用于生产尼龙-7、尼龙-7,7和聚酯的生物转化工艺的制作方法

用于生产尼龙-7、尼龙-7,7和聚酯的生物转化工艺的制作方法
【专利摘要】本发明实施方案涉及用于在存在分离的酶或存在表达那些酶的重组宿主细胞的情况下生物合成双官能或三官能C7烷的方法。所述双官能或三官能C7烷可用作生产尼龙-7、尼龙-7,x、尼龙-x,7和聚酯的中间物。
【专利说明】用于生产尼龙-7、尼龙-7, 7和聚酯的生物转化工艺
[0001]对相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2011年6月30日提交的美国临时申请Ser.N0.61/503，043和均为2011 年 12 月 21 日提交的美国临时申请 Ser.N0.61/578，265 ;61/578，272 ;和 61/578，289的权益，其完整内容均通过提述如在本文中完整列出的并入本文。
发明领域
[0003]本发明的实施方案涉及用于在存在一种或多种分离的酶或存在表达一种或多种酶的重组宿主细胞的情况下生物合成产生双官能或三官能C7烷的方法。所述双官能或三官能C7烷可用作生产例如尼龙_7、尼龙-7，X和/或尼龙-X，7的中间物。
[0004]发明背景
[0005]化学工业对可持续实践的推动聚焦于降低能量使用、再生原材料和减少货物生产期间产生的副产物。然而，化学工业极其依赖于将石油和天然气作为基础原料。鉴于与主要石油化学品工艺有关的优化状态，将需要在原料使用和制造设计中的重大转变以将能量、散发和成本降低至其目前水平之下。生物技术提供了一种用于从可再生糖类如植物源的糖或其他可再生原料如脂肪酸生产工业化学中间物和终产物的新办法。另外，生物技术还提供了一种利用废物或低价值流如来自生物柴油生产的甘油，或在比现有化学工艺更有益于环境的生物工艺中将基于石油化学品的原料如苯、甲苯和多环芳香烃(PAH)转化成可用产物的方式。
[0006]US2010/020360 0和W02011/031147通过提述完整并入本文。本领域中需要对尼龙_7、尼龙-7，X、尼龙-X, 7和聚酯的化学中间物和终产物尼龙_7、尼龙-7，X、尼龙-X, 7和聚酯的经济的生物合成途径，尤其是从多种可再生和不可再生原料进行。
[0007]发明概述
[0008]本公开至少部分基于用于生物合成二或三官能C7烷的酶系统和重组宿主的开发，所述二或三官能C7烷是用于生产尼龙-7、尼龙-X，7、尼龙-7，X和聚酯的可用中间物(单体)。具体地，如本文中描述的，可用于生产尼龙-7和尼龙-7，X、尼龙-X，7和聚酯的中间物可从可再生原料如植物源的糖和甘油，或从基于石油化学品的原料如苯或环己烷羧酸酯生物合成产生。在一些实施方案中，二官能或三官能C7烷的产生最终经由一种通用的中间体庚二酸半醛(亦称为7-氧庚酸)进行，尽管有许多可使用的不同原料和许多产生庚二酸半醛的方式。图1是描绘了庚二酸半醛到各种双官能C7烷的生物转化的示意图。
[0009]例如，庚二酸半醛可源自庚二酰-辅酶A (CoA)、庚二酰-[酰基载体蛋白(acp)]、庚二酸(亦称为庚烷1，7-二酸)、或α-酮辛二酸酯。如本文中描述的，庚二酰-CoA和庚二酰_[acp]可源自许多来源，包括许多不同的天然存在的代谢途径，其中形成庚二酰-CoA或庚二酰_[acp]作为中间物。
[0010]另外，庚二酰-CoA和庚二酸还可源自相应的烯酸(enoate)2_庚烯-二元酸或其相应的CoA酯。在一些实施方案中，这些C72-烯酸源自D，L-二氨基庚二酸盐。在一些实施方案中，双官能C7烷(例如7氨基庚酸)的产生经由α-酮辛二酸或α-氨基辛二酸(可源自D，L-二氨基庚二酸)进行。在其他实施方案中，α-酮辛二酸或α-氨基辛二酸源自α-酮庚二酸。
[0011]更具体地，本发明提供多种转化化合物以产生可用于制造尼龙-7、尼龙-7，7和聚酯的中间物的方法。不需要实施任一种方法的所有可能步骤，且当获得期望的化合物时，可终止任一种方法。如此，在产生例如庚二酸、7-氨基-庚酸、庚内酰胺、1，7- 二氨基庚烷、或7-羟基-庚酸后，可终止任一种方法。
[0012]转化化合物的第一种方法可包括使选自2，6 二氨基庚二酸盐(2，6DAP)和α -氨基-庚二酸盐(AAP)的化合物与催化2，6DAP到6-氨基-2-庚烯二酸(6Α2ΗΑ)的还原性脱氨基化或AAP到2-庚烯二酸(2HDA)的还原性脱氨基化的酶接触，从而产生6Α2ΗΑ或2HDA。
[0013]所述化合物可以是2，6DAP且所述第一种方法还可包括使6Α2ΗΑ与催化6Α2ΗΑ到AAP的烯酸还原的酶接触，从而产生ΑΑΡ。
[0014]所述AAP可与催化AAP到2HDA的还原性脱氨基化的酶接触，从而产生2HDA。
[0015]所述2HDA可与催化2HDA到庚二酸(PA)的烯酸还原的酶接触，从而产生PA。
[0016]所述PA可与催化PA到庚二酸半醛(PAS)的羧酸还原的酶接触，从而产生PAS。
[0017]所述PAS可与催化PAS到7-氨基-庚酸(7ΑΗΑ)的半醛氨基化的酶接触，从而产生 7ΑΗΑ。
[0018]所述7ΑΗΑ可与催化7ΑΗΑ到庚内酰胺(ENTL)的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
[0019]转化化合物的第二种方法可包括，在实施第一种方法的所有步骤直至产生7ΑΗΑ后，使7ΑΗΑ与催化7ΑΗΑ到7-氨基-庚醛(7ΑΗΤ)的醛脱氢的酶接触，从而产生ΑΗΤ。
[0020]所述7ΑΗΤ可与催化氨基基团到7ΑΗΤ转移以产生1，7_ 二氨基庚烷(1，7DAH)的酶接触，从而产生1，7DAH。
[0021]转化化合物的第三种方法可包括，在实施第一种方法的所有步骤直至产生2HDA后，使所述2HDA与催化辅酶A (CoA)到2HDA转移以产生2-庚烯二酸-CoA(2HDA-CoA)的酶接触，从而产生2HDA-CoA。
[0022]所述2HDA_CoA可与催化2HDA_CoA到庚二酰-CoA (PCoA)的烯酸还原的酶接触，从而产生PCoA。
[0023]所述PcoA可与催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接触，从而产生PA。
[0024]所述PA可与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，从而产生PAS。
[0025]所述PAS可与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，从而产生7AHA。
[0026]所述7AHA可与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
[0027]转化化合物的第四种方法可包括，在实施第三种方法的所有步骤直至产生7AHA后，使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，从而产生7AHT。
[0028]所述7AHT可与催化氨基基团到7AHT转移以产生1，7DAH的酶接触，从而产生I, 7DAH。
[0029]转化化合物的第五种方法可包括，在实施第一种方法的所有步骤直至产生AAP后，使所述AAP与催化氨基基团到AAP转移以产生α-酮-庚二酸盐(AKP)的酶接触，从而产生ΑΚΡ。
[0030] 所述AKP可与催化AKP到α -羟基-庚二酸盐(AHP)的酮还原的一种或多种酶接触，从而产生ΑΗΡ。
[0031 ] 所述AHP可与催化CoA到AHP转移以产生α -羟基-庚二酸盐(AHP-CoA)的酶接触，从而产生AHP-CoA。
[0032]所述AHP-CoA可与催化AHP-CoA到2HDA_CoA的脱水的酶接触，从而产生2HDA-CoA。
[0033]所述2HDA_CoA可与催化2HDA_CoA到PCoA的烯酸还原的酶接触，从而产生PCoA。
[0034]所述PcoA可与催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接触，从而产生PA。
[0035]所述PA可与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，从而产生PAS。
[0036]所述PAS可与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，从而产生7AHA。
[0037]所述7AHA可与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
[0038]转化化合物的第六种方法可包括，在实施第五种方法的所有步骤直至产生7AHA后，使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，从而产生7AHT。
