制剂在pH5.0至4.0范围内的缓冲能力。缓冲能力线性地依赖于浓度，约21mg/ml的Ab-hCD22制剂的缓冲能力等于以相同的方式测定的pH5.0的10mM乙酸钠缓冲液的缓冲能力。组B显示在pH范围5.0至6.0内缓冲能力作为浓度的函数。在此pH范围中，约30mg/ml的Ab-hCD22制剂的缓冲能力等于以相同的方式测定的pH5.0的10mM乙酸钠缓冲液的缓冲能力。
实施例15Ab-hIL4R制剂-pH5.0-4.0的滴定和缓冲能力 如上述实施例中Ab-hOPGL所述，以1、10、25和90mg/ml的浓度制备Ab-hIL4R的自缓冲制剂。如上所述，使用HCl进行滴定。图15，组A表示滴定结果。图15，组B表示缓冲能力对Ab-hIL4R浓度的相关性。结果清楚地表明，Ab-hIL4R在此pH范围内的自缓冲能力。在约75mg/ml，它在此pH范围中提供与以相同的方式测定的10mM乙酸钠pH5.0相同的缓冲能力。
实施例16Ab-hIL4R制剂-pH5.0-6.0的滴定和缓冲能力 如上述实施例中Ab-hOPGL所述，以1、10、25和90mg/ml的浓度制备Ab-hIL4R的自缓冲制剂。如上所述，使用NaOH进行滴定。图16，组A表示滴定结果。图16，组B表示在此pH范围中缓冲能力对Ab-hIL4R浓度的相关性。结果清楚表明，Ab-hIL4R在此pH范围内的自缓冲能力。在约90mg/ml，它在此pH范围中提供与以相同的方式测定的10mM乙酸钠pH5.0相同的缓冲能力。
实施例17在37℃下，在乙酸盐和自缓冲Ab-hIL4R制剂中的Ab-hIL4R和pH稳定性 如上所述制备在pH5.0和70mg/ml下的Ab-hIL4R的自缓冲制剂和乙酸盐缓冲制剂。在37℃下监测在制剂中的pH和Ab-hIL4R稳定性4周。通过如上所述的SE-HPLC监测Ab-hIL4R稳定性。结果显示在图17中。组A表示Ab-hIL4R在自缓冲制剂中至少与乙酸钠缓冲制剂一样稳定。组B显示自缓冲制剂的pH与乙酸钠缓冲制剂一样稳定。
权利要求
1.包含药物蛋白的组合物，其中在所述组合物的pH、21℃、一个大气压以及与环境大气平衡下，所述蛋白在pH5.0-4.0或pH5.0-5.5范围内的每单位体积的缓冲能力至少为在同样条件下的4.0mM乙酸钠在纯水中的缓冲液的每单位体积的缓冲能力，其中进一步地，不包括所述蛋白的缓冲能力在内，所述组合物在同样条件下的每单位体积的缓冲能力不超过在同样条件下pH5.0-4.0或pH5.0-5.0范围的2.0mM乙酸钠在纯水中的缓冲液的单位体积的缓冲能力，所述组合物已经由在法律上被赋予了授权批准药物使用权力的当局批准用于药物使用。
2.包含药物蛋白的组合物，其中在所述组合物的pH、21℃、一个大气压以及与环境大气平衡下，所述蛋白具有至少为1.50mEq/升-pH单位的每单位体积的缓冲能力，其中进一步地，不包括所述蛋白的缓冲能力在内，所述组合物的每单位体积的缓冲能力小于0.5mEq/升-pH单位，其中所述组合物已经由在法律上被赋予了授权批准药物使用权力的当局批准用于药物使用。
3.根据权利要求1的组合物，其中所述的蛋白提供所述组合物的缓冲能力的至少80％。
4.根据权利要求3的组合物，其中所述的蛋白的浓度在约20至400mg/ml之间。
5.根据权利要求4的组合物，其中由所述蛋白的缓冲作用维持的pH在约3.5至8.0之间。
6.根据权利要求5的组合物，其中由所述蛋白的缓冲作用维持的pH在约4至6之间。
7.根据权利要求5的组合物，进一步包含一种或多种药学上可接受的盐，其中总盐浓度小于150mM。
