毒素产生性艰难梭菌的检测方法
【专利摘要】本发明提供一种能够特异性地且以高灵敏度检测毒素产生性艰难梭菌（C.difficile）的寡核苷酸、以及使用该寡核苷酸的毒素产生性艰难梭菌的检测方法。1）包括由序列号1所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号2所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或者由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。2）包括由序列号4所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或者由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。
【专利说明】毒素产生性艰难梭菌的检测方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及用于检测毒素产生性艰难梭菌(Clostridium difficile)的寡核苷酸和使用该寡核苷酸的毒素产生性艰难梭菌的检测方法。
【背景技术】
[0002]艰难梭菌(C.difficile)是产生对于人为病原性的菌体外毒素的芽胞形成革兰氏阳性杆菌。由该菌引起的C.difficile相关性腹泻症(CDAD)近年来成为很大的问题(非专利文献I)。即，抗生素或抗癌剂等的过度使用使正常的肠内细菌菌群受到损害，结果使增殖的C.difficile产生毒素TcdA和TcdB，发生腹泻等症状。已知C.difficile出现在感染的人的粪便中，经由器物或手等到达人的口或粘膜而感染。
[0003]C.difficile 的病原性主要是由属于 Large Clostridial Toxin (LCTs)家族的
2种毒素TcdA和TcdB造成的，C.difficile的各菌株根据它们的毒素产生性的不同，大致分为TcdA产生TcdB产生型(A+B+)、TcdA非产生TcdB产生型(A-B+)以及毒素非产生型(Α-B-)。另外，C.difficile的毒素产生体系据认为由tcdA和tcdB、以及编码它们的调节因子的tcdC, tcdR, tcdE构成的病原性座位形成,有报告当对毒素的产生进行负调控的tcdC缺陷时，毒素TcdA和TcdB产生亢进。
[0004]因此，仅选择性地检测毒素产生性C.difficile (A+B+和A_B+)，在CDAD等的C.difficile 感染症(Clostridium difficile infection:CDI)在临床诊断上很重要。
[0005]以往，对于毒素产生性C.difficile的检测，报告了几条以毒素基因tcdA和tcdB为靶标的引物，能够使用这些引物从粪便提取DNA中检测该基因(非专利文献2 — 4、专利文献I)。
[0006]然而，由于C.difficile在健康人肠道的菌数水平低，所以为了使用PCR检测粪便中的毒素产生株，需要构建具有更高的特异性和检测灵敏度这两者的检测体系，在该点上，可以说还不充分。
[0007]现有技术文献
[0008]专利文献
[0009]专利文献1:日本特开2003 - 164282号公报
[0010]非专利文献
[0011]非专利文献1:Rupnik, M.，M.H.Wilcox, and D.N.Gerding., Nat RevMicrobiol.20097:526-36
[0012]非专利文献2:Belanger, S.D.，M.Boissinot, N.Clairoux, F.J.Picard, andM.G.Bergeron., J Clin Microbiol.200341:730-4
[0013]非专利文献3:Houser, B.A., A.L.Hattel, and B.M.Jayara0., Foodborne PathogDis.20107:719-26.[0014]非专利文献4:Sloan, L.M., B.J.Duresko, D.R.Gustafson, and J.E.Rosenblatt., JClin Microbiol.200846:1996-2001
【发明内容】
[0015]发明所要解决的课题
[0016]本发明涉及提供能够特异性地且以高灵敏度检测毒素产生性C.difficile的寡核苷酸、以及使用该寡核苷酸的毒素产生性C.difficile的检测方法。