[0039]所述7AHT可与催化氨基基团到7AHT转移以产生1，7DAH的酶接触，从而产生I, 7DAH。
[0040]转化化合物的第七种方法可包括，在实施第五种方法的所有步骤直至产生AHP后，使AHP与催化AHP到2HDA的脱水的酶接触，从而产生2HDA。
[0041]所述2HDA可与催化2HDA到庚二酸(PA)的烯酸还原的酶接触，从而产生PA。
[0042]所述PA可与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，从而产生PAS。
[0043]所述PAS可与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，从而产生7AHA。
[0044]所述7AHA可与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
[0045]转化化合物的第八种方法可包括，在实施第五种方法的所有步骤直至产生7AHA后，使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，从而产生7AHT。
[0046]所述7AHT与催化氨基基团到7AHT转移以产生1，7DAH的酶接触，从而产生I, 7DAH。
[0047]转化化合物的第九种方法可包括，在实施第七种方法的所有步骤直至产生2HDA后，使2HDA与催化CoA到2HDA转移以产生2HDA_CoA的酶接触，从而产生2HDA_CoA。
[0048]所述2HDA_CoA与催化2HDA_CoA到PCoA的烯酸还原的酶接触，从而产生PCoA。
[0049]所述PcoA可与催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接触，从而产生PA。
[0050]所述PA可与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，从而产生PAS。
[0051]所述PAS可与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，从而产生7AHA。
[0052]所述7AHA可与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
[0053]转化化合物的第十种方法可包括，在实施第九种方法的所有步骤直至产生7AHA后，使7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，从而产生7AHT。
[0054]所述7AHT可与催化氨基基团到7AHT转移以产生1，7DAH的酶接触，从而产生I, 7DAH。
[0055]转化化合物的第十一种方法可包括，在实施第五种方法的所有步骤直至产生AKP后，使AKP与催化AKP到α-酮-辛二酸盐(AKS)的α -酮酸链延伸的酶接触，从而产生AKS。
[0056]所述AKS可与催化氨基基团到AKS转移以产生α -氨基辛二酸盐(AAS)的酶接触，从而产生AAS。所述AAS可与催化AAS到7AHA的α -酮酸脱羧的酶接触，从而产生7ΑΗΑ。
[0057]所述7ΑΗΑ可与催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
[0058]转化化合物的第十二种方法可包括，在实施第十一种方法的所有步骤直至产生7ΑΗΑ后，使7ΑΗΑ与催化7ΑΗΑ到7ΑΗΤ的醛脱氢的酶接触，从而产生7ΑΗΤ。
[0059]所述7ΑΗΤ可与催化氨基基团到7ΑΗΤ转移以产生1，7DAH的酶接触，从而产生I, 7DAH。
[0060]转化化合物的第十三种方法可包括，在实施第十一种方法的所有步骤直至产生AKS后，使AKS与催化AKS到PAS的α -酮酸脱羧的酶接触，从而产生PAS。
[0061]所述PAS可与催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接触，从而产生7ΑΗΑ。
[0062]所述7ΑΗΑ可与催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
[0063]转化化合物的第十四种方法可包括，在实施第十三种方法的所有步骤直至产生7ΑΗΑ后，使所述7ΑΗΑ与催化7ΑΗΑ到7ΑΗΤ的醛脱氢的酶接触，从而产生7ΑΗΤ。
[0064]所述7ΑΗΤ可与催化氨基基团到7ΑΗΤ转移以产生1，7DAH的酶接触，从而产生I, 7DAH。
[0065]转化化合物 的第十五种方法可包括，在实施第五种方法的所有步骤直至产生PCoA后，使所述PCoA与催化PCoA到PAS的还原的酶接触，从而产生PAS。
[0066]所述PAS可与催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接触，从而产生7ΑΗΑ。
[0067]所述7ΑΗΑ可与催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
[0068]转化化合物的第十六种方法可包括，在实施第十五种方法的所有步骤直至产生7ΑΗΑ后，使所述7ΑΗΑ与催化7ΑΗΑ到7ΑΗΤ的醛脱氢的酶接触，从而产生7ΑΗΤ。
[0069]所述7ΑΗΤ可与催化氨基基团到7ΑΗΤ转移以产生1，7DAH的酶接触，从而产生I, 7DAH。
[0070]转化化合物的第十七种方法可包括，在实施第九种方法的所有步骤直至产生PCoA后，使所述PCoA与催化PCoA到PAS的还原的酶接触，从而产生PAS。
[0071]所述PAS可与催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接触，从而产生7ΑΗΑ。
[0072]所述7ΑΗΑ可与催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
[0073]转化化合物的第十八种方法可包括，在实施第十七种方法的所有步骤直至产生7ΑΗΑ后，使所述7ΑΗΤ与催化7ΑΗΑ到7ΑΗΤ的醛脱氢的酶接触，从而产生7ΑΗΤ。
[0074]所述7ΑΗΤ可与催化氨基基团到7ΑΗΤ转移以产生1，7DAH的酶接触，从而产生I, 7DAH。
[0075]转化化合物的第十九种方法可包括使选自6Α2ΗΑ和2HDA的化合物与催化6Α2ΗΑ到AAP的烯酸还原或2HDA到PA的烯酸还原的酶接触，从而产生AAP或PA。理解在产生AAP或PA后，可实施在上文第一至第十八种方法中描述的产生AAP或PA之后的任意步骤。
[0076]转化化合物的第二十种方法可包括使选自PCoA和庚二酰[acp] (PACP)的化合物与催化PCoA或PACP到PA的硫酯酶水解的酶接触，从而产生PA。
[0077]所述PA可与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，从而产生PAS。
[0078]所述PAS可与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，从而产生7AHA。
[0079]所述7AHA可与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，从而产生ENTL。
[0080]转化化合物的第二十一种方法可包括，在实施第二十种方法的所有步骤直至产生7AHA后，使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，从而产生7AHT。
[0081]所述7AHT可与催化氨基基团到7AHT转移以产生1，7DAH的酶接触，从而产生I, 7DAH。
[0082]转化化合物的第二十二种方法可包括，使AKP与催化AKP到AHP的酮还原的一种或多种酶接触，从而产生AHP。AKP可通过α-酮己二酸或α -酮戊二酸的链延伸产生。然后，AHP可转化成PA或PcoA。理解在产生PA或PCoA后，可实施在上文第一至第十八种方法中描述的产生PA或PCoA之后的任意步骤。
[0083]转化化合物的第二十三种方法可包括通过α -酮酸链延伸将AKP转化成AKS。AKP可通过α-酮己二酸或α-酮戊二酸的链延伸产生。理解在产生AKS后，可实施在上文第一至第十八种方法中描述的产生AKS之后的任意步骤。
[0084]转化化合物的第 二十四种方法可包括使PAS与催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接触，从而产生7ΑΗΑ。PAS可通过从2，6DAP、AKG、PCoA、或PACP转化获得。理解在产生AHA后，可实施在上文第一至第十八种方法中描述的产生AM之后的任意步骤。