8.根据权利要求7的组合物，进一步包含一种或多种药学上可接受的盐，其中总盐浓度小于100mM。
9.根据权利要求5的组合物，进一步包含一种或多种药学上可接受的多元醇。
10.根据权利要求9的组合物，其中所述的多元醇是一种或多种山梨糖醇、甘露醇、蔗糖、海藻糖或甘油。
11.根据权利要求5的组合物，进一步包含一种或多种药学上可接受的表面活性剂。
12.根据权利要求11的组合物，其中所述的表面活性剂是一种或多种聚山梨酸酯20、聚山梨酸酯80、脱水山梨糖醇的其它脂肪酸酯、聚乙氧基化物和泊洛沙姆188。
13.根据权利要求9的组合物，进一步包含一种或多种药学上可接受的表面活性剂。
14.根据权利要求1的组合物，进一步包含一种或多种药学上可接受的渗透平衡剂；抗氧化剂；抗生素；抗霉菌剂；填充剂；冻干保护剂；消泡剂；螯合剂；防腐剂；着色剂；止痛药；或另外的药物试剂。
15.根据权利要求5的组合物，进一步包含一种或多种药学上可接受的渗透平衡剂；抗氧化剂；抗生素；抗霉菌剂；填充剂；冻干保护剂；消泡剂；螯合剂；防腐剂；着色剂；止痛药；或另外药物试剂。
16.根据权利要求7的组合物，进一步包含一种或多种药学上可接受的渗透平衡剂；抗氧化剂；抗生素；抗霉菌剂；填充剂；冻干保护剂；消泡剂；螯合剂；防腐剂；着色剂；止痛药；或另外药物试剂。
17.根据权利要求1、5、7、9、11、13或14中任一项的组合物，其中所述的蛋白是或包含抗体、Fab片段、Fab2片段、Fab3片段、Fc片段、scFv片段、双-scFv(s)片段、小体、双抗体、三抗体、四抗体、VhH域、V-NAR域、VH域、VL域、骆驼Ig、Ig NAR、受体抗体、肽抗体、或其变种或衍生物或其相关蛋白或其修饰。
18.根据权利要求17的组合物，其中所述的蛋白包含Fc片段或其部分、或Fc片段的变体或衍生物或其部分或与Fc片段或其部分相关的蛋白或其任何修饰。
19.根据权利要求18的组合物，其中所述的蛋白进一步包含一对同源物结合部分的第一结合部分。
20.根据权利要求1、5、7、9、11、13或14中任一项的组合物，其中所述的蛋白选自与一种或多种CD蛋白、HER受体家族蛋白、细胞粘附分子、生长因子、神经生长因子、成纤维细胞生长因子、转化生长因于(TGF)、胰岛素样生长因子、骨诱导因子、胰岛素和与胰岛素相关的蛋白、凝固蛋白和与凝固相关的蛋白、克隆刺激因子(CSFs)、其他血液和血清蛋白血型抗原；受体、与受体有关的蛋白、生长激素受体、T-细胞受体；神经营养因子、神经营养蛋白、松弛素、干扰素、白细胞介素、病毒抗原、脂蛋白、整联蛋白、类风湿因子、免疫毒素、表面膜蛋白、转运蛋白、归巢受体、地址素、调节蛋白和免疫粘附素特异性结合的蛋白。
21.根据权利要求1、5、7、9、11、13或14中任一项的组合物，其中所述的蛋白选自OPGL特异性结合蛋白、肌肉抑制素特异性结合蛋白、IL-4受体特异性结合蛋白、IL1-R1特异性结合蛋白、Ang2特异性结合蛋白、NGF-特异性结合蛋白、CD22特异性结合蛋白、IGF-1受体特异性结合蛋白、B7RP-1特异性结合蛋白、IFN γ特异性结合蛋白、TALL-1特异性结合蛋白、干细胞生长因子、Flt-3配体和IL-17受体。
