专利名称：蛋白制剂及其制备方法
蛋白制剂及其制备方法相关申请本申请要求2007年11月30日提交的美国临时申请号61/004992的优先权利益， 该优先权申请的内容通过援弓I并入本文。
背景技术：
药用蛋白制剂的一个基本原理是，必须克服某些不稳定性。蛋白的降解途径可以 分成2个不同类别，包含化学不稳定性和物理不稳定性。化学不稳定性导致蛋白的修饰， 这通过键形成或切割来实现。化学不稳定性问题的实例包括脱酰胺化、外消旋化、水解、氧 化、β消除和二硫化物交换。另一方面，物理不稳定性不会导致蛋白的共价变化。相反，它 们包含蛋白的更高级结构(二级和以上)的变化。这些包括变性、向表面吸附、聚集和沉淀 (Manning 等人，Pharm. Res. 6，903 (1989))。广泛接受的是，通过在制剂中包含其它分子，可以克服这些对药用蛋白制剂的商 业生存力和功效具有巨大影响的不稳定性。通过在溶液中包含与蛋白相互作用的赋形剂来 保持蛋白稳定、可溶和不聚集，可以提高蛋白稳定性。例如，盐化合物和其它离子物质是蛋 白制剂的非常常见的添加剂。通过以非特异性方式结合蛋白和增加热稳定性，它们辅助对 抗蛋白的变性。盐化合物(例如，NaCl, KCl)已经成功地用于商业胰岛素制品来对抗聚集 和沉淀(上文，在911)。已经证实，当用作制剂添加剂时，氨基酸(例如，组氨酸，精氨酸) 会减少蛋白二级结构的改变(Tian等人，Int' 1 J. Pharm. 355，20 (2007))。常用的添加剂 的其它实例包括多元醇材料(例如甘油和糖)和表面活性剂例如去污剂，可以是非离子型 (例如，吐温(Tween)，普卢兰尼克(Pluronic))和阴离子型(十二烷基硫酸钠)。添加剂在 所有液体商业蛋白制剂中的几乎普遍的流行，暗示着没有这样的化合物的蛋白溶液可能遇 到由不稳定性导致的降解挑战。蛋白制剂的基本目标是，维持特定蛋白以它的天然的、药学活性的形式稳定延长 的时间段，以确保药用蛋白药物的可接受的贮存期限。但是，维持蛋白在溶液中的稳定性和 溶解度，是在治疗剂中包含添加剂的药物制剂的巨大挑战。迄今为止，生物制剂需要其它赋 形剂来维持蛋白稳定性。通常，液体药物制剂含有多种稳定性添加剂。例如，用于患者自己 施用人生长激素Norditropin SimpleXx 的液体制剂含有添加剂甘露醇(一种糖醇)、组氨 酸和泊洛沙姆188 ( —种表面活性剂)来稳定激素。药物添加剂需要是可溶的、无毒的，并以对特定治疗性蛋白提供稳定作用的特 定浓度来使用。由于添加剂的稳定作用是蛋白-和浓度-依赖性的，必须小心地测试考 虑用于药物制剂的每种添加剂，以确保它不会造成不稳定性或对制剂的化学或物理构成 (make-up)产生其它负面作用。用于稳定化蛋白的成分可能造成储存期间蛋白随着时间的 稳定性或蛋白随着环境变化的稳定性的问题。通常，如下实现长贮存期限通过以冷冻形式(例如，在-80°C )储存蛋白，或通过 对蛋白进行低压冻干过程，即通过以低压冻干形式储存蛋白，在即将使用前需要重配步骤， 和从而在患者方便性方面产生显著不利。但是，为了储存而冷冻蛋白制剂可能导致局部高 浓度的蛋白和添加剂，这会在制剂内产生局部极端的PH、降解和蛋白聚集。另外，本领域技术人员熟知，冷冻和融化过程经常影响蛋白稳定性，这意味着即使以冷冻形式储存药物蛋 白也会伴有由冷冻和融化步骤导致的稳定性丧失。另外，低压冻干的第一个工艺步骤包含 冷冻，这可能不利地影响蛋白稳定性。在工业场合，在药品生产(保持(holding)步骤，储 存，再冷冻和再融化来增加药物产品填充_完工的时限和批次大小弹性)和随后的药物产 品填充-完工(低压冻干)的过程中，可能对药物蛋白进行重复的冷冻-融化处理。众所 周知，遇到蛋白不稳定性现象的风险随着药物蛋白遇到的冷冻_融化循环数目的增加而增 加，达到在重复的冷冻_融化过程中维持蛋白稳定性的制剂条件是一项挑战性的任务。在 生物药物工业中存在下述需要，即可以不产生不希望的制剂性质、特别是PH梯度、渗透性、 密度或蛋白或赋形剂浓度地冷冻和融化的制剂。基于蛋白的药物产品经常需要为了治疗功效而配制成高浓度。高度浓缩的蛋白 制剂希望用于治疗用途，因为它们能实现更小体积的剂量，限制患者不适，且其包装和储 存更经济。但是，高蛋白浓度制剂的开发存在许多挑战，包括生产挑战、稳定性挑战、分析 挑战、和尤其对于治疗蛋白而言的递送挑战。例如，蛋白的聚集、不溶性和降解的困难，通 常随着制剂中蛋白浓度的升高而增加(评论参见Shire，S.J.等人.J.Pharm.Sci.，93， 1390(2004))。