[0085]转化化合物的第二十五种方法可包括使选自PCoA和PACP的化合物与催化该化合物到PAS还原的酶接触，从而产生PAS。理解在产生PAS后，可实施在上文第一至第十八种方法中描述的产生PAS之后的任意步骤。此外，上文第一至第十八种方法和第二十二种方法中描述的导致PcoA产生的任意步骤可在第二十五种方法之前实施。
[0086]转化化合物的第二十六种方法可包括使PAS与催化PAS到7_羟基-庚酸(7HHA)的醇脱氢的酶接触，从而产生7HHA。理解上文第一至第十八种方法和第二十、二十二、二十三和二十五种方法中描述的导致PAS产生的任意步骤可在第二十六种方法之前实施。
[0087]在所述任一种方法中，所述酶可以纯化形式使用。或者，所述酶可以细胞裂解物或部分纯化的细胞裂解物的形式使用。另外，所述酶可在重组表达其的细胞中。
[0088]在所述方法中，催化还原性脱氨基化的酶可包括氨裂合酶。所述氨裂合酶可以是 EC4.3.1 中的，例如 EC4.3.1.1 ；EC4.3.1.2 ；EC4.3.1.3 ；EC4.3.1.12 ；EC4.3.1.13 ;或EC4.3.1.24。
[0089]在所述方法中，催化烯酸还原的酶可包括烯酸还原酶。所述烯酸还原酶可以是ECl.3.1 中的，例如 ECl.3.1.31。
[0090]在所述方法中，催化羧酸还原的酶可包括羧酸还原酶。所述羧酸还原酶可以是ECl.2.99 中的，例如 ECl.2.99.6。
[0091]在所述方法中，催化半醛氨基化的酶可包括ω转氨酶。所述ω转氨酶可以是 EC2.6.1 中的，例如 EC2.6.1.18 ；EC2.6.1.19 ；EC2.6.1.2 ；EC2.6.1.7 ；EC2.6.1.29 ；EC2.6.1.36 ；EC2.6.1.39 ；EC2.6.1.42 ;或 EC2.6.1.68。
[0092]在所述方法中，催化硫酯水解的酶可包括硫酯酶、酸-硫醇连接酶或CoA转移酶。所述硫酯酶可以是EC3.1.2中的，例如EC3.1.2.18 ；EC3.1.2.19 ;或EC3.1.2.20。所述酸-硫醇连接酶可以是EC6.2.1中的，例如EC6.2.1.3 ；EC6.2.1.14 jEC6.2.1.23。所述CoA转移酶可以是EC2.8.3中的，例如EC2.8.3.12或EC2.8.3.13。
[0093]在所述方法中，催化氨基基团转移的酶可包括氨基转移酶。所述氨基转移酶可以是 EC2.6.1 中的，例如 EC2.6.1.67。
[0094]在所述方法中，催化酮还原的酶可以是羰基还原酶。所述羰基还原酶可包括EC.1.1.1.184。
[0095]在所述方法中，催化α-酮酸脱羧的酶可以是α-酮酸脱羧酶。
[0096]在所述方法中，催化还原(例如，PcoA到PAS)的酶可以是脂肪-酰基-CoA还原酶。所述脂肪-酰基-CoA还原酶可以是ECl.2.1中的，例如ECl.2.1.50。
[0097]在所述方法中，催化醛脱氢的酶可以是醛脱氢酶。所述醛脱氢酶可以是ECl.2.1中的，例如 ECl.2.1.4 或 ECl.2.1.63。
[0098]在所述方法中，催化CoA转移的酶可包括CoA转移酶。所述CoA转移酶可以是EC2.8.3 中的，例如 EC2.8.3.12 或 EC2.8.3.13。
[0099]在所述方法中，催化酰胺水解的酶可以是氨基水解酶。
[0100]在所述方法中，催化脱水(例如，AHP或AHP-CoA)的酶可以是水裂合酶(hydro-lyase)。所述水裂合酶可以是 EC4.2.1 中的，例如 EC4.2.1.2 ；EC4.2.1.59 ；
4.2.1.61 ；4.1.2.17 或 4.1.2.18。
[0101]在所述方法中，催化α-酮酸链延伸的酶可包括包含以下的酶组中的一种或多种:AksA、AksD, AksE 和 AksF0 所述 AksA 可以是 EC2.3.3 中的，例如 EC2.3.3.13 或2.3.3.14。所述 AksD 可以是 EC4.2.1 中的，例如 EC4.2.1.33。所述 AksF 可以是 ECl.1.1中的，例如ECl.1.1.85。I种或多种(例如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更 多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、12种或更多种、14种或更多种、18种或更多种、或20种或更多种)α-酮酸链延伸酶可来自产甲烷菌细菌。
[0102]在所述方法中，催化醇脱氢的酶可包括醇脱氢酶。所述醇脱氢酶可包括EC.1.1.1.1或ECl.1.1.2。它还可以是例如,来自运动发酵单胞菌(Zymomonas mobilis)的adhA、来自运动发酵单胞菌的adhB、来自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的丁醇脱氢酶、酵母属ADHIV、和来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的ADH6。
[0103]用在本文方法中的PCoA或PACP可源自乙酰-CoA或苯甲酰-CoA。乙酰-CoA可源自可再生原料，其包括纤维素原料、糖、甘油或脂肪酸。此外，乙酰-CoA可源自合成气、甲烷或甲醇。苯甲酰-CoA可源自多环芳香烃。
[0104]用在本文方法中的2，6DAP可由缺乏二氨基庚二酸脱羧酶的产赖氨酸生物体产生。2，6DAP源自可再生原料，其可含有糖。
[0105]本文特征为生物衍生的尼龙-7、尼龙-7，X、尼龙-X，7和聚酯。它还包括通过包括聚合7AHA的工艺产生的尼龙_7，其中所述7AHA源自PAS或AAS。本文还提供通过包括聚合PA和1，7DHA的工艺产生的尼龙_7，7，其中所述PA源自PCoA ；PACP ;或2HDA而1，7DHA源自7AM。本文还包括通过包括聚合7AHA的工艺产生的尼龙_7，其中7AHA由上述任一种导致7AHA产生的方法制备。本发明的另一个方面是通过包括聚合1，7DHA和PA的工艺产生的尼龙7，7，其中1，7DHA由上述任一种导致1，7DHA产生的方法制备，而PA由上述任一种导致PA产生的方法制备。
[0106]本文还提供一种基本纯的宿主细胞培养物，其中以实质的量包含并表达一种或多种编码涉及生物合成选自以下的一种或多种聚合物单体的一种或多种酶的外源核酸:7AHA ；PA ；1, 7DAH ；ENTL ;和7HHA。这些酶包括酰基-CoA还原酶、酰基_[acp]还原酶、硫酯水解酶、氨裂合酶、烯酸还原酶、氨基转移酶、CoA转移酶、硫酯酶、酸-硫醇连接酶、水裂合酶、羰基还原酶、羧酸还原酶、脂肪-酰基CoA还原酶、ω-转氨酶、α-酮酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶、和催化α-酮酸链延伸的酶。如本文中使用的，“实质的量”为培养物中至少10%(例如至少:20% ；30% ；40% ；50% ；60% ；70% ；75% ；80% ；85% ；90% ；95% ；97% ；98% ；99% ;或甚至100%)的细胞。
[0107]所述培养物的细胞可以是原核细胞，如且无限制地，大肠杆菌(Escherichiacoli)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、鞘氨醇单胞菌(sphingomonads)、假单胞菌(pseudomonad)、产甲烧菌细菌(例如Methanobacterium autotrophicum)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、莫拉氏菌属(Moraxella)、产喊杆菌属(Alcaligenes)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、栖热袍菌属(Thermotoga)、不动杆菌属(Acinetobacteria)、红细菌属(Rhodobacter)、固氮弧菌属(Azoarcus)、红螺菌属(Rhodospirillum)、短杆菌属(Brevibacterium)、链球菌属(streptococci)、乳杆菌属(Iactobacilli)、诺卡氏菌属(Nocardia)、芽抱杆菌属(Bacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)和节杆菌属(Arthobacter)。