22.根据权利要求1、5、7、9、11、13或14中任一项的组合物，其中所述的蛋白选自与下面物质中的一种或多种特异性地结合的蛋白CD3、CD4、CD8、CD19、CD20、CD34；HER2、HER3、HER4、EGF受体；LFA-1、Mol、p1 50、95、VLA-4、ICAM-1、VCAM、αv/β3整联蛋白；血管内皮细胞生长因子(“VEGF”)；生长激素、促甲状腺激素、促卵泡激素、促黄体生成激素、生长激素释放因子、甲状旁腺素、副中肾管抑制物质、人巨噬细胞炎性蛋白(MIP-1-α)、红细胞生成素(EPO)、NGF-β、血小板衍生生长因子(PDGF)、aFGF、bFGF、表皮生长因子(EGF)、TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3、TGF-β4、TGF-β5、IGF-I、IGF-II、脱(1-3)-IGF-I(脑IGF-I)、胰岛素、胰岛素A-链、胰岛素B-链、胰岛素原、胰岛素样生长因子结合蛋白；例如，因子VIII、组织因子、假血友病因子、蛋白C、α-1-抗胰蛋白酶、血纤维蛋白溶解酶原活化剂，例如尿激酶和组织纤溶酶原激活物(“t-PA”)、邦巴辛毛葛、凝血酶和促血小板生成素；M-CSF、GM-CSF、G-CSF、白蛋白、IgE、flk2/flt3受体、肥胖症(OB)受体、骨衍生的神经营养因子(BDNF)、NT-3、NT-4、NT-5、NT-6)；松弛肽A-链、松弛肽B-链、松驰素原；干扰素-α、-β和-γ；IL-1至IL-10；AIDS包膜病毒抗原；降钙素、胰高血糖素、心钠素、肺表面活性剂、肿瘤坏死因子-α和-β、脑啡肽酶、RANTES、与小鼠促性腺激素-有关的肽、脱氧核糖核酸酶、抑制素、和活化素；蛋白A或D、骨形态发生蛋白(BMP)、超氧化物歧化酶、衰变加速因子(DAF)。
23.根据权利要求1、5、7、9、11、13或14中任一项的组合物，其中所述的蛋白选自阿克体每(干扰素-γ-1b)、活化酶(蛋白溶酶素)、艾杜糖醛酸苷酶(拉罗尼酶)、基因癣康(阿法赛特)、阿伏尼克斯(干扰素β-1a)、重组DNA源凝血因子IX(诺那凝血酶α)、百若木恩(他索纳明)、Beatseron(干扰素-β-1b)、BEXXAR(托西莫单抗)、Tev-Tropin(促生长激素)、重组抗血友病因子浓缩物或RECOMBINATE(重组体)、重组葡糖脑苷脂酶(伊米苷酶)、恩利(依那西普)、红细胞生成素(依泊丁α)、怡泼津/异丙嗪(红细胞生成素α)、法布里酶(α半乳糖苷酶β)、Fasturtec/ElitekELITEK(拉布立酶)、副甲状腺激素(特立帕肽)、健豪宁(促生长激素)、果开康(胰高血糖素)、胰高血糖素(胰高血糖素，rDNA源)、果纳芬(促滤泡素α)、凝血因子VIII FS(辛凝血素α)、HERCEPTIN(曲妥单抗)、HUMATROPE(促生长激素)、HUMIRA(阿达木单抗)、在溶液中的胰岛素、INFERGEN(干扰素αcon-1)、KINERET(阿那白滞素)、凝血因子VIII FS(抗血友病因子)、白细胞素(沙莫司亭重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhuGM-CSF))、坎帕斯(阿仑单抗)、RITUXAN(美罗华)、TNKase(替奈普酶)、MYLOTARG(吉姆单抗奥佐米星)、NATRECOR(奈西立肽)、ARANESP(促红血球生成素α)、NEULASTA(聚乙二醇化非格司亭)、NEUMEGA(奥普瑞白介素)、NEUPOGEN(非格司亭)、NORDITROPIN CARTRIDGES(促生长激素)、NOVOSEVEN(依他凝血素α)、NUTROPIN AQ(促生长激素)、Oncaspar(培门冬酶)、ONTAK(地尼白介素2)、ORTHOCLONE