添加剂可能造成以前没有观察到的不利作用，其在更低的添加剂或蛋白浓 度，提供有益作用。高浓度蛋白制剂的生产可能导致乳色、聚集和沉淀的显著问题。除了可 能发生非天然蛋白聚集和微粒形成、可逆的自联的可能性以外，可能导致增加的粘度或其 它性质，使注射递送复杂化。高粘度也可能使通过过滤方法生产高蛋白浓度复杂化。因而，药用蛋白制剂通常小心地平衡成分和浓度来增加蛋白稳定性和治疗需求， 同时限制任何不利的副作用。生物制剂应当包括稳定的蛋白(甚至在高浓度)和特定量的 赋形剂，减少潜在的治疗并发症、储存问题和总成本。随着蛋白和其它生物大分子作为药物分子获得更多关注，用于递送这样的分子的 制剂变成一个重要的问题。尽管用于治疗用途的蛋白的大规模生产取得革命性进展，这些 试剂在身体中的有效且方便的递送仍然是一个重大挑战，这归因于它们固有的理化和生物 性质，包括较差的跨生物膜渗透，大分子量，短血浆半衰期，自联，物理和化学不稳定性，聚 集，吸附和免疫原性。
发明内容
本发明指向下述令人惊奇的发现，即在水中配制的蛋白在长期液体储存或其它处 理步骤(例如冷冻/融化和低压冻干)过程中会维持溶解度以及稳定性，甚至在高浓度时。本发明涉及包含水和蛋白的蛋白水制剂的方法和组合物，其中所述蛋白是稳定 的，不需要其它试剂。具体地，本发明的方法和组合物是基于渗滤处理，其中使用水作为渗 滤介质，渗滤含有目标蛋白的第一溶液。该过程的进行，使得与水存在至少确定体积的交 换，例如5倍体积交换。通过执行本发明的方法，得到的水制剂具有与起始蛋白溶液相比显 著降低的赋形剂总百分比。例如，发现水制剂与起始蛋白溶液相比减少了 95-99%赋形剂。 尽管赋形剂减少，蛋白保持可溶，且保持它的生物活性，甚至在高浓度时。在一个方面，本发 明的方法产生这样的组合物，其包含增加浓度的蛋白，同时减少其它组分，例如离子型赋形 剂。这样，水制剂中蛋白的流体动力学直径比标准缓冲溶液例如磷酸盐缓冲盐水(PBS)中 的相同蛋白更小。
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本发明的制剂与标准的缓冲制剂相比具有许多优点。在一个方面，所述水制剂包 含高蛋白浓度，例如50-200mg/mL或更多。在本发明的制剂中可以包含所有大小的蛋白，甚 至在提高的浓度。尽管蛋白是高浓度，所述制剂具有极微小的聚集，且可以使用各种方法和 形式来储存，例如冷冻，而没有高蛋白制剂可能预见到的有害作用。本发明的制剂不需要在 常规制剂中用于稳定溶液中的蛋白的赋形剂，例如，表面活性剂和缓冲系统。作为低水平 离子型赋形剂的结果，本发明的水制剂具有低电导率，例如，小于2mS/cm。本发明的方法和 组合物也会提供具有低重量摩尔渗透压浓度的蛋白水制剂，例如，不大于30m0Smol/kg。另 外，本文所述的制剂胜过标准的制剂，因为它们具有降低的免疫原性，这是由于缺少蛋白稳 定化所需的其它试剂。本发明的方法和组合物可以用于提供包含水和任意类型的目标蛋白的水制剂。在 一个方面，本发明的方法和组合物用于大蛋白，包括大于47kDa的蛋白。抗体和其片段，包 括用于体内和体外目的的那些，是可以用于本发明的方法和组合物中的蛋白的另一个实 例。此外，制备蛋白和肽制剂必需的多步骤纯化和浓缩过程经常在组合物中引入变异 性，使得制剂的精确组成可能随批次而异。联邦规程要求药物组成在它们的制剂中高度一 致，无论生产位置或批号。本发明的方法可以用于建立在水中配制的蛋白溶液，以精确量向 其加回缓冲剂和赋形剂，以建立具有精确浓度的缓冲剂和/或赋形剂的蛋白制剂。在一个实施方案中，本发明提供了包含蛋白和水的水制剂，其中所述制剂具有某 些特征，例如，但不限于，低电导率，例如，小于约2. 5mS/cm的电导率，至少约10μ g/mL的蛋 白浓度，不超过约30m0Smol/kg的重量摩尔渗透压浓度，和/或所述蛋白具有大于约47kDa 的分子量(Mw)。在一个实施方案中，本发明的制剂具有提高的稳定性，例如，但不限于，液体 形式长时间(例如，至少约3个月或至少约12个月)的稳定性或经过至少一个冷冻/融化 循环(如果不是更多个冷冻/融化循环)的稳定性。在一个实施方案中，制剂能以选自冷 冻、低压冻干或喷雾干燥的形式稳定至少约3个月。在一个实施方案中，在本发明的制剂中包含的蛋白可以具有最小的大小，包括，例 如，大于约47kDa的Mw,大于约57kDa的Mw，大于约IOOkDa的Mw，大于约150kDa的Mw，大于 约200kDa的Mw，或大于约250kDa的Mw。在一个实施方案中，本发明的制剂具有低电导率，包括，例如，小于约2. 