[0017]用于解决课题的方法
[0018]本发明的发明人等鉴于上述课题，发现通过将20个菌株的tcdA基因序列、22个菌株的tcdB基因序列、以及作为索氏梭菌(Clostridium sordelii)的毒素基因tcsL、作为诺氏梭菌(Clostridium novyi)的毒素基因tcnA和作为产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)的毒素基因tcpL的碱基序列一起比对,设计得到特定的寡核苷酸,使用该寡核苷酸扩增tcdA基因和tcdB基因并测定，由此，能够特异性地且以优异的灵敏度检测毒素产生性的C.difficile。
[0019]本发明涉及以下的I)~10)。
[0020]I)包括由序列号I所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号2所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或者由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。
[0021]2)由序列号3所示的碱基序列构成的寡核苷酸探针、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针。
[0022]3)上述2)的寡核苷酸探针,其中,在寡核苷酸的5’末端结合有突光物质,在3’末端结合有粹灭物质。
[0023]4)具备上述I)的引物对和上述3)的寡核苷酸探针的实时PCR用的寡核苷酸组。
[0024]5)包括由序列号4所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或者由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。 [0025]6)由序列号6所示的碱基序列构成的寡核苷酸探针、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针。
[0026]7)上述6)寡核苷酸探针,其中,在寡核苷酸的5’末端结合有突光物质,在3’末端结合有猝灭物质。
[0027]8)具备上述5)的引物对和上述7)的寡核苷酸探针的实时PCR用的寡核苷酸组。
[0028]9) 一种毒素产生性C.difficile的检测方法，其包括:以从人粪便提取的DNA为模板，使用上述4)或8)的寡核苷酸组分别进行PCR的工序；和通过测定荧光来测定扩增产物的工序。
[0029]10) 一种人粪便中的C.difficile中毒素产生性C.difficile和/或非毒素产生性C.difficile的存在比率的计算方法，其包括:以从人粪便提取的DNA为模板，使用上述4)和/或8)的寡核苷酸组、以及以下表示的(a)的引物对或具备(a)的引物对和(b)的寡核苷酸探针的实时PCR用的寡核苷酸组，分别进行PCR的工序；和通过测定荧光来测定扩增产物的工序。
[0030](a)包括由序列号7所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号8所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。
[0031](b)由序列号9所示的碱基序列构成的寡核苷酸探针、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针，其中，在该寡核苷酸的5’末端结合有荧光物质，在3’末端结合有猝灭物质。[0032]发明的效果
[0033]根据本发明的寡核苷酸和毒素产生性C.difficile的检测方法，能够特异性地且以高灵敏度检测粪便中的毒素产生性C.difficile。因此，根据本发明，能够简易且准确地进行毒素产生性C.difficile感染症的诊断，而且能够容易地调查健康成人的粪便中的毒素产生性C.difficile株的检出频率。另外，通过同时测定C.difficile的总菌数，就能够对于粪便中的C.difficile算出毒素产生性C.difficile或非毒素产生性C.difficile的存在比率。
【专利附图】
【附图说明】
[0034]图1 在 TaqMan PCR 法中对于靶标菌的反应性(A:tcdA_F/R/P、B:tcdB-F/R/P)
[0035]图2在TaqMan PCR法中对粪便中的靶标菌的检测灵敏度(A:tcdA_F/R/P、B:tcdB-F/R/P)