[0108]或者，所述培养物的细胞可以是真核细胞，例如真菌细胞如酵母细胞。酵母细胞可以使如且无限制地，解脂西洋蓍霉(Yarrowia Iipolytica)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、根霉属(Rhizopus)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、丝抱酵母属(Trichosporon)、伊萨酵母属(Issatchenka)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、许旺酵母属(Schwanniomyces)和油脂酵母属(Lipomyces)。假丝酵母细胞可以是酵母如且无限制地,热带假丝酵母(C.tropicalis)、白色假丝酵母(C.albicans)、C.cloacae、C.gui I lermondi 1、C.1ntermedia、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)、C.parapsilosis和C.zeylenoides的。其他真菌细胞可以是真菌如且无限制地，曲霉属(Aspergillus)、外瓶霉属(Exophiala)、毛霉属(Mucor)、木霉属(Trichoderma)、枝抱属(Cladosporium)、平革菌属(Phanerochaete)、Cladophialophora、拟青霉属(Paecilomyces)、Scedosporium 和 Ophiostoma 的。
[0109]可由所述细胞表达的外源酶如下。所述氨裂合酶可包括EC4.3.1中的氨裂合酶，例如 EC4.3.1.1 ；EC4.3.1.2 ；EC4.3.1.3 ；EC4.3.1.12 ；EC4.3.1.13 ；或 EC4.3.1.24。所述烯酸还原酶可包括ECl.3.1中的烯酸还原酶，例如ECl.3.1.31。所述羧酸还原酶包括ECl.2.99中的羧酸还原酶，例如ECl.2.99.6。所述ω -转氨酶可包括EC2.6.1中的转氨酶，例如 EC2.6.1.18 ；EC2.6.1.19 ；EC2.6.1.2 ；EC2.6.1.7 ；EC2.6.1.29 ；EC2.6.1.36 ；EC2.6.1.39 ；EC2.6.1.42 jEC2.6.1.68。所述硫酯酶可包括EC3.1.2中的硫酯酶，例如EC3.1.2.18 ；EC3.1.2.19 ;*EC3.1.2.20。所述酸-硫醇连接酶可包括EC6.2.1中的酸-硫醇连接酶，例如EC6.2.1.3 ；EC6.2.1.14 jEC6.2.1.23。所述CoA转移酶可包括EC2.8.3中的CoA转移酶，例如EC2.8.3.12或EC2.8.3.13。所述氨基转移酶可包括EC2.6.1中的氨基转移酶，例如EC2.6.1.67。所述羰基还原酶可包括EC.1.1.1.184。所述脂肪-酰基-CoA还原酶可包括ECl.2.1中的脂肪-酰基-CoA还原酶，例如ECl.2.1.50。所述醛脱氢酶可包括ECl.2.1中的醛脱氢酶，例如ECl.2.1.4或ECl.2.1.63。所述水裂合酶包括EC4.2.1中的水裂合酶， 例如EC4.2.1.2 ；EC4.2.1.59 ；4.2.1.61 ；4.1.2.17 或4.1.2.18。所述催化 α -酮酸链延伸的酶可包括包含AksA、AksD、AksE和AksF酶的组中的一种或多种酶。所述AksA可包括EC2.3.3中的AksA酶，例如EC2.3.3.13或2.3.3.14。所述AksD可包括EC4.2.1中的AksD 酶，例如 EC4.2.1.33。所述 AksF 可包括 ECl.1.1 中的 AksF 酶，例如 ECl.1.1.85。所述醇脱氢酶可包括，例如EC.1.1.1.1或ECl.1.1.2。另外，所述醇脱氢酶可包括例如，来自运动发酵单胞菌的adhA、来自运动发酵单胞菌的adhB、来自丙酮丁醇梭菌的丁醇脱氢酶、酵母属ADHIV和来自酿酒酵母的ADH6。
[0110]本文的另一个方面是分离的宿主细胞，其包含并表达一种或多种编码涉及选自7AHA ；PA ;1，7DAH ；ENTL ;和7HHA的一种或多种聚合物单体的生物合成的一种或多种酶的外源核酸。所述酶包括酰基CoA还原酶、酰基-[acp]还原酶、硫酯水解酶、氨裂合酶、烯酸还原酶、氨基转移酶、CoA转移酶、硫酯酶、酸-硫醇连接酶、水裂合酶、羰基还原酶、羧酸还原酶、脂肪-酰基CoA还原酶、ω-转氨酶、α-酮酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶、和催化α-酮酸链延伸的酶。所述细胞和酶可以是上文对基本纯的宿主细胞培养物所描述的那些中的任一种。
[0111]从本文中列出的下文详细说明考虑，其他目标和优点对于本领域技术人员将是明显的。
[0112]附图简述
[0113]图1是显示庚二酸半醛到可用于尼龙7、尼龙7，7和尼龙7，χ生产以及聚酯的各种双官能C7烷的生物转化的示意图。 [0114]图2是从庚二酰-CoA、庚二酰-[acp]或α -酮辛二酸(均为如指示的天然存在途径中的中间物)形成庚二酸半醛的示意图。
[0115]图3是α-酮酸链延伸中的系列反应的示意图。牵涉3种基本反应:α-酮二酸与乙酰-CoA之间缩合以形成柠檬酸同源物，柠檬酸同源物异构化为异柠檬酸同系物，和异柠檬酸同系物氧化脱羧为ct -酮二酸，其含有另外的亚甲基基团[Howel 198:HowelIDM, Harich K, Xu H, White RH (1998).Alpha-keto acid chain elongation reactionsinvolved in the biosynthesis of coenzyme B(7-mercaptoheptanoyl threoninephosphate) in methanogenic Archaea.^Biochemistry 1998; 37 (28) ; 10108-17]。
[0116]这些反应类似于在TCA循环I (原核)循环中由柠檬酸合酶、顺乌头酸酶(aconitase)和异柠檬酸脱氢酶催化的反应，以及在赖氨酸生物合成V中由(R)-高柠檬酸合酶、高顺乌头酸酶(homoaconitase)和(_)_苏型-异高柠檬酸脱氢酶催化的反应[Howell, 1998，见上]。
[0117]图4是经由3个丙二酰-CoA的缩合形成庚二酰-CoA的示意图。
[0118]图5是在生物素生物合成途径II中从庚二酸或7-酮-8-氨基壬酸酯生物合成中的其他前体形成庚二酰-CoA的示意图。7-酮-8-氨基壬酸酯是生物素生物合成的关键中间物。庚二酰-CoA在宿主生物中的降解可由BioF的缺失或失活阻止，该基因编码7-酮-8-氨基壬酸合成酶(E.C.2.3.1.47)。
[0119]图6是生物素生物合成途径I中7-酮-8-氨基壬酸生物合成中庚二酰-[acp]或其甲基酯形成的示意图。生物素生物合成中的关键中间物。庚二酸或庚二酸半醛可从这些前体制备，其通过aaaS (酰基ACP合成酶)、FatA (脂肪酰基ACP硫酯酶A) ,FatB (脂肪酰基ACP硫酯酶B)或酰基-[acp]还原酶的作用，如粗体显示的。[0120]图7是显示从苯甲酸形成庚二酰-Cok或环己烷羧酸降解的示意图。
[0121]图8是显示鞘氨醇单胞菌和棒状杆菌菌种中萘满降解途径中庚二选半醛形成的示意图。
[0122]图9是显示通过产甲烷菌在环己烷羧酸途径中从巴豆酸酯形成庚二酰-CoA的示意图。参见 Mouttaki 等,Applied and Environmental Microbiology, 930-938 页(2001)。
[0123]图10是显示从作为起点的D，L- 二氨基庚二酸经由2-氨基庚二酸到庚二酸半醛和7-氨基庚酸的工程化途径例子的示意图。从2-氨基庚二酸到庚二酸半醛有两条路径，经由通过氨裂合酶的还原性脱氨基化到2-庚烯二酸，或经由α-酮酸的形成，其可随后转化成庚二酸或其CoA酯。或者，源自2-氨基庚二酸的α-酮-庚二酸可进行一轮链延伸为α-酮-辛二酸，其可脱羧以形成庚二酸半醛或转化成α-氨基辛二酸，α-氨基辛二酸在脱羧时直接产生7-氨基庚酸。α-酮-庚二酸还可源自α-酮-己二酸，其相应地可源自α-酮-戊二酸，经由两轮连续的α-酮酸链延伸。
[0124]图1lA显示对来自无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacter amalonaticus)氨裂合酶蛋白表达的可溶和不可溶级分的SDS-PAGE分析。
[0125]图1lB显不对来自假破伤风梭菌(Clostridium tetanomorphum) (15)和米曲霉(Aspergillus oryzae) (16)氨裂合酶蛋白表达的可溶和不可溶级分的SDS-PAGE分析。
[0126]图12显示对来自诺卡氏菌属菌种羧酸还原酶基因表达的可溶和不可溶级分的SDS-PAGE 分析。