5mS/cm的 电导率，小于约2mS/cm的电导率，小于约1. 5mS/cm的电导率，小于约lmS/cm的电导率，或 小于约0. 5mS/cm的电导率。在一个实施方案中，在本发明的制剂中包含的蛋白具有给定的浓度，包括，例如， 至少约lmg/mL的浓度，至少约10mg/mL，至少约50mg/mL，至少约100mg/mL，至少约150mg/ mL,至少约200mg/mL，或大于约200mg/mL。在一个实施方案中，本发明的制剂具有不超过约15m0Smol/kg的重量摩尔渗透压 浓度。在一个实施方案中，本发明提供了包含水和给定浓度的蛋白的水制剂，其中所述 蛋白具有这样的流体动力学直径(Dh)，它比给定浓度的缓冲溶液中的蛋白的Dh小至少约 50%。在一个实施方案中，蛋白的Dh比给定浓度的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的蛋白的Dh小 至少约50% ；蛋白的Dh比给定浓度的PBS中的蛋白的Dh小至少约60% ；蛋白的Dh比给定
9浓度的PBS中的蛋白的Dh小至少约70%。在一个实施方案中，本发明提供了包含蛋白的水制剂，所述蛋白例如，但不限于， 抗体或抗原结合片段，其中所述蛋白具有小于约5μπι的流体动力学直径(Dh)。在一个实施 方案中，所述蛋白具有小于约3μπι的Dh。任意蛋白可以用于本发明的方法和组合物中。在一个实施方案中，所述制剂包含 治疗蛋白。在一个实施方案中，所述制剂包含抗体或其抗原结合片段。可以包含在本发明 的方法和组合物中的抗体或抗原结合片段的类型包括、但不限于，嵌合抗体，人抗体，人化 抗体和结构域抗体(dAb)。在一个实施方案中，抗体或其抗原结合片段是抗-TNFa，例如但 不限于阿达木单抗或golimumab或抗-IL-12抗体，例如但不限于J695。另外，本发明的制 剂也可以包含至少两种不同类型的蛋白，例如，阿达木单抗和J695。在本发明的另一个实施方案中，所述制剂还可以包含非可离子化赋形剂。非可离 子化赋形剂的实例包括、但不限于，糖醇或多元醇(例如，甘露醇或山梨醇)，非离子型表面 活性剂(例如，聚山梨醇酯80，聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯40，聚山梨醇酯60)，和/或糖 (例如，蔗糖)。可以在本发明的制剂中另外包含的非可离子化赋形剂的其它非限制性实例 包括、但不限于，非_海藻糖，棉子糖，和麦芽糖。在一个实施方案中，所述制剂不包含选自下述的试剂张力调节剂，稳定剂，表面 活性剂，抗氧化剂，冷冻保护剂，填充剂，冻干保护剂，碱性组分和酸性组分。本发明的制剂可以适用于任意用途，包括体外和体内用途。在一个实施方案中，本 发明的制剂适合通过下述给药模式施用给受试者，包括，但不限于，皮下的，静脉内的，吸入 的，皮内的，透过皮肤的，腹膜内的，和肌肉内的给药。本发明的制剂可以用于治疗受试者的 病症。本发明也包含可以用于递送本发明的制剂的装置。这样的装置的实例包括、但不 限于，注射器，笔，植入物，无针注射装置，吸入装置，和贴剂。在一个实施方案中，本发明的制剂是药物制剂。本发明也提供了制备包含蛋白和水的水制剂的方法，该方法包含，提供在第一溶 液中的蛋白，使用水作为渗滤介质，对第一溶液进行渗滤，直到已经实现与水至少5倍体积 交换，从而制备水制剂。在一个实施方案中，在得到的制剂中的蛋白保留它的生物活性。本发明另外提供了制备蛋白的水制剂的方法，该方法包含，提供在第一溶液中的 蛋白，使用水作为渗滤介质，对第一溶液进行渗滤，直到已经实现与水至少5倍体积交换， 从而制备渗滤过的蛋白溶液；浓缩渗滤过的蛋白溶液，从而制备蛋白的水制剂。在一个实施 方案中，在得到的制剂中的蛋白保留它的生物活性。在一个实施方案中，通过离心，浓缩渗滤过的蛋白溶液。在一个实施方案中，所述渗滤介质由水组成。在一个实施方案中，用水对所述第一溶液进行渗滤，直到实现大于5倍体积交换 的体积交换。在一个实施方案中，用水对所述第一溶液进行渗滤，直到实现至少约6倍体积 交换。在一个实施方案中，用水对所述第一溶液进行渗滤，直到实现至少约7倍体积交换。在一个实施方案中，所述水制剂中的赋形剂终浓度比第一溶液小至少约95 %。在一个实施方案中，所述水制剂中的赋形剂终浓度比第一溶液小至少约99 %。在一个实施方案中，从哺乳动物细胞表达系统得到第一蛋白溶液，且已经纯化，以
10去除宿主细胞蛋白(HCPs)。在一个实施方案中，本发明的方法还包含，向水制剂添加赋形剂。附图简述