【具体实施方式】
[0036]本发明的引物对包括:(I)用于扩增tcdA基因的引物对和(2)用于扩增tcdB基因的引物对。
[0037](I)用于扩增tcdA基因的引物对包括作为由序列号I所示的碱基序列(5’-CAGTCGGATTGCAAGTAATTGACAAT-3’ CtcdA-F))构成的寡核苷酸的第一引物、和作为由序列号2所示的碱基序列(5’ -AGTAGTATCTACTACCATTAACAGTCTGC-3’ CtcdA-R))构成的寡核苷酸的第二引物。第一引物能够在PCR (聚合酶链式反应)等核酸扩增反应中作为正向引物使用，第二引物能够在核酸扩增反应中作为与第一引物组合的反向引物使用。
[0038]C.difficile的各菌株被大致分为TcdA产生TcdB产生型(A+B+)、TcdA非产生TcdB产生型(A-B+)和毒素非产生型(A-B-)，但已知tcdA毒素基因的有无和TcdA毒素产生的有无不一定一致。在使用现有公知的用于扩增tcdA基因的引物时，大多情况下不仅检测到A+B+型株，而且也检测到A-B+型`株，在该方法中，无法仅检测到TcdA毒素产生菌(参照实施例2 (3))。对此，在使用本发明的包括第一和第二引物的引物对的情况下，如表3所示，仅A+B+型株中的tcdA被扩增，A-B+型株中的tcdA没有扩增。即，在使用本发明的用于扩增tcdA基因的引物对时，能够可靠地仅检测到TcdA毒素产生性C.difficile、即A+B+型株(参照实施例2 (2)和(3))。
[0039](2)用于扩增tcdB基因的引物对包括作为由序列号4所示的碱基序列(5’ -TACAAACAGGTGTATTTAGTACAGAAGATGGA-3’ CtcdB-F))构成的引物的第三引物、和作为由序列号5所示的碱基序列(5’ -CACCTATTTGATTTAGMCCTTTAAAAGC-3’(tcdB-R))构成的引物的第四引物。第三引物能够在核酸扩增反应中作为正向引物使用，第四引物能够在核酸扩增反应中作为与第三引物组合的反向引物使用。
[0040]通过使用该引物对，能够可靠地扩增tcdB基因，能够可靠地检测TcdB毒素产生性C.difficile、即 A+B+ 型株和 A-B+ 型株(表 3)。
[0041]本发明的寡核苷酸探针包括:(1)与tcdA基因特异性地杂交的探针、和(2)与tcdB基因特异性地杂交的探针。
[0042](I)与tcdA基因特异性地杂交的探针为由序列号3所示的碱基序列(5’ 一TTGAGATGATAGCAGTGTCAGGATTG 一 3’(tcdA-Ρ))构成的寡核苷酸(第一探针)，与由包括上述第一和第二引物的引物对的扩增范围特异性地结合。另外，(2)与tcdB基因特异性地杂交的探针为由序列号6所示的碱基序列(5’ - TTTKCCAGTAAAATCAATTGC TTC — 3’ CtcdB-P))构成的寡核苷酸(第二探针)，与由包括上述第三和第四引物的引物对的扩增范围特异性地结合。
[0043]这样的寡核苷酸探针通过将5’末端侧用FAM(羧基突光素,carboxyfluorescein)、TET (四氯羧基突光素，tetrachlorocarboxyfIuorescein)等突光物质修饰,将3’末端用TAMRA (羧基四甲基罗丹明，carboxytetramethylrhodamine)、BHQ-l (黑洞粹灭剂-1,blackhole quencher-1)等粹灭物质修饰,例如能够作为用于进行实时PCR的修饰寡核苷酸(所谓的Taqman探针)使用。
[0044]即，经修饰的第一探针与由上述第一引物和第二引物构成的引物对一起，能够作为用于利用实时PCR通过扩增、测定tcdA基因的寡核苷酸组使用，经修饰的第二探针与由上述第三引物和第四引物构成的引物对一起，能够作为用于利用实时PCR扩增、测定tcdB基因的寡核苷酸组使用。
[0045]本发明的寡核苷酸，除了由上述序列号I~6所示的碱基序列构成的寡核苷酸以外，还包括由与该各碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸。即，包括:由与序列号I和序列号2所示的碱基序列对应的互补序列构成的引物对、由与序列号3所示的碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针、由与序列号4和序列号5所示的碱基序列对应的互补序列构成的引物对、由与序列号6所示的碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针。