[0127]图13显示由于 通过诺卡氏菌CAR还原酶活性庚二酸到庚二酸半醛的还原在吸光度中随时间的变化。
[0128]图14显示对来自流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae) YciA硫酯酶蛋白(18)表达的可溶和不可溶级分的SDS-PAGE分析。
[0129]图15显示对氨基转移酶IlvE-Omega Vf融合物(pING2022)和IlvE-Ad优化的omega融合物(pING2030)蛋白的SDS-PAGE分析。
[0130]图16显示丙酮酸钠和7-氨基庚酸生物转化的结果，连同7-氨基庚酸底物和L-丙氨酸产物的测量浓度。
[0131]图17显示在48和96小时后6种生物转化中L-和D_2_氨基辛二酸对映异构体浓度的HPLC结果汇总。
[0132]图18显不对来自大肠杆菌GadA(129)、大肠杆菌LysA(130)、大肠杆菌GadAilvE(I31)和大肠杆菌LysA ilvE(I32)蛋白表达的珠裂解的可溶和不可溶级分的SDS-PAGE分析。
[0133]图19显示来自2-氨基辛二酸脱羧的7-氨基庚酸的形成。
[0134]图20显示使用ClustalW算法的蛋白质比对，其显示MJ0277与comD(SEQ ID41)/comE(SEQ ID42)蛋白之间的显著同源性。
[0135]图21显不MJ0277对来自乳酸乳球菌(Lactococcus Iactis)的LACLA乙酸乳酸合酶(SEQ ID43)的同源性。
[0136]图22 显不对 LACLA 乙酸乳酸合酶、来自 Methanocella paludicola 的 comD/comE和假定的乙酰乳酸合酶MJ0277中功能域的分析显示其均具有含硫胺磷酸结合位点的类似结构。[0137]图23绘出pING2022载体图谱，其含有IlvE-Omega Vf融合基因。
[0138]图24绘出pING2030载体图谱，其含有IlvE-Ad优化的omega融合基因。
[0139]图25 列出 SEQ.1D1-40。
[0140]发明详述
[0141]一般地，本公开涉及用于生物合成性产生双官能或三官能C7烷的方法和材料，所述双官能或三官能C7烷可用作生产尼龙-7、尼龙-7，X和尼龙-X，7以及生产聚酯中的中间物。
[0142]在一些实施方案中，I种或多种(例如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、 13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、18种或更多种、19种或更多种、或20种或更多种)分离的酶(例如氨裂合酶、烯酸还原酶、氨基转移酶、CoA转移酶、硫酯酯酶(thioestesterase)、酸-硫醇连接酶、水裂合酶、羰基还原酶、硫酯酶、羧酸还原酶、脂肪-酰基CoA还原酶、ω-转氨酶、α-酮酸脱羧酶、催化α -酮酸链延伸的酶、酰基ACP合成酶、FatA(脂肪酰基ACP硫酯酶A)、FatB(脂肪酰基ACP硫酯酶B)、或酰基_[acp]还原酶)可用于生物合成性产生所述双官能或三官能C7烷。这类酶可自表达编码所述酶的外源核酸的重组细胞或天然表达所述酶的非重组细胞分离。
[0143]在一些实施方案中，包含I种或多种(例如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、18种或更多种、19种或更多种、或20种或更多种；或甚至更多种)编码I种或多种(例如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、18种或更多种、19种或更多种、或20种或更多种；或甚至更多种)酶(例如一种或多种(如上文)的氨裂合酶、烯酸还原酶、氨基转移酶、CoA转移酶、硫酯酯酶(thioestesterase)、酸-硫醇连接酶、水裂合酶、羰基还原酶、硫酯酶、羧酸还原酶、脂肪-酰基CoA还原酶、ω -转氨酶、α -酮酸脱羧酶、催化α -酮酸链延伸的酶、酰基-ACP合成酶、FatA, FatB、或酰基_[acp]还原酶)的外源核酸的重组宿主，或从这类重组宿主或天然表达所述酶的非重组细胞制备的裂解物可用于生物合成性产生双官能或三官能C7烷。重组宿主还可在一种或多种内源性酶中具有缺陷以使代谢中间物转向双官能或三官能C7烷的产生。
[0144]如本文中描述的，生物合成性产生的双官能或三官能C7烷可用于生产尼龙_7、尼龙_7，X、或尼龙-X，7、以及聚酯。术语“尼龙-7”是通过单体7-氨基庚酸的聚合作用或通过庚内酰胺的开环缩合产生的聚酰胺。尼龙-7也称为“聚庚酰胺(polyenanthamide) ”或“聚庚酰胺(polyheptanamide) ”。
[0145]术语“尼龙-X，7”指通过庚烷-1，7- 二元酸(亦称为庚二酸或庚二酸酯)与二胺的聚合作用产生的聚酰胺家族。整数X指示庚烷-1，7- 二元酸与之反应的二胺中的碳原子数。在一些实施方案中，整数X是大于3的整数，例如大于5、大于7、或大于9。例如，尼龙_5，7通过将庚烷-1，7- 二元酸与1，5-戊二胺反应产生。尼龙7，7通过将庚烷-1，7- 二元酸与1，7 二氨基庚烷反应产生。
[0146]术语“尼龙_7，X”指通过七亚甲基二胺与二羧酸的聚合反应产生的聚酰胺家族。整数χ指示七亚甲基二胺与之反应的二羧酸中的碳原子数。例如，尼龙_7，5通过七亚甲基二胺(亦称为1，7- 二氨基庚烷或1，7-庚二胺)与戊烷-1，5- 二元酸的反应产生。在一些实施方案中，整数χ是大于3的整数,例如大于5、大于7、或大于9。
[0147]术语“聚酯”指在其主链中含有酯官能团的聚合物种类。聚酯可以是同型聚合物，例如通过己内酯的开环缩合产生的聚己内酯。共聚物聚酯通过多官能醇和酸的酯化缩合形成。例如，己二酸和乙二醇用于产生聚乙烯己二酸。庚二酸在这类共聚物中可替换己二酸使用。或者，7-羟基庚酸可用于产生聚庚醇内酯(polyenantholactone)。
[0148]现将以更多关于本文中描述的所述方案的细节来描述本发明的前述方面和其他方面。应领会本发明可以不同形式实施且不应解释为限制本文中列出的实施方案。更确切地，这些实施方案的提供使得本公开为全面且完整的，并将向本领域技术人员告知本发明的范围。
[0149]1.1 定义
[0150]本文发明描述中使用的术语学仅出于描述具体实施方案的目的，且不意图限制本发明。如在本发明实施方案的描述和所附权利要求中使用的，除非上下文另外清楚地指示，单数形式“一 / 一个/ 一种”和“该”还意图包括复数形式。而且，如本文中使用的，“和/或”意指并涵盖一种或多种所列关联项的任意和所有可能组合。除非另外定义，描述中使用的所有术语，包括技术和科学术语具有与本发明所属领域中普通技术人员普遍理解的相同的含义。
[0151]如本文中使用的，术语“酶”指能够催化反应的蛋白质催化剂。本文中该术语不仅指分离的酶，而且还包括表达该酶的宿主细胞。因此，通过酶C的A到B的转化还应理解为涵盖通过表达酶C的宿主细胞的A到B的转化。
[0152]如本文中使用的，术语“双官能C7烷”指直链或支链、饱和或不饱和的具有7个碳原子和两个官能团的烃。所述官能团可置于沿烃链的任何点。在一些实施方案中，所述官能团位于烃链的末端(例如在每个末端各一个官能团)。该术语还意图涵盖环状化合物如庚内酰胺。例示性双官能C7烷包括但不限于，庚二酰-CoA、庚二酰-[acp]、庚烷-1，7- 二元酸(庚二酸或庚二酸盐)、7_氨基庚酸、7-羟基庚酸、七亚甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醇、7-氨基庚醛、庚内酰胺、庚二酸半醛(亦称为7-氧庚酸)、2_庚烯二酸和2-庚烯二酸-CoA0
[0153]如本文中使用的，术语酸酯(-oate) ”和酸(_oic acid) ”例如庚酸酯和庚酸可交换使用。此外，应理解“盐/酯(-ate)，，、“_酸酯(-oate) ”和酸(-oic acid) ”可贯穿交换使用以指示处于其中性或离子化形式和所谓的“两性离子”形式中任一种的化合物。
[0154]如本文中使用的，术语“三官能C7烷”指直链或支链、饱和或不饱和的具有7个碳原子和三个官能团的烃。所述官能团可置于沿烃链的任何点。在一些实施方案中，3个官能团中有两个位于烃的末端(例如在每个末端各一个官能团)。例示性三官能C7烷包括但不限于，2-氧庚二酸盐(α -酮庚二酸盐)、2_氨基庚二酸盐(α -氨基庚二酸盐)、2_羟基庚二酸盐(α -羟基庚二酸盐)和2-羟基庚二酸盐-CoA ( α -羟基庚二酸盐-CoA)。