图1显示了阿达木单抗参照标准品AFP04C (底线)、阿达木单抗DS(DF/UF处理前 (中线)和处理后(顶线)的药品)的SEC色谱图。图2显示了向DF/UF-处理过的阿达木单抗单体加入赋形剂化合物后，山梨醇(非 可离子化赋形剂)和NaCl (可离子化赋形剂)浓度对阿达木单抗单体的流体动力学直径 (Dh)的影响。图3显示了 J695参照标准品(下图)和pH调节至pH 4. 4的J695DS (上图)的 IEC图谱。图4显示了 pH 4. 7的用Mi 11 i_Q水DF/UF后的J695 (上图)和pH调节至pH 4. 4 的DF/UF之前的J695DS (下面曲线)的IEC图谱。图5用图形描述了流体动力学直径(ζ-平均值)和阿达木单抗浓度(溶于WFI) 的关系。X 使用1. IrnPas作为假定的样品粘度，用SOP测定，y 使用1. 9mPas作为假定的 样品粘度，用SOP测定。图6用图形描述了流体动力学直径(峰单体)和阿达木单抗浓度(溶于WFI)的 关系。X 使用1. IrnPas作为假定的样品粘度，用SOP测定，y 使用1. 9mPas作为假定的样 品粘度，用SOP测定。图7用图形描述了流体动力学直径(ζ-平均值)和J695浓度(溶于WFI)的关系。 X 使用1. ImPas作为假定的样品粘度，用SOP测定，y 使用1. 9mPas作为假定的样品粘度， 用SOP测定。图8用图形描述了流体动力学直径(峰单体)和J695浓度(溶于WFI)的关系。 X 使用1. ImPas作为假定的样品粘度，用SOP测定，y 使用1. 9mPas作为假定的样品粘度， 用SOP测定。图9显示了依赖于注射用水中阿达木单抗浓度的阿达木单抗的赖氨酸0、1和2的 总和]。图10显示了依赖于注射用水中J695浓度的J695的峰1_7的总和]。图11显示了依赖于注射用水中J695浓度的J695的酸性峰的总和]。图12显示了依赖于注射用水(WFI)中J695浓度的J695的碱性峰的总和]。图13显示了在实施例12中进行的渗析的效率，显示出组分的减少导致的制剂的 重量摩尔渗透压浓度和电导率(BDS，74mg/ml，IOml样品体积，SpectraPor7 MWCO 10k)。图14显示了渗析的阿达木单抗本体溶液的PH水平的稳定性。显示出在相对于 去离子水渗析(1 1，000，000)之前和之后的pH水平(BDS，74mg/ml，10ml样品体积， SpectraPor7 MWCO10k)。图15显示了冷冻融化后250mg/ml和200mg/ml低离子型阿达木单抗溶液的瓶子
图谱密度数据。图16显示了冷冻融化后250mg/ml和200mg/ml低离子型阿达木单抗溶液的瓶子 图谱PH数据。图17显示了冷冻融化后250mg/ml和200mg/ml低离子型阿达木单抗溶液的瓶子图谱浓度数据。图18显示了冷冻融化后250mg/ml和200mg/ml低离子型阿达木单抗溶液的瓶子
图谱重量摩尔渗透压浓度数据。图19显示了冷冻融化后250mg/ml和200mg/ml低离子型阿达木单抗溶液的瓶子
图谱电导率数据。图20显示了在DF/UF后在2-8°C储存8. 5个月(下面曲线)或在DF/UF后在_80°C 储存4. 5个月(上面曲线)的低离子型阿达木单抗(在图20中称作D2E7)溶液的SEC分 析。图21显示了在冷冻-融化程序之前(TO)和在4次冷冻-融化的每一次之后(Tl， T2，T3和T4)在不同溶液和在水中配制的单克隆抗体1D4. 7的稳定性。图22显示了在冷冻-融化程序之前(TO)和在4次冷冻-融化的每一次之后(Tl， T2，T3和T4)在水中和用不同缓冲剂配制的单克隆抗体13C5. 5的稳定性。空白=WFI对 照样品。图23显示了在冷冻-融化程序之前(TO)和在4次冷冻-融化的每一次之后(Tl， T2，T3和Τ4)在水中和添加不同赋形剂配制的单克隆抗体13C5. 5的稳定性。空白=WFI对 照样品。图24显示了阿达木单抗浓度(WFI制剂)和溶液ρΗ对溶液粘度的影响。图25显示了不同浓度和ρΗ值的阿达木单抗溶液(WFI制剂)的浊度数据。图26显示了不同PH值和浓度的阿达木单抗溶液(WFI制剂)的流体动力学直径 (Dh)数据。图27显示了不同浓度的阿达木单抗在ρΗ5水溶液中的按强度的大小分布图(Dh测