[0046]另外，由在序列号I~6所示的碱基序列或与该碱基序列对应的互补序列中缺失、取代、添加或插入I或 2个碱基的碱基序列构成的、且分别与由序列号I~6所示的碱基序列或其互补序列构成的寡核苷酸具有作为引物或探针相同的功能的寡核苷酸，也同样作为本发明的寡核苷酸。
[0047]本发明的寡核苷酸能够通过公知的化学合成法容易地制造。
[0048]本发明的上述各引物对优选与上述各寡核苷酸探针一起使用，以从人粪便提取的DNA作为模板进行核酸扩增反应，测定该扩增产物，由此能够分别检测TcdA毒素产生性C.difficile 和 TcdB 毒素产生性 C.difficile。
[0049]其中，该检测中包括C.difficile的有无的判定和C.difficile的定量。此外，定量包括菌数的定量。
[0050]通过使用本发明的上述各引物对、优选与上述各寡核苷酸探针一起使用，能够测定粪便中的TcdA毒素产生性C.difficile和TcdB毒素产生性C.difficile的菌数，通过将它们与C.difficile特异性的引物或探针组合,一同测定C.difficile的总菌数,能够算出粪便中(肠内)的C.difficile的详细情况、即毒素产生性C.difficile (A+B+型的菌数、A-B+型的菌数、或A+B+型和A-B+型的菌数的总和)、或非毒素产生性C.difficile(A-B-型的菌数)相对于C.difficile的总菌数(A+B+型、A-B+型和A-B-型的菌数的总和)的存在比率。
[0051 ] 作为该对于C.dif f ici Ie特异性的引物、探针，可以列举以下所示的(a)的引物对或具有(a)的引物对和(b)的寡核苷酸探针的实时PCR用的寡核苷酸组。
[0052](a)包括由序列号7所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号8所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。
[0053](b)由序列号9所示的碱基序列构成的寡核苷酸探针、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针，其中，在该寡核苷酸的5’末端结合有荧光物质，在3’末端结合有猝灭物质。
[0054]这里，(a)的引物对包括:作为由序列号7所示的碱基序列(5’ 一GCAAGTTGAGCGATTTACTTCGGT 一 3’(CD16SrRNA-F))构成的寡核苷酸的第五引物、和作为由序列号 8 所示的碱基序列(5，- GTACTGGCTCACCTTTGATATTYAAGAG 一 3’(CD16SrRNA_R))构成的寡核苷酸的第六引物。第五引物能够在核酸扩增反应中作为正向引物使用，第六引物能够在核酸扩增反应中作为与第五引物组合的反向引物使用。
[0055](b)的寡核苷酸探针为由序列号9所示的碱基序列(5’ -TGCCTCTCAAATATATTATCCCGTATTAG — 3’ (CD16SrRNA-P))构成的寡核苷酸(第三探针)，与由上述第五和第六引物构成的引物对的扩增范围特异性地结合。该寡核苷酸探针通过用FAM、TET等荧光物质修饰5’末端侧、用TAMRA、BHQ-1等猝灭物质修饰3’末端，能够作为例如用于进行实时PCR的修饰寡核苷酸(所谓Taqman探针)使用。
[0056]此外，由在序列号7~9所示的碱基序列或与该碱基序列对应的互补序列中缺失、取代、添加或插入I或2个碱基的碱基序列构成的、且分别与由序列号7~9所示的碱基序列或其互补序列构成的寡核苷酸具有作为引物或探针相同的功能的寡核苷酸，同样作为上述(a)和(b)寡核苷酸。
[0057]作为调查微生物的存在或存在量等的被检体，可以列举例如:结膜拭子液、牙石、牙垢、喀痰、咽拭子液、唾液、鼻涕、肺胞清洗液、胸水、胃液、胃清洗液、尿、宫颈管粘液、阴道分泌物、皮肤病灶、粪便、血液、腹水、组织、脊髓液、关节液、患处拭子液等来自机体的试样、食品、医药品、化妆品、食品-医药品-化妆品的中间处理物、微生物培养液、植物、土壤、活性污泥、废水这样的存在含有微`生物可能性的对象。作为来自被检体的试样，只要是能够反映被检体的微生物的存在或存在量的试样就没有特别限定，可以列举例如:包含被检体所含的核苷酸的混合物或包含DNA的混合物，但从用于PCR法的观点考虑，优选包含被检体所含的DNA的混合物。