[0155]如本文中使用的，术语“官能团”指胺基团、羧酸基团、醛基团、醇基团、辅酶A基团或酮基团。术语“胺基团”指-NH2基。术语“羧酸基团”指-COOH基。术语“醛基团”指-C(O)H基。术语“醇基团”指-OH基。术语“酮基团”指C(O)基。
[0156]术语“辅酶A基团”指有机辅因子或辅基(酶的非蛋白部分)，其存在是形成活性酶系统的许多酶(脱辅基酶蛋白)的活性所需要的。辅酶A在特定浓缩酶中有功能，作用于乙酰或其他酰基基团转移和脂肪酸合成和氧化、丙酮酸氧化和其他乙酰化。
[0157]术语“acp”或“酰基载体蛋白”指从乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A挑出乙酰和丙二酰基团且通过缩合将其连接以形成β_酮酸酰基载体蛋白，并释放二氧化碳和该酰基载体蛋白的巯基形式的蛋白质(其通常在脂肪酸合成中有活性)。
[0158]双官能或三官能C7烷上的官能团可以是相同或不同的:例如，在双官能C7烷的一些实施方案中，两个官能团可以均为胺基团，两个官能团可以均为羧酸基团，或两个官能团可以均为醇基团。
[0159]在一些实施方案中，双官能C7烷上的一个官能团是胺基团而另一个是羧酸基团。在一些实施方案中，双官能C7烷上的一个官能团是醇基团而另一个是羧酸基团。在一些实施方案中，双官能C7烷上的一个官能团是醇基团而另一个是胺基团。
[0160]在三官能C7烷的一些实施方案中，两个官能团是羧酸基团而一个官能团是酮基团或羟基基团或氨基基团。
[0161]术语“异源”用于本文指并非源自与宿主细胞相同物种的细胞的任何核酸或多肽。因此，如本文中使用的， “同源”核酸或蛋白质是那些存在于与宿主细胞相同物种的细胞中或由其产生的核酸或蛋白质。
[0162]如本文中关于核酸和具体宿主细胞使用的，术语“外源”指不像自然界中发现的存在于具体细胞中(且不能从中获得)的任何核酸。如此，非天然存在的核酸一旦导入宿主细胞即视为对该宿主细胞外源的。重要的是注意非天然存在的核酸可含有在自然界中发现的核酸序列的核酸子序列或片段，只要该核酸作为整体不存在于自然界中。例如，表达载体内含有基因组DNA序列的核酸分子是非天然存在的核酸，如此一旦导入宿主细胞即视为对该宿主细胞为外源的，因为该核酸分子作为整体(基因组DNA加载体DNA)不存在于自然界中。如此，作为整体不存在于自然界中的任何载体、自主复制的质粒或病毒(例如逆转录病毒、腺病毒、或疱疹病毒)视为非天然存在的核酸。由此通过PCR或限制内切酶处理产生的基因组DNA片段以及cDNA也视为非天然存在的核酸，因为它们作为未见于自然界的分开的分子存在。亦由此任何以未见于自然界中的排布含有启动子序列和多肽编码序列(例如cDNA或基因组DNA)的核酸分子也是非天然存在的核酸。天然存在的核酸可以是对具体细胞外源性的。例如，从酵母X的细胞分离的完整染色体一旦将该染色体导入酵母y的细胞中时即为酵母I细胞的外源性核酸。
[0163]从上文来看，“外源性”核酸可以是“同源”或“异源”核酸将是清楚的。相反，如本文中关于核酸或基因(或由核酸或基因编码的蛋白质)和具体细胞使用的术语“内源性”指如在自然界中发现的确实存在于具体细胞中(且可从中获得)的任何核酸或基因。
[0164]如本文中使用的，术语“重组宿主”指其基因组已通过至少外源性核酸序列扩大的宿主。这类核酸序列包括但不限于，不天然存在于宿主中的核酸(即异源核酸)、不正常转录成RNA或翻译成蛋白质(“表达”)的DNA序列、和期望导入非重组宿主中的其他核酸序列(例如改变具体核酸序列表达的调节区)。会领会本文中描述的重组宿主的基因组通常经由一种或多种外源核酸的稳定导入得到扩大。一般地，所述外源核酸原始不存在于作为DNA受体的宿主中(即它是异源核酸)，但从给定宿主分离核酸然后将该核酸的一个或多个额外拷贝导入相同宿主中，例如以增强编码产物的产生或改变核酸的表达模式，是在本发明范围内的。在一些情况下，外源核酸将修改或甚至替换内源基因或DNA序列，其通过例如同源重组或定点诱变。内源基因的修改或替换可导致特定编码产物例如酶的缺陷。合适的重组宿主记载于下文。重组宿主还可含有不包含在宿主细胞基因组中但附加存在(并复制，优选地)于细胞中的核酸。
[0165]如本文中使用的，“启动子”指使得基因能转录的DNA序列。启动子被RNA聚合酶识别，然后该酶启动转录。如此，启动子含有由RNA聚合酶直接结合或涉及RNA聚合酶招募的DNA序列。启动子序列还可包含“增强子区”，其为可由蛋白质(即反式作用因子，很大程度上像一组转录因子)结合以增强基因簇中基因转录水平(得名由来)的一个或多个DNA区。通常在编码区5’端的增强子也可与启动子序列分开，且可以例如位于基因的内含子区中或在基因编码区的3’。
[0166]如本文中使用的，“可操作连接”意指掺入遗传构建体中从而使得表达控制序列有效控制感兴趣编码序列的表达。
[0167]1.2 原料
[0168]多种不同原料可用于产生二或三官能烷。在一些实施方案中，使重组宿主细胞或从细胞(例如重组宿主细胞)制备的裂解物与可再生原料接触以产生双官能或三官能C7烷如7-氨基庚酸。可用作碳源的可再生原料的例子包括但不限于，纤维素原料、植物源的糖类和脂肪酸。在一些实施方案中，重组宿主细胞接触的原料是葡萄糖、蔗糖、木糖、脂肪酸或甘油。
[0169]除了如上文所列那些的可再生原料以外，可将重组宿主细胞修饰为在作为碳源的合成气(亦称为SynGas)上生长。在这一具体的实施方案中，将本发明的重组宿主细胞工程化以提供用于利用合成气或其他气体碳源来产生双官能或三官能C7烷的有效代谢途径。
[0170]另外，可以使本文中描述的重组宿主或从重组宿主细胞制备的裂解物与芳香烃原料接触。芳香烃原料代替可再生原料的使用提供了一种将这类石油源材料转化成对环境更有益的化合物的方式，从而降低环境影响。合适的芳香烃原料的例子包括但不限于，甲苯、苯、苯酸和莽草酸(shikimate)。
[0171]1.3.包括酶催化步骤的到双官能C7烷的路径
[0172] 如上所述，本发明的实施方案涉及用于在存在一种或多种分离的酶、存在表达该酶/那些酶的重组宿主细胞、或存在表达该酶的细胞(例如重组细胞)的细胞裂解物(或部分纯化的裂解物)的情况下产生双官能或三官能C7烷的方法。在一些实施方案中，双官能或三官能C7烷的产生开始于庚二酸盐或庚二酰-CoA，且经由通用中间物即庚二酸半醛进行。具体地，在一些实施方案中，本发明涉及一种产生双官能C7烷7-氨基庚酸的方法，其通过使用催化庚二酸半醛到7-氨基庚酸的半醛氨基化的酶。见图1。可以使用半醛氨基转移酶如ω-转氨酶。例示性转氨酶包括但不限于分类在EC2.6.1下的转氨酶，如EC2.6.1.18 ；EC2.6.1.19 ；EC2.6.1.2 ；EC2.6.1.7 ；EC2.6.1.29 ；EC2.6.1.36 ；EC2.6.1.39 ；EC2.6.1.42 JPEC2.6.1.68。在一些实施方案中，所述氨基转移酶是分类在EC2.6.1.18中的β -丙氨酸氨基转移酶，其来自V.fluvialis、B.weihenstephanensis、铜绿假单胞菌(P.aureginosa)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、或丁香假单胞菌(P.syringae)。参见W02011/031147，其通过提述完整并入本文。
[0173]在一些实施方案中，7-氨基庚醛可使用催化7-氨基庚酸到7-氨基庚醛的醛脱氢的酶产生。见图1。可使用分类在ECl.2.1下的醛脱氢酶，如ECl.2.1.4或ECl.2.1.63从
7-氨基庚酸产生7-氨基庚醛。
[0174]在一些实施方案中，七亚甲基二胺(亦称为1，7-二氨基庚烷)可从7-氨基庚醛产生，其使用催化氨基基团转移的酶。见图1。合适的氨基转移酶包括但不限于，EC2.6.1中的氨基转移酶如EC2.6.1.18 ；EC2.6.1.19 ；EC2.6.1.2 ；EC2.6.1.7 ；EC2.6.1.29 ；EC2.6.1.36 ；EC2.6.1.39 ；EC2.6.1.42 ;和EC2.6.1.68。在一些实施方案中，所述氨基转移酶是分类在EC2.6.1.18 中的 β -丙氨酸氨基转移酶，其来自 V.f luvialis、B.weihenstephanensis、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、或丁香假单胞菌。参见W02011/031147，其通过提述完整并入本文。
[0175]在一些实施方案中，庚内酰胺可使用催化7-氨基庚酸的酰胺水解的酶从7-氨基庚酸产生。见图1。可使用合适的酰胺水解酶包括分类在EC3.5.2如EC3.5.2.12或EC3.5.2.1下的酰胺转移酶。