量)O图28显示了 lOOmg/mL阿达木单抗在不同ρΗ水平的水中的按强度的大小分布。图29也显示了 100mg/mL阿达木单抗在不同ρΗ水平的水中的按强度的大小分布。图30显示了水中阿达木单抗的单体含量(SEC)。图31显示了水中阿达木单抗的聚集体含量(SEC)。图32显示了作为溶液温度的函数的2种J695溶液(WFI制剂)的粘度。图33用图形描述了在许多不同制剂的重复冷冻/融化(f/t)循环过程中通过在 显微镜下才能看得见的颗粒(> 1 μ m)测量的1D4. 7抗体稳定性。图34用图形描述了在许多不同制剂的重复冷冻/融化(f/t)循环过程中通过在 显微镜下才能看得见的颗粒(> 10 μ m)测量的13C5. 5抗体稳定性。图35用图形描述了在许多不同制剂的重复冷冻/融化(f/t)循环过程中通过在 显微镜下才能看得见的颗粒(> 1 μ m)测量的13C5. 5抗体稳定性。图36用图形描述了在许多不同制剂的重复冷冻/融化(f/t)循环过程中通过在 显微镜下才能看得见的颗粒(> 1 μ m)测量的7C6抗体稳定性。发明详述I.定义为了更容易地理解本发明，首先定义一些术语。本文使用的术语"酸性组分"是指具有酸性pH(即小于7. 0)的试剂，包括溶液。酸性组分的实例包括磷酸，盐酸，醋酸，柠檬酸，草酸，琥珀酸，酒石酸，乳酸，苹果酸，羟乙酸 和富马酸。在一个实施方案中，本发明的水制剂不包含酸性组分。本文使用的术语“抗氧化剂“意在表示会抑制氧化并从而用于预防氧化过程对 制品的破坏的试剂。这样的化合物包括，作为实例且不限于，丙酮，硫酸氢钠，抗坏血酸，抗 坏血酸棕榈酸酯，柠檬酸，丁基化的羟基茴香醚，丁基化的羟基甲苯，氢化亚磷酸，单硫代甘 油，没食子酸丙酯，蛋氨酸，抗坏血酸钠，柠檬酸钠，硫化钠，亚硫酸钠，亚硫酸氢钠，甲醛合 次硫酸氢钠，巯基乙酸，偏亚硫酸氢钠，EDTA(乙二胺四乙酸盐)，三胺五乙酸和本领域普通 技术人员已知的其它抗氧化剂。术语"水制剂"是指其中溶剂是水的溶液。本文使用的术语"碱性组分"是指碱性(即PH大于7. 0)的试剂。碱性组分的实 例包括氢氧化钾(KOH)和氢氧化钠(NaOH)。本文使用的术语"填充剂"意在表示用于增加可重配的固体的体积和/或在制 备过程中辅助控制制剂的性质的化合物。这样的化合物包括，作为实例且不限于，葡聚糖， 海藻糖，蔗糖，聚乙烯吡咯烷酮，乳糖，肌醇，山梨醇，二甲基亚砜，甘油，白蛋白，乳糖醛酸 钙，和本领域普通技术人员已知的其它填充剂。本文使用的术语"电导率"是指水溶液在两个电极之间传导电流的能力。一般而 言，导电性或比导电率是物质的传导电流的度量。在溶液中，电流通过离子运输来流动。因 此，随着水溶液中存在的离子数量的增加，溶液会具有更高的电导率。电导率的度量单位 是mmhos(mS/cm)，可以使用出售的电导率计量器来测量，例如，购自OrionResearch，Inc. (Beverly,MA)0通过改变其中的离子浓度，可以改变溶液的电导率。例如，可以改变溶液中 离子型赋形剂的浓度，以便实现希望的电导率。本文使用的术语“冷冻保护剂“概括地包括为蛋白提供对抗冷冻诱发的应激的 稳定性的试剂。冷冻保护剂的实例包括多元醇例如甘露醇，且包括糖例如蔗糖，以及包括表 面活性剂例如聚山梨醇酯、泊洛沙姆或聚乙二醇，等。冷冻保护剂也有助于制剂的张力。本文使用的术语"超滤"或"UF"是指其中对溶液或悬浮液进行半透膜处理的 任意技术，所述半透膜截留下大分子并允许溶剂和小溶质分子穿过。超滤可以用于增加溶 液或悬浮液中大分子的浓度。在一个优选的实施方案中，超滤用于增加蛋白在水中的浓度。本文使用的术语"渗滤"或"DF"用于指一类专门的过滤，其中用溶剂稀释渗余 物，并再次过滤，以降低可溶的渗透物组分的浓度。渗滤可以导致或不导致截留组分(包 括，例如，蛋白)的浓度的增加。例如，在连续渗滤中，以与产生滤液相同的速率将溶剂连续 加入渗余物。在该情况下，渗余物体积和截留组分的浓度在过程中不变。另一方面，在不连 续的或序贯的稀释渗滤中，在超滤步骤之后是向渗余物侧加入溶剂；如果加入渗余物侧的 溶剂的体积不等于或大于产生的滤液的体积，则截留组分会具有高浓度。渗滤可以用于改 变大分子溶液或悬浮液的PH、离子强度、盐组成、缓冲液组成或其它性质。本文使用的术语"渗滤/超滤"或"DF/UF"是指序贯或同时完成超滤和/或渗 滤的任意过程、技术或技术组合。本文使用的术语"渗滤步骤"是指在渗滤处理中总体积交换。术语"赋形剂"是指可以加入制剂中来提供希望的稠度(例如，改变容积性质)、 提高稳定性和/或调节重量摩尔渗透压浓度的试剂。常用的赋形剂的实例包括、但不限于，