[0058]从人粪便中提取DNA能够利用与以往的制备基因组DNA时同样的手法进行，例如，能够从被检体的全部或一部分中，根据需要利用提取、分离、纯化方法进行前处理，之后利用适当公知的方法获得。根据需要，也可以利用过滤、离心分离、色谱等公知的方法进行前处理，然后使用例如“在玻璃珠等的存在下进行搅拌的物理破碎法”、“CTAB法”、“苯酚氯仿法(PC法)”、“磁珠法”、“硅胶柱法”等通用方法或者组合这些方法的手法进行提取而获得，另外也可以使用市售的试剂盒进行。
[0059]为了得到PCR高检测灵敏度，希望获得高浓度的DNA，而另一方面，来自粪便的核酸提取液中混杂有妨碍PCR的物质，因此，希望获得尽可能地去除了这些妨碍物质的高纯度的DNA。为了该目的，特别优选使用能够提取高浓度且高纯度的DNA的FastDNA SPIN Kitfor Feces (MP Biomedicals)。
[0060]作为核酸扩增法，没有特别限定，可以举出利用PCR法的原理的公知的方法。可以列举例如:PCR 法、LAMP (环介导等温扩增，Loop-mediated isothermal AMPlification)法、ICAN (等温嵌合引物起始的核酸扩增，Isothermal and Chimeric primer-1nitiatedAmplification of Nucleic acids)法、RCA (滚环扩增，Rolling Circle Amplification)法、LCR (连接酶链式反应，Ligase Chain Reaction)法、SDA (链置换扩增，StrandDisplacement Amplification)法等。
[0061]另外，在核酸扩增反应后的扩增产物的检测中，可以使用能够特异性地识别扩增产物的公知的手段。例如，能够使放射性同位素、荧光物质、发光物质等标记物与在扩增反应的过程中摄取的dNTP作用，检测该标记物。作为观察摄取了被标记的dNTP的扩增产物的方法，只要是用于检测上述标记物的本【技术领域】中公知的方法则可以为任意方法。例如，在作为标记物使用放射性同位素的情况下，能够利用例如液体闪烁计数器、Y —计数器等测定放射活性。另外，在作为标记物使用荧光的情况下，能够使用荧光显微镜、荧光酶标仪等检测该荧光。
[0062]在本发明中，作为核酸扩增法，从迅速性和定量性的方面出发，优选使用实时监测解析PCR扩增量的实时PCR。另外，作为实时PCR，可以列举在本【技术领域】通常使用的方法，例如TaqMan探针法、嵌入剂法和环状探针法等，而在本发明中，特别优选使用TaqMan探针法。
[0063]TaqMan探针法为在PCR反应体系中加入5’末端用荧光物质(FAM等)修饰、3’末端用猝灭物质(TAMRA等)修饰后的寡核苷酸(TaqMan探针)的方法。
[0064]在本发明中，如上所述，被修饰的第一探针和第二探针能够作为TaqMan探针使用，它在PCR反应的退火步骤中与模板DNA特异性地杂交，但由于探针上存在猝灭物质，所以即使照射激发光也会抑制荧光的发生。在延伸反应步骤时，通过Taq DNA聚合酶具有的5’ 一3’核酸外切酶活性，与模板杂交的TaqMan探针被分解，则荧光物质从探针游离，猝灭物质的抑制被解除而发出荧光。
[0065]PCR的条件没有特别限定，只要将每个PCR装置设定为最佳条件即可，可以列举例如以下的条件。
`[0066]I)双链DNA变为单链DNA的热变性:通常以93~95°C左右、通常加热10秒钟~I分钟左右。
[0067]2)退火:通常以50~60°C左右、通常加热10秒钟~I分钟左右。
[0068]3) DNA延伸反应:通常以70~74°C左右、通常加热30秒钟~5分钟左右。
[0069]其中，退火和DNA延伸反应可以不分开而同时进行。
[0070]通常通过进行上述I)~3)的反应30~50个循环左右，能够将目的tcdA基因和tcdB基因扩增到能够检测的程度。
[0071]另外，从灵敏度的观点出发，上述Taqman探针在反应液中的浓度优选为100~1000nM 左右。
[0072]另外，在利用在PCR反应体系中加入通过与双链DNA结合而发出荧光的试剂(荧光嵌入剂)的嵌入剂法的情况，作为荧光嵌入剂，例如在SYBR Green1.SYBR GreenIKSYBRGold、噁唑黄、噻唑橙、溴化乙锭、PICO GREEN等公知的试剂的存在下进行PCR，测定伴随靶标序列的扩增而增加的荧光强度即可。