OKT(莫罗单抗-CD3)、OVIDREL(绒膜促性腺激素α)、PEGASYS(聚乙二醇干扰素α-2a)、PROLEUKIN(阿地白介素)、PULMOZYME(去氧核糖核酸酶α)、纤溶酶原激活因子(瑞替普酶)、含有REBETOL(利巴韦林)和INTRONA(干扰素α-2b)的REBETRON联合治疗、REBIF(干扰素β-1a)、REFACTO(抗血友病因子)、REFLUDAN(重组水蛭素)、REMICADE(英夫利昔单抗)、REOPRO(阿昔单抗)ROFERON-A(干扰素α-2a)、SIMULECT(baasiliximab)、SOMAVERT(Pegivisomant)、SYNAGIS(帕利珠单抗)、Stemben(Ancestim，干细胞因子)、THYROGEN、INTRONA(干扰素α-2b)、PEG-INTRON(聚乙二醇干扰素α-2b)、XIGRIS(Drotrecoginα活化的)、XOLAIR(Omalizumab)、ZENAPAX(达克珠单抗)和ZEVALIN(替伊莫单抗)。
24.根据权利要求1、5、7、9、11、13或14中任一项的组合物，其中所述的蛋白是Ab-hOPGL或其片段，或Ab-hOPGL的变体或衍生物或其片段，或Ab-hOPGL相关蛋白质或其片段，或其任何修饰。
25.根据权利要求1、5、7、9、11、13或14中任一项的组合物，其中所述的蛋白是Ab-hOPGL。
26.根据权利要求1、5、7、9、11、13或14中任一项的组合物，其中所述的蛋白是Ab-hIL4R或其片段，或Ab-hIL4R的变体或衍生物或其片段，或Ab-hIL4R相关蛋白质或其片段，或其任何修饰。
27.根据权利要求1、5、7、9、11、13或14中任一项的组合物，其中所述的蛋白是Ab-hIL4R。
28.根据权利要求1、5、7、9、11、13或14中任一项的组合物，其中所述的蛋白是Ab-hB7RP1或其片段，或Ab-hB7RP1的变体或衍生物或其片段，或Ab-hB7RP1相关蛋白质或其片段，或其任何修饰。
29.根据权利要求1、5、7、9、11、13或14中任一项的组合物，其中所述的蛋白是Ab-hB7RP1。
30.一种冻干制剂，其当重建时提供权利要求1、5、7、9、11、13或14中任一项的组合物。
31.试剂盒，其在一个或多个容器中包含根据权利要求1、5、7、9、11、13或14中任一项的组合物以及关于所述组合物的使用说明书。
32.试剂盒，其在一个或多个容器中包含根据权利要求31的冻干制剂以及关于所述冻干制剂的使用说明书。
33.一种治疗受试者的方法，包括以治疗有效量并且通过治疗有效的途径给予受试者根据权利要求1、5、7、9、11、13或14中任一项的组合物。
34.制备权利要求1、5、7、9、11、13或14中任一项的组合物的方法，包括使用反离子除去残余的缓冲剂。
35.制备权利要求34的组合物的方法，包括在一种或多种反离子存在下使用下列中的任何一种除去残余的缓冲剂空间排阻层析、透析、和/或切向流过滤。
36.制备权利要求35的组合物的方法，包括使用离子交换色谱除去残余的缓冲剂。
37.制备权利要求1、5、7、9、11、13或14中任一项的组合物的方法，包括通过对着具有低于所需pH的pH的无缓冲溶液进行渗滤而除去残余缓冲剂。
38.制备权利要求37的组合物的方法，其中在渗滤后，通过加入稀酸和/或稀碱将pH调节到所需的pH。
39.一种冻干制剂，其当重建时提供权利要求20的组合物。
40.试剂盒，其在一个或多个容器中包含权利要求20的组合物以及关于所述组合物的使用说明书。
41.试剂盒，其在一个或多个容器中包含权利要求40的冻干制剂以及关于所述冻干制剂的使用说明书。