13糖，多元醇，氨基酸，表面活性剂，和聚合物。在本文中可互换使用的术语"离子型赋形剂" 或"可离子化赋形剂"是指具有净电荷的试剂。在一个实施方案中，离子型赋形剂在某些 制剂条件(例如PH)下具有净电荷。离子型赋形剂的实例包括、但不限于，组氨酸，精氨酸， 和氯化钠。在本文中可互换使用的术语"非离子型赋形剂"或"非可离子化赋形剂"是指 不具有净电荷的试剂。在一个实施方案中，非离子型赋形剂在某些制剂条件(例如PH)下 不具有净电荷。非离子型赋形剂的实例包括、但不限于，糖(例如，蔗糖)，糖醇(例如，甘露 醇)，和非离子型表面活性剂(例如，聚山梨醇酯80)。本文使用的术语"第一蛋白溶液"或"第一溶液"是指用于本发明的方法中的 起始蛋白溶液或原料，即渗滤进水的起始蛋白溶液。在一个实施方案中，第一蛋白溶液包含 离子型赋形剂、非离子型赋形剂和/或缓冲系统。术语颗粒的"流体动力学直径"或"Dh"是指具有水的密度和与颗粒相同的速 度的球的直径。因而，本文使用的术语"蛋白的流体动力学直径"是指使用动态光散射 (DLS)测得的溶液中蛋白的大小。DLS-测量仪器会以固定的散射角测量从溶液中的蛋白散 射的光的强度的时间依赖性波动。从强度的时间依赖性波动的强度自相关函数确定蛋白 Dh。使用DLS仪器软件处理散射强度数据，以确定散射分子(即蛋白样本)的流体动力学 直径的值和尺寸分布。本文使用的术语"冻干保护剂"包括在干燥或冷冻干燥过程中去除水时为蛋白 提供稳定性的试剂，例如，通过维持蛋白的适当构象。冻干保护剂的实例包括糖，尤其二糖 或三糖。冷冻保护剂也可以提供冻干保护剂效应。当提及组合物例如水制剂时，本文使用的术语"药物"可以用于治疗疾病或病症。术语"蛋白"意在包括这样的氨基酸序列，其链长度足以产生更高水平的二级和 /或三级和/或四级结构。这是为了区别于不具有这种结构的"肽"或其它小分子量药物。 在一个实施方案中，本文使用的蛋白具有至少约47kD的分子量。在本文使用的定义中包含 的蛋白的实例包括治疗蛋白。“治疗活性的蛋白"或"治疗蛋白"是指可以用于治疗目的 (即用于治疗受试者的病症)的蛋白。应当指出，尽管治疗蛋白可以用于治疗目的，本发明 不限于这样的用途，因为所述蛋白也可以用于体外研究。在一个优选的实施方案中，治疗蛋 白是融合蛋白或抗体或其抗原结合部分。在一个实施方案中，本发明的方法和组合物包含 至少两种不同的蛋白，它们定义为具有不同氨基酸序列的两种蛋白。其它不同的蛋白不包 括蛋白的降解产物。本文使用的短语"将蛋白溶于水"是指蛋白制剂，其中将蛋白溶于已经通过DF/ UF处理减少其中小分子(例如，缓冲剂，赋形剂，盐，表面活性剂)的数量的水溶液。尽管通 过DF/UF处理不能在绝对意义上完全消除小分子，通过应用DF/UF可实现的理论上的赋形 剂减少足以排它地主要在水中建立蛋白制剂。例如，以连续模式DF/UF方法使用6体积交 换，理论上的赋形剂减少是 99. 8% (ci = e_x，其中ci是起始赋形剂浓度，χ是体积交换 数目)。术语"药物制剂"是指这样的制品，其形式允许活性成分的生物活性有效、且因 此可以施用给受试者用于治疗用途。“稳定的"制剂是这样的制剂，其中的蛋白在储存后基本上保留它的物理稳定性
14和/或化学稳定性和/或生物活性。用于测量蛋白稳定性的各种分析技术可从本领域获 知，评论见，例如，P 印 tide and ProteinDrug Delivery, 247-301, Vincent Lee Ed. ,Marcel Dekker, Inc. , NewYork, N. Y. , Pubs. (1991)禾口 Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10 29-90(1993)。在一个实施方案中，根据溶液中单体蛋白的百分比，降解的(例如，破碎的) 和/或聚集的蛋白的低百分比，确定蛋白的稳定性。例如，包含稳定蛋白的水制剂可以包括 至少95%单体蛋白。或者，本发明的水制剂可以包括不超过5%聚集体和/或降解的蛋白。术语"稳定剂"是指提高或另外地增强稳定性的赋形剂。稳定剂包括、但不限于， α -硫辛酸，α -生育酚，抗坏血酸棕榈酸酯，苯甲醇，生物素，重亚硫酸盐，硼，丁基化的羟 基茴香醚(BHA)，丁基化的羟基甲苯(BHT)，抗坏血酸和它的酯，类胡萝卜素，柠檬酸钙，乙 酰基-L-肉碱，螯合剂，软骨素，铬，柠檬酸，辅酶Q-10，半胱氨酸，半胱氨酸盐酸盐，3-去氢 莽草酸(DHS)，EDTA(乙二胺四乙酸；乙二胺四乙酸二钠)，硫酸亚铁，叶酸，富马酸，没食子 酸烷基酯，大蒜，葡糖胺，葡萄籽提取物，gugul，镁，苹果酸，偏亚硫酸氢盐，N-乙酰基半胱氨 酸，烟酸，烟酰胺，荨麻根，鸟氨酸，没食子酸丙酯，pycnogenol，沙巴棕，硒，亚硫酸氢钠，偏 重亚硫酸钠，亚硫酸钠，亚硫酸钾，酒石酸，硫代硫酸盐，硫代甘油，硫代山梨醇，生育酚和它 们的酯，例如，生育酚醋酸酯，生育酚琥珀酸酯，tocotrienal, d_ α -生育酚醋酸酯，维生素 A和它的酯，维生素B和它的酯，维生素C和它的酯，维生素D和它的酯，维生素E和它的酯， 例如，维生素E醋酸酯，锌，和它们的组合。