[0073]实时PCR能够使用将热循环仪和分光荧光光度计一体化的实时PCR专用装置例如ABI PRISM7900HT sequence detection system (Applied Biosystems)进行。
[0074]DNA量的测定能够通过以下方法进行。首先，将浓度已知的标准DNA溶液阶段性稀释得到的溶液进行PCR，以该初始的DNA量为横轴，将以其为模板的PCR的扩增产物量达到一定量时的循环数(threshold cycle ;Ct值)绘制在纵轴上,制作标准曲线。对于未知浓度的试样也在同样的条件下进行反应，求出Ct值，根据该值和标准曲线求出试样中目的DNA量。
[0075]另外，菌数的定量能够通过算出与供于标准曲线制作用的DNA量相当的菌数值，以与DNA量的测定同样的程序进行。首先，测定标准DNA溶液的制备中使用的菌株的纯培养菌液中的菌数，从这些已知菌数实施DNA的提取，能够得到与提取后的DNA溶液(标准DNA溶液)所含的DNA量相当的菌数值。因此，由于能够算出与供于PCR的初始的DNA量相当的菌数值，所以通过制作将横轴换算成菌数值的标准曲线，能够同样地算出未知浓度的试样中所含的目的微生物的菌数值。
[0076]这样，“目的微生物的DNA量”或“目的微生物的(与DNA量相当的)菌数”，使用已知的标准DNA溶液和未知浓度的DNA试样进行PCR，达到一定PCR扩增产物量时进行“PCR循环数”(Ct值)的对比，就能够求出浓度未知试样中的“目的微生物的DNA量”或“目的微生物的菌数”。其中，在这样的对比中，从简便性的方面出发，优选使用表示作为PCR的模板的“目的微生物的菌数”与“Ct值”的相关关系的标准曲线。这样的标准曲线通常以目的微生物的菌数作为横轴、以Ct值作为纵轴而绘制制作的。制作标准曲线时使用的微生物可以使用模式株等公知菌株。
[0077]另外，被检体中的目的微生物DNA量例如能够通过可与目的微生物DNA特异性地杂交的核酸片段与被检体试样的杂交效率的信息求出。
[0078]这样，根据本发明 的方法，能够特异性地检测TcdA毒素产生性C.difficile和TcdB毒素产生性C.difficile (实施例2)，另外如果每Ig粪便存在IO3个以上的C.difficile则能够检测其DNA (实施例3)，能够实现高灵敏度的检测。
[0079]此外，通过组合使用对C.difficiIe特异性的引物组、寡核苷酸探针，测定C.difficile的总菌数,能够准确地掌握粪便中(肠内)的C.difficile的详细情况(毒素产生性和非毒素产生性C.difficile相对于总菌数的存在比率)，能够对于C.difficile感染症的诊断、临床研究等作出贡献。实施例
[0080]实施例1毒素产生性C.difficile的检测
[0081][I]材料和方法
[0082](A)使用菌株和培养条件
[0083]C.difficile DSM1296T 从 Deutsche Sammlung von Mikroorganizmen undZellkulturen GmbH (DSMZ, Germany)购买，ATCC43255、43596、43598、700057 从 AmericanType Culture Collection (USA)购买，NTCT13307、13366 从 Health Protection Agency(UK)购买，CCUG20309、37780、37785 从 Culture Collection University of Goteborg(Sweden)购买。C.difficile以外的Clostridium属菌种全部从DSMZ购买。
[0084]所有的菌株使用1%葡萄糖添加改良GAM培养基(日水制药)，在厌氧条件下以37°C培养24小时。菌液中的菌数测定通过DAPI染色法进行。
[0085](B) TaqMan PCR 反应
[0086]使用ABI79OOHT 系统进行 TaqMan PCR15PCR使用 Takara ExTaq Hot Start Version(Takara)和 Ampdirect plus (shimadzu)。反应液组成为 2XAmpdirect plus、引物 F/R0.2 μ M、TaqMan 探针 0.2 μ Μ、Rox Reference Dye> ExTaq DNA polymerase0.4Units 和模板DNA溶液5 μ L，总量设为20 μ L。以95°C 30秒将Taq酶活化后，进行95°C 5秒、56°C 50秒的循环50次。