[0176]在一些实施方案中，7-羟基庚酸自庚二酸半醛产生或7-氨基庚醇自7-氨基庚醛产生，其使用催化醛还原的酶。见图1。例如，可使用分类在ECl.1.1如ECl.1.1.21下的醇脱氢酶。 [0177]在一些实施方案中，1，7庚二醇可自7-羟基庚酸产生，其使用醛脱氢酶和醇脱氢酶。合适的醛脱氢酶可以使分类在ECl.2.1 (例如ECl.2.1.4)下的。见图1。合适的醇脱氢酶可以使分类在E.C.1.1.1.如ECl.1.1.1下的。
[0178]在其中C7 二或三官能烷可能对宿主有毒性(例如半醛如7-氧庚酸或7-氨基庚醛)的实施方案中，对毒性化合物的转化可以在体外实施，其使用分离的酶或来自重组宿主的裂解物。在一些实施方案中，毒性化合物由宿主产生，然后转化(使用分离的酶、表达酶的重组宿主、或化学转化)成庚内酰胺。
[0179]1.5庚二酸和/或庚二酰-CoA的生物合成途径
[0180]庚二酸和/或庚二酰-CoA可经由许多不同的方式获得，包括:(i)从α-酮酸链延伸途径产生的α-酮辛二酸，或(ii)生物素生物合成途径I ; (iii)生物素生物合成途径II ； (iv)三个丙二酰-CoA分子到单个庚二酰-CoA分子的缩合；(V)苯甲酸降解途径；(vi)环己烷羧酸酯途径，(vi)D，L-二氨基庚二酸途径；和(vii)其中起始碳源是巴豆酸酯(crotonate)的生物合成途径。见图2。这些到庚二酸和/或庚二酰-CoA的途径在下文以更多细节描述。
[0181]在其中任一种途径中，庚二酸可从庚二酰-CoA产生，其使用催化硫酯水解的酶。例如，能水解硫酯的酶包括但不限于，硫酯酶、酸-硫醇连接酶和CoA转移酶。合适的硫酯酶包括分类在EC3.1.2中的硫酯酶，如EC3.1.2.18 ；EC3.1.2.19 jEC3.1.2.20。例如，可使用以下一种酶:分类在EC3.1.2中的硫酯水解酶/酰基-CoA硫酯酶如EC3.1.2.19和
3.1.2.18中的ADP依赖性中等链酰基-CoA水解酶、EC3.1.2.20中的酰基CoA水解酶；或EC3.1.2.3.中的水解酶。合适的酸-硫醇连接酶包括分类在EC6.2.1中的酸-硫醇连接酶，如EC6.2.1.3 ；EC6.2.1.14 ;和EC6.2.1.23。合适的CoA转移酶包括分类在EC2.8.3下的 CoA 转移酶如 EC2.8.3.6、EC2.8.3.8、EC2.8.3.12 或 EC2.8.3.13。
[0182]庚烷-1，7-二元酸可从庚二酰-[acp]获得,其通过使用作用于[acp]-硫酯的酶，如EC2.3.1.38 ([酰基载体蛋白]S-乙酰转移酶)或EC3.1.2.14中的水解酶，如fatA和fatBo或者,庚二酸可从庚二酰_[acp]甲基酯获得,其通过由AaasaS (酰基-ACP合成酶)水解酯键，接着通过脂肪酶/酯酶除去甲基基团。
[0183]庚二酸可转化成庚二酸半醛，其使用催化羧酸还原的酶。合适的还原酶包括但不限于，分类在ECl.2.99中的羧酸还原酶或分类在ECl.2.1如ECl.2.1.50中的脂肪酰基CoA还原酶。在一些实施方案中，脂肪-酰基-CoA还原酶可直接将庚二酰-CoA或庚二酰_[acp]转化成庚二酸半醛。ECl.2.99中的例示性羰基还原酶包括但不限于来自诺卡氏菌菌种(Aimin 等,Appl.Environ.Microbiol.70:1874-1881 (2004)，通过提述并入)或灰色链霉菌(S.griseus) (Suzuki 等，J.Antibiot.(Tokyo) 60:380—387 (2007),通过提述并入)的ECl.2.99.6。ECl.2.1中的例示性羰基还原酶包括但不限于来自例如C.aurantiacus (Hugler, M,等，J.Bacteriology 184:2404-2410 (2002),通过提述并入)、M.sedula (Kockelkorn, D.和 Fuchs, G., J.Bacteriologyl91:6352-6362 (2009)，通过提述并入)、或S.tokodai (Alber, B.等，J.Bacteriologyl88:8551-8559 (2006)，通过提述并入)的ECl.2.1.75 ;和来自以下的 1.2.1.50:例如不动杆菌属菌种 A.platyrhynchos (Ishige, T.,等,Appl.Envtl Microbiology68:1192-1195 (2002)，通过提述并入)、拟南芥(A.thaliana)(Doan, T.T.,等，Journal Plant Physiologyl66:787-796 (2009)和 Hooks, Μ.A.,等，PlantJ.20:1-13 (1999)，两者均通过提述并入);人(Homo sapiens) (McAndrew, R.P.等，J.Biol.Chem.283:9435-9443 (2008)，通过提述并入)、小家鼠(M.Musculis)、P.1eiognath1、明亮发光杆菌(P.phosphoreum)、豌豆(P.sativum)、或 S.chinesis 的 1.2.1.50。
[0184]1.5.1 α - 酮酸链延伸
[0185]二官能烷可从α-酮戊二酸产生，其经由本领域中已知的到0-酮己二酸、0-酮庚二酸或α-酮辛二酸的连续链延伸反应。参见例如图3和W02010/068944。α-酮二元酸(Cn，n=5-8)或相应2-氨基二元酸的脱羧然后提供Cn-1例如C4-7的α，ω-双官能烷的前体。这些连续的alpha-酮酸链延伸反应发生在辅酶B生物合成途径中，如在产甲烷细菌如詹氏甲烧球菌(Methanocaldococcus jannaschii)、沃氏甲烧球菌(Methanococcus voltae)和嗜热甲烧八叠球菌(Methanosarcinathermophila)中阐明的。
[0186]从a-酮戊二酸(C5)到α -酮辛二酸的3轮连续的链延伸由在底物上作用3次的3个相同酶催化(且在EC4.2.1.114 (AksD (3-异丙基苹果酸脱水酶大亚基)/AksE (3-异丙基苹果酸脱水酶小亚基))的情况中6次)，每次增加链长度。见图3。这些酶包括但不限于:EC2.3.3.14:高柠檬酸合酶/AksA(alpha-异丙基苹果酸合酶)，其作用于α -酮戊二酸、α-酮己二酸和α -酮庚二酸；EC4.2.1.114:高顺乌头酸酶或AksD/AksE，其催化(R)-高柠檬酸、二高柠檬酸和三高柠檬酸的脱水反应，以及顺式-高乌头酸、顺式_(高)2乌头酸和顺式_(高)3乌头酸的水合反应；和ECl.1.1.87:高异柠檬酸脱氢酶或AksF (多功能3-异丙基苹果酸脱氢酶/D-苹果酸脱氢酶)，其催化高异柠檬酸、苏型-异(高)2柠檬酸和苏型-异(高)3柠檬酸的NAD (P) +依赖性氧化性脱羧。
[0187]例示性AksA酶包括但不限于，EC2.3.3中的那些，如EC2.3.13或2.3.3.14。例示性AksD酶包括EC4.2.1中的那些，如EC4.2.1.33。例示性AksF酶包括但不限于ECl.1.1中的酶，如ECl.1.1.85。
[0188]在一些实施方案中，所述链延伸酶是AksA MTH1630、AksD MTH1631、AksE MTH0829或AksF MTH1388。参见，例如W02010/104391，其通过提述并入本文。
[0189]该途径的优点在于其仅需要这3种异源蛋白质在宿主中的重组表达。从α-酮戍二酸到α -酮己二酸的链延伸还发生在古细菌，包括Aeropyrum pernix、Deinococcusradiodurans、Pyrococcus abyss1、Pyrococcus horikoshi1、硫石黄矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)、Sulfolobus tokodaii 和嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)的赖氨酸生物合成V途径中；以及酵母和真菌包括Euglena gracilis、曲霉属、产黄青霉(Penicilliumchrysogenum)和酿酒酵母的赖氨酸生物合成IV途径中。
[0190]在赖氨酸生物合成IV和V途径中，从α -酮戊二酸到α -酮己二酸的反应由4种酶的连续作用催化，即:EC2.3.3.14:高柠檬酸合酶(hcs/LYS20/LYS21/nifV)；EC4.2.1.114:产甲烷菌HACN ；EC4.2.1.36:高顺乌头酸酶水合酶；和ECl.1.1.87-高异柠檬酸脱氢酶(hicDH或LYS12)。
[0191]1.5.3丙二酰-CoA缩合途径