术语"表面活性剂"概括地包括这样的试剂，它们保护蛋白免受空气/溶液界面 诱发的应激和溶液/表面诱发的应激。例如表面活性剂可以保护蛋白免于聚集。合适的 表面活性剂可以包括，例如，聚山梨醇酯，聚氧乙烯烷基醚例如Brij 35. RTM.或泊洛沙姆 例如吐温20，吐温80或泊洛沙姆188。优选的去污剂是泊洛沙姆，例如，泊洛沙姆188，泊 洛沙姆407 ；聚氧乙烯烷基醚，例如Brij 35. RTM.，克列莫佛(Cremophor)Α25, Sympatens ALM/230 ；和聚山梨醇酯/吐温，例如，聚山梨醇酯20，聚山梨醇酯80，和泊洛沙姆，例如，泊 洛沙姆188，和吐温，例如，吐温20和吐温80。本文使用的术语"张力调节剂"意在表示可以用于调节液体制剂的张力的一种 或复数种化合物。合适的张力调节剂包括甘油，乳糖，甘露醇，右旋糖，氯化钠，硫酸镁，氯化 镁，硫酸钠，山梨醇，海藻糖，蔗糖，棉子糖，麦芽糖和本领域普通技术人员已知的其它物质。 在一个实施方案中，液体制剂的张力接近血液或血浆的张力。术语"水"意在表示已经纯化(通常通过蒸馏或反渗透)去除污染物的水，在本 文中也指"纯水"。在一个优选的实施方案中，在本发明的方法和组合物中使用的水不含 有赋形剂。在一个实施方案中，水包括适合施用给受试者的无菌水。在另一个实施方案中， 水意在包括注射用水(WFI)。在一个实施方案中，水是指蒸馏水或适用于体外试验的水。在 一个优选的实施方案中，仅使用水作为渗滤介质，根据本发明的方法进行渗滤。本文使用的术语"抗体"包括完整抗体和其任意抗原结合片段(即"抗原结合 部分")或单链。“抗体"是指包含通过二硫键相互连接的至少2个重(H)链和2个轻(L) 链的糖蛋白或其抗原结合部分。每个重链包含一个重链可变区(在本文中缩写为Vh)和一 个重链恒定区。重链恒定区包含3个结构域，CH1，CH2和CH3。每个轻链包含一个轻链可变 区(在本文中缩写为VJ和一个轻链恒定区。轻链恒定区包含一个结构域CL。Vh和八区 域可以进一步细分成称作互补性守的区域中。每个Vh和\由3个CDR和4个FR组成，它们按照下述次序从氨基端向羧基 端排列=FRl，CDRl，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用 的结合结构域。抗体的恒定区可以介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，所述因子包 括免疫系统的不同细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(Clq)。本文使用的术语抗体的“抗原结合部分"(或简称"抗体部分")是指抗体的一 个或更多个片段，其保留特异性地结合抗原(例如，TNFa，IL_12)的能力。已经证实，抗体 的抗原结合功能可以由全长抗体的片段来实现。术语抗体的"抗原结合部分"所包含的结 合片段的实例包括(i)Fab片段，由\、VH、CL和CHl结构域组成的单价片段；(ii)F(ab' )2 片段，包含在铰链区通过二硫桥连接的2个Fab片段的二价片段；(iii)由Vh和Cm结构域 组成的Fd片段；(iv)由抗体的单个臂的\和Vh结构域组成的Fv片段，(v) dAb片段(Ward 等人，(1989)Nature341 544-546)，它由Vh或八结构域组成；和(vi)分离的互补性决定区 (CDR)。此外，尽管Fv片段的2个结构域\和Vh由分开的基因编码，使用重组方法，可以通 过合成的连接物使它们结合，将它们制成单个蛋白链，其中\和Vh区域配对，形成单价分子 (称作单链 Fv(scFv)；参见例如，Bird 等人(1988) Science 242 :423_426 ；和 Huston 等人 (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 =5879-5883)。这样的单链抗体也包含在术语抗体的" 抗原结合部分"中。使用本领域技术人员已知的常规技术，得到这些抗体片段，并以与完整 抗体相同的方式，筛选片段的效用。在本发明的一个实施方案中，抗体片段选自Fab，Fd， Fd'，单链 Fv (scFv)，scFva,和结构域抗体(dAb)。