[0087](C) DNA提取用粪便样品的制备
[0088]将使用RNAlater制备的10%粪便悬池液(w/v) 2mL (含有200mg粪便)进行离心分离，除去上清lmL。添加磷酸缓冲生理食盐水(PBS (_))lmL，用旋涡搅拌器(vortex)搅拌后，将离心分离得到的全部上清用倾析除去。添加PBS (-)lmL，用旋涡搅拌器搅拌后，除去离心分离得到的全部上清。将所得到的粪便颗粒在用于DNA提取之前保存于_80°C。
[0089](D) DNA 的提取
[0090]从培养菌液提取DNA按照松木等的方法(Matsuki，T.，K.ffatanabe, J.Fujimoto,Y.Kado, T.Takada, K.Matsumoto, and R.Tanaka.2004.Quantitative PCRwithl6S rRNA-gene-targeted species-specific primers for analysis of humanintestinal bifidobacteria.App1.Environ.Microbiol.70:167-173)进行。
[0091]从幾便颗粒提取DNA 使用 FastDNA SPIN Kit for Feces (MP Biomedicals)。提取法的详细内容如下所示。
[0092]在装有200mg 幾便颗粒的 2.0mL 试管(tube)中，添加 Lysing Matrix E、Sodiumphosphate buffer (憐酸钠缓冲液)825 μ L 和 Pre-lysis solution275 μ L,用旋润揽拌器搅拌10-15s。除去以14，OOOXg离心分离5min得到的上清，添加磷酸钠缓冲液978 μ L和MT bufferl22 μ L进行搅拌。用FastPrep level6.0剧烈振荡45s,以14，000 X g离心分离15min。将上清回收至新的2.0mL试管,添加Protein precipitate solution (蛋白沉淀溶液)250 μ L，剧烈振荡并`混合。在4°C静置IOmin后，以14，OOOXg离心分离2min，将上清回收至15mL试管中。添加Binding matrixsolutionlmL轻柔混合后，在室温孵育5min。除去以14，OOOXg离心分离2min得到的上清后,添加ImL Wash buffer-1,通过吹打轻柔地使颗粒重悬。将悬浮液约600 μ L移至SPIN filter tube，除去以14，000 X g离心分离Imin后的滤过液(Flow-through)。将剩余的悬浮液再次移至SPIN filter tube,除去以14，OOOX g离心分离Imin后的滤过液。添加0.5mL Wash buffer-2,通过吹打轻柔地使过滤器上的基质重悬后，除去以14，000Xg离心分离2min后的滤过液。再次以14，OOOXg离心分离2min,将过滤器移至新的1.9mL catch tube。添加TESlOO μ L,轻轻敲打使基质悬浮，回收以14，OOOXg离心分离2min得到的滤过液。
[0093][II]引物和探针的设计
[0094]以C.difficile的毒素基因tcdA和tcdB为靶标，分别按照以下的程序设计特异性的引物和探针。使用从数据库取得的20个菌株的tcdA基因序列(* I)和22个菌株的tcdB基因序列(* 2)，利用Clustal X进行同源性检索(比对)。TcdA和TcdB被分类为Large Clostridial Toxin (LCTs),与一部分梭状芽胞杆菌(Clostridium)属细菌产生的LCTs具有很高的同源性。因此，作为对照，将索氏梭菌的tcsL[X82638]、诺氏梭菌的tcnA[Z48636]、产气荚膜梭菌的tcpL[AB262081]的基因序列一并用于比对。比对的结果，靶标毒素基因与其他基因的同源性高，而且tcdA和tcdB在两者的碱基序列间具有约60%的同源性，由此用引物制作用软件没能发现对于tcdA和tcdB各自的靶标毒素基因的特异性的碱基序列。因此，通过目测确认比对结果，通过试错，选择对于靶标基因特异性的且被认为在菌株间保守性高的区域，设计了引物和探针(表1)。