42.一种治疗受试者的方法，包括以治疗有效量和治疗有效的途径给予受试者权利要求20的组合物。
43.制备权利要求20的组合物的方法，包括使用反离子除去残余的缓冲剂。
44.制备权利要求43的组合物的方法，包括在一种或多种反离子存在下使用下列中的任何一种除去残余的缓冲剂空间排阻层析、透析和/或切向流过滤。
45.制备权利要求43的组合物的方法，包括使用离子交换色谱除去残余的缓冲剂。
46.权利要求20的组合物的制备方法，包括通过对着具有低于所需pH的pH的无缓冲溶液进行渗滤而除去残余的缓冲剂。
47.制备权利要求46的组合物的方法，其中在渗滤后，通过加入稀酸和/或稀碱将pH调节到所需的pH。
48.一种冻干制剂，当其重建时，提供权利要求21的组合物。
49.试剂盒，其在一个或多个容器中包含权利要求21的组合物以及关于所述组合物的使用说明书。
50.试剂盒，其在一个或多个容器中包含权利要求49的冻干制剂以及关于所述冻干制剂的使用说明书。
51.一种治疗受试者的方法，包括给予受试者以治疗有效量和有效途径的权利要求21的组合物。
52.制备权利要求21的组合物的方法，包括使用反离子除去残余的缓冲剂。
53.制备权利要求52的组合物的方法，包括在反离子存在下使用下列中的任何一种或多种除去残余的缓冲剂空间排阻层析、透析和/或切向流过滤。
54.制备权利要求52的组合物的方法，包括使用离子交换色谱除去残余的缓冲剂。
55.权利要求21的组合物的制备方法，包括通过对着具有低于所需pH的pH的无缓冲溶液进行渗滤而除去残余的缓冲剂。
56.制备权利要求55的组合物的方法，其中在渗滤后，通过加入稀酸和/或稀碱将pH调节到所需的pH。
57.一种冻干制剂，当其重建时，提供权利要求23的组合物。
58.试剂盒，其在一个或多个容器中包含权利要求23的组合物以及关于所述组合物的使用说明书。
59.试剂盒，其在一个或多个容器中包含权利要求57的冻干制剂以及关于所述冻干制剂的使用说明书。
60.一种治疗受试者的方法，包括以治疗有效量和治疗有效的途径给予受试者权利要求23的组合物。
61.制备权利要求23的组合物的方法，包括使用反离子除去残余的缓冲剂。
62.制备权利要求61的组合物的方法，包括在反离子存在下使用下列中的任何一种或多种除去残余的缓冲剂空间排阻层析、透析和/或切向流过滤。
63.制备权利要求61的组合物的方法，包括使用离子交换色谱除去残余的缓冲剂。
64.制备权利要求21的组合物的方法，包括通过对着具有低于所需pH的pH的无缓冲溶液进行渗滤而除去残余缓冲剂。
65.权利要求62的组合物的制备方法，其中在渗滤后，通过加入稀酸和/或稀碱将pH调节到所需的pH。
全文摘要
在此所述的本发明提供自缓冲的蛋白制剂。特别地，本发明提供适合于兽医和人医用途的自缓冲的药物蛋白制剂。该自缓冲的蛋白制剂基本上不含其它的缓冲剂，在包括用于兽医和人医用途的药物蛋白的分配和存储的延长时间周期内，稳定地保持pH。本发明还提供设计、制造和使用该制剂的方法。除其它优点外，该制剂还避免了与常规在当前用于药物用途的蛋白制剂中使用的缓冲剂有关的缺点。在这些以及其它方面，本发明可以有效地应用于各种蛋白，特别是可用于制备和使用用于兽医和医学用途的药物蛋白的自缓冲制剂，特别是用于在人受试者中治疗疾病。
文档编号A61K39/395GK101217979SQ200680021395
公开日2008年7月9日 申请日期2006年6月8日 优先权日2005年6月14日
发明者Y·R·戈卡恩, E·克拉斯, R·L·小雷梅尔, D·N·布雷姆斯, S·I·赫尔申森 申请人:安姆根有限公司