更进一步，抗体或其抗原结合部分可以是更大的免疫粘附分子的一部分，所述更 大的免疫吸附分子由抗体或抗体部分与一个或更多个其它蛋白或肽的共价或非共价缔 合来形成。这些其它蛋白或肽可以具有下述功能，即允许纯化抗体或其抗原结合部分或 允许它们彼此或与其它分子缔合。因而，这样的免疫粘附分子的实例包括使用抗生蛋白 链菌素核心区来制备四聚体单链可变片段(scFv)分子(Kipriyanov等人(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6 :93_101)和使用半胱氨酸残基、标记肽和C-末端聚组氨 酸标签来制备二价和生物素化的scFv分子(Kipriyanov等人(1994)Mol. Immunol. 31 1047-1058)。使用常规技术，例如分别用木瓜蛋白酶或胃蛋白酶消化完整抗体，可以从完整 抗体制备抗体部分，例如Fab和F(ab' )2片段。此外，使用标准的重组DNA技术，可以得到 抗体、抗体部分和免疫粘附分子。当它们属于形成同源对或组的结构家族或源自这样的家族且保留该特征时，2个 抗体结构域是"互补的"。例如，抗体的Vh结构域和\结构域是互补的；2个Vh结构域不 是互补的，2个\结构域不是互补的。在免疫球蛋白超家族的其它成员中可以发现互补结 构域，例如T-细胞受体的V α和νβ (或γ和δ)结构域。术语"结构域"是指折叠的蛋白结构，其独立于蛋白的其它部分地保留它的三级 结构。一般而言，结构域负责蛋白的独立的功能性质，且在许多情况下，可以添加、去除或转 移至其它蛋白，而不丧失蛋白的剩余部分和/或结构域的功能。单个抗体可变结构域是指 折叠的多肽结构域，其包含抗体可变结构域的序列特征。因此，它包括完整的抗体可变结构 域和修饰的可变结构域，例如其中一个或更多个环被替换为不是抗体可变结构域特征性的 序列，或已经截短的或包含N-或C-末端延伸的抗体可变结构域，以及至少部分地保留全长 结构域的结合活性和特异性的折叠的可变结构域片段。
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可以组合本发明的可变结构域，形成一组结构域；例如，可以组合互补结构域，例 如\结构域可以与Vh结构域组合。也可以组合非互补结构域。可以以许多方式组合结构 域，包含通过共价或非共价方式连接结构域。“ dAb"或"结构域抗体"是指特异性地结合抗原的单个抗体可变结构域(Vh或 Vl)多肽。本文使用的术语"抗原结合区"或"抗原结合部位"是指抗体分子的部分或其 抗原结合部分，它含有与抗原相互作用的氨基酸残基，且赋予抗体对抗原的特异性和亲和 力。
术语"表位"意在指能在一个或更多个抗体的抗原结合区被抗体识别和结合的 任意分子的部分。在本发明的上下文中，第一和第二"表位"理解为不同的且不被单个单 特异性抗体或其抗原结合部分结合的表位。短语"重组抗体"是指通过重组方式制备的、表达的、建立的或分离的抗体，例如 使用转染进宿主细胞的重组表达载体表达的抗体，从重组的、组合的抗体文库分离的抗体， 从人免疫球蛋白基因的转基因动物(例如，小鼠)分离的抗体(参见例如，Taylor等人 (1992)Nucl. AcidsRes. 20 =6287-6295)或通过任意其它方式制备、表达、建立或分离的抗 体，所述其它方式包括将特定免疫球蛋白基因序列(例如人免疫球蛋白基因序列)剪接到 其它DNA序列。重组抗体的实例包括嵌合的、⑶R-移植的和人化的抗体。术语〃人抗体〃是指具有与例如Kabat等人(参见Kabat，等人(1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest,第 5版,U. S. Department of Health and Human Services,NIH公开号91-3242)所述的人种系免疫球蛋白序列相对应的或源自它们的可变 区和恒定区的抗体。但是，本发明的人抗体可以包括不是由人种系免疫球蛋白序列编码的 氨基酸残基(例如，通过随机的或位点特异性的体外诱变或通过体内体细胞突变引入的突 变)，例如在⑶Rs和尤其⑶R3中。本发明的重组人抗体具有可变区，也可以包含恒定区域，它们源自人种系免疫球 蛋白序列(参见 Kabat 等人(1991) Sequences ofProteins of Immunological Interest, 第 5 版，U. S. D^artment of Healthand Human Services，NIH
发明者A·巴特, H-J·克洛司, K·卡乐塔, M·泰斯寇普, W·福仑贺夫 申请人:雅培制药有限公司