[0095]* ItcdA 基因的 GenBank accession n0.:M30307, NC_009089, NC_013316，NC_013315, AJ011301, NZ_ADVM01000023, NZ_ABHF02000018, NZ_ABHE02000016, NZ_ABFD02000006,NZ_ABHD02000008,NZ_ABHG02000011, NZ_ABKK020000I 3，NZ_AAML04000007, NZ_ABKL02000008, FN668941, FN668375, FN665652, FN665653, FN665654, Y12616,AJ132669
[0096]* 2tcdB 基因的 GenBank accession n0.:M30307, Z23277, AJ011301, NC_009089, NC_013316, NC_013315, AF217292, NZ_ABHF02000018, NZ_ADVM01000023, NZ_ADNX01000011,NZ_ABHE02000016, NZ_ABHD02000008, NZ_ABFD02000006, NZ_ABKL02000008, NZ_ABKK02000013, NZ_ABHG02000011, NZ_AAML04000007, FN668941, FN668375，FN665652, FN665653, FN665654
[0097][表 I]
[0098]
【权利要求】
1.包括由序列号I所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号2所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或者由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。
2.由序列号3所示的碱基序列构成的寡核苷酸探针、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针。
3.如权利要求2所述的寡核苷酸探针，其特征在于: 在寡核苷酸的5’末端结合有突光物质,在3’末端结合有粹灭物质。
4.一种实时PCR用的寡核苷酸组，其特征在于: 其具备权利要求1所述的引物对和权利要求3所述的寡核苷酸探针。
5.包括由序列号4所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号5所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或者由 与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对。
6.由序列号6所示的碱基序列构成的寡核苷酸探针、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针。
7.如权利要求6所述的寡核苷酸探针，其特征在于: 在寡核苷酸的5’末端结合有突光物质,在3’末端结合有粹灭物质。
8.一种实时PCR用的寡核苷酸组，其特征在于: 其具备权利要求5所述的引物对和权利要求7所述的寡核苷酸探针。
9.一种毒素产生性艰难梭菌的检测方法，其特征在于，包括: 以从人粪便提取的DNA为模板，使用权利要求4和/或权利要求8所述的寡核苷酸组分别进行PCR的工序；和通过测定荧光来测定扩增产物的工序。
10.一种人粪便中的艰难梭菌中的毒素产生性艰难梭菌和/或非毒素产生性艰难梭菌的存在比率的计算方法，其特征在于，包括: 以从人粪便提取的DNA为模板，使用权利要求4和/或权利要求8所述的寡核苷酸组、以及以下所示的(a)的引物对或具备(a)的引物对和(b)的寡核苷酸探针的实时PCR用的寡核苷酸组，分别进行PCR的工序；和通过测定荧光来测定扩增产物的工序， Ca)包括由序列号7所示的碱基序列构成的寡核苷酸和由序列号8所示的碱基序列构成的寡核苷酸的引物对、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的引物对； (b)由序列号9所示的碱基序列构成的寡核苷酸探针、或由与该碱基序列对应的互补序列构成的寡核苷酸探针，其中，在该寡核苷酸的5’末端结合有荧光物质，在3’末端结合有猝灭物质。
【文档编号】C12Q1/04GK103764850SQ201280042806
【公开日】2014年4月30日 申请日期:2012年8月31日 优先权日:2011年9月1日
【发明者】久保田博之, 牧野博, 酒井隆史, 石川英司, 大石宪司 申请人:株式会社益力多本社