[0192]在一些实施方案中，丙二酰-CoA可用作庚二酰-CoA的来源，因为某些生物能将3个丙二酰-CoA分子缩合成单个庚二酰-CoA分子。见图4。亦参见Lin, S.和Cronan, J.E.,Molecular Biosystems7:1811-21 (2011)，其通过提述并入本文。因此，可产生一种其中从丙二酰-CoA生成庚二酰-CoA的重组宿主。在一些实施方案中，宿主细胞是无色杆菌属(Achromobacter)以外的生物体。在一些实施方案中，庚二酰-CoA可随后转化成庚二酸或其他双官能C7烷。
[0193]1.5.4生物素生物合成途径I (革兰氏阴性细菌)和II (革兰氏阳性细菌)
[0194]在一个实施方案中，重组宿主细胞从源自甘油和/或脂肪酸的乙酰-CoA产生庚二酸和 / 或庚二酰- [acp]。参见，例如 Lin, S.，Nature Chem.Biol.6:682-688 (2010);和Cronan, J.E.和 Lin, S., Current Opinion in Chem.Biologyl5:1-7 (2011)，两者均通过提述并入本文。图5显示在生物素生物合成II (革兰氏阳性细菌)中从庚二酸或其他前体形成庚二酰-CoA。图6显示在生物素生物合成I (革兰氏阴性细菌)中形成庚二酰_[acp]或其甲基酯。图6还显示用于将庚二酰-[acp]甲基酯转化成庚二酸单甲基酯的途径。然后，庚二酸单甲基酯在存在例如EC3.1.1.中的脂肪酶的情况下转化成庚二酸(庚烷-1，7- 二元酸)。图6还显示在存在酯酶(例如EC3.1.1如EC3.1.1.85中的酶，BioH)的情况下庚二酰-[acp]甲基酯到庚二酰_[acp]的转化。庚二酰-[acp]然后在存在硫酯酶，例如EC3.1.2.14中的酶如FatA或FatB的情况下被转化成庚二酸(庚烷_1，7- 二元酸)。在一些实施方案中，本发明涵盖能产生庚二酸(庚烷-1，7-二元酸)的重组宿主细胞，其包含图6中显示的一种或所有酶。在一些实施方案中，所述重组宿主细胞在7-酮-8-氨基壬酸合成酶中确实具有缺陷，该酶是一种能将6-羧基己酰基-Cok (庚二酰-CoA)转化成7-酮-8-氨基壬酸(KAPA)的酶，且由具有天然生物素生物合成途径的宿主生物中的BioF基因编码，从而使得庚二酰-CoA不能穿梭到生物素生物合成中。
[0195]庚二酰-[acp]甲基酯还可作为长链酰基_[acp]和/或游离脂肪酸通过BioI (例如来自枯草芽孢杆菌的BioI)的代谢的结果产生。
[0196]1.5.5真核生物合成途径[0197]庚二酸和/或庚二酰-CoA还可从真核的生物素生物合成途径获得。参见，例如Roje, S., Phytochemistry68:1904-1921(2007)；和 Charles R.Hall, The Contribution ofHorizontal Gene Transfer to the Evolution of Fungi (MaylO, 2007)(未公开出版的博士论文，Duke University)(存档在Duke University Libraries),两者均通过提述并入本文。在真核途径中，乙酰-Cok被生物转化成乙酰乙酰CoA，其使用分类在EC2.3.1.9下的酶；乙酰乙酰-Cok被生物转化成(S)-3-羟基丁酰-CoA，其使用分类在E.C.1.1.1.157下的酶；(S)-3-羟基丁酰-CoA被生物转化成巴豆酰-CoA，其使用分类在EC4.2.1.17下的酶；巴豆酰-Cok被生物转化成戊烯二酰-Ι-CoA，其使用分类在EC4.1.1.70下的酶；戊烯二酰-1-CoA被生物转化成戊二酰-CoA，其使用分类在ECl.3.99.7下的酶；戊二酰-Cok被生物转化成3-酮庚二酰-CoA，其使用分类在EC2.3.1.43下的酶；3_酮庚二酰-Cok被生物转化成3-羟基庚二酰-CoA，其使用分类在ECl.1.1.4259下的酶；3_羟基庚二酰-Cok被生物转化成2，3- 二脱氢-庚二酰-CoA，其使用分类在EC4.2.1.-下的酶，而2，3- 二脱氢-庚二酰-Cok被生物转化成庚二酰-CoA，其使用分类在ECl.3.1.62下的酶。庚二酰-Cok随后转化成庚二酸。
[0198]在一些实施方案中，乙酰-CoA可供给到三羧酸(TCA)循环中，其中乙酰-CoA转化成琥珀酸(1，4-丁二酸)。然后，琥珀酸从TCA循环转移到用于合成庚二酸的途径中，其开始于2-氧戊二酸到2-羟基-1，2，4- 丁烷三羧酸(高柠檬酸)(例如通过EC2.3.3.14中的酶)的生物转化；高柠檬酸到高顺式乌头酸和高顺式乌头酸到高异柠檬酸的生物转化，其使用分类在EC4.2.1.36下的酶；高异柠檬酸到草酰戊二酸的生物转化，其使用分类在ECl.1.1.87下的酶；草酰戊二酸到2-氧己二酸的生物转化，其使用分类在ECl.1.1.87下的酶；和2-氧己二酸到戊二酰-CoA的生物转化，其使用分类在ECl.2.4.2下的酶。戊二酰-CoA可转化成庚二酰-CoA，如上文论述的。最后，高柠檬酸转化成庚二酰-CoA，然后转化成庚二酸，如本文中描述的。 [0199]如此，在一些实施方案中，本发明提供一种重组宿主细胞，其包含用于将乙酰CoA转化成庚烷-1，7- 二元酸的酶。在一些实施方案中，所述重组宿主细胞在7-酮-8-氨基壬酸合成酶中具有缺陷，该酶是一种能将6-羧基己酰基-CoA(庚二酰-CoA)转化成7-酮-8-氨基壬酸(KAPA)的酶，且由宿主(如果宿主生物具有天然生物素生物合成途径)中的BioF基因编码，从而使得庚二酰-CoA不能穿梭到生物素生物合成中。本发明的实施方案还提供一种产生庚烷-1，7- 二元酸的方法，其包括使用这类重组宿主细胞。
[0200]1.5.6苯甲酰-CoA降解途径
[0201]本文中涵盖的庚二酰-CoA和/或庚二酸的一个另外的来源是图7中显示的苯甲酸降解途径。参见，例如 Bernsteinb, J.R.，等，Metabolic Eng’glO: 131-140 (2008)；Harwood, C.S.,等，FEMS Microbiology Reviews22:439-458 (1999)；和 Harrison, F.H.和Harwood, C.S.，Microbiologyl51:727-736 (2005)，其均通过提述并入本文。许多转化例示在图7中，其中苯甲酸使用分类在EC6.2.1.25下的酶转化成苯甲酰-CoA，并最后转化成庚二酰-CoA。苯甲酰-CoA转化成环己-1，5- 二烯羰基CoA，其使用分类在ECl.3.99.15下的酶。在一些实施方案中，环己-1，5- 二烯羰基CoA生物转化成6-羟基环己-1-烯-1-羧基-CoA，其使用分类在EC4.2.1.100下的酶；6_羟基环己-1-烯-1-羧基-CoA生物转化成6-酮氧基环己-1-烯-1-羧基-CoA，其使用分类在ECl.1.1-下的酶；6_酮氧基环己-1-烯-1-羧基-Cok生物转化成3-羟基庚二酰-Cok,其使用分类在EC3.7.1.-下的酶；3-羟基庚二酰-CoA生物转化成6-羧基己-2-烯酰-CoA，其使用分类在EC4.2.1.-下的酶；3-羟基庚二酰-CoA生物转化成庚二酰-CoA，其使用分类在ECl.3.1.62下的酶。相应地，庚二酰-CoA转化成庚二酸(庚烷-1,7-二元酸)。在一些实施方案中，环己-1,5-二烯羰基Cok生物转化成环己-1-烯-1-羧基-CoA，环己-1-烯-1-羧基-Cok生物转化成2-羟基环己烷-1-羧基CoA，其使用分类在EC4.2.1.-下的酶；2-羟基环己烷_1_羧基Cok生物转化成2-酮环己烷-1-羧基-CoA，其使用分类在E.C.1.1.1.-下的酶，而2-酮环己烷羧基-CoA生物转化成庚二酰-CoA，其使用分类在EC3.1.2.-下的酶(例如一种酮环己烷羧基-CoA水解酶Rp-badl，分类在EC3.1.2.-下的酶)。
[0202]在一些实施方案中，所述能产生庚烷-1，7- 二元酸的重组宿主细胞包含一种或多种在图7或本部分中列出的酶。
[0203]1.5.72，6- 二氨基庚二酸途径
[0204]庚二酸的又一种来源是D，L 二氨基庚二酸，亦称为2，6- 二氨基庚二酸。D, L- 二氨基庚二酸是赖氨酸产生中的中间物。在一些实施方案中，内源性赖氨酸途径可修改为优先产生庚二酸，其通过创造 出在二氨基庚二酸脱羧酶中具有缺陷的重组宿主细胞。见例如图
10。D，L 二氨基庚二酸可生物转化成不饱和的单氨基庚二酸，其通过催化D，L 二氨基庚二酸到6-氨基-2-庚烯二元酸的还原性脱氨基化的酶。催化D，L 二氨基庚二酸的还原性脱氨基化的酶例子包括分类在EC4.3.1中的氨裂合酶，如EC4.3.1.1 ；EC4.3.1.2 ；EC4.3.1.3 ；EC4.3.1.12 ；EC4.3.1.13 JPEC4.3.1.24。在一些实施方案中，所述氨裂合酶是分类在EC4.3.1.2下的甲基天冬氨酸氨裂合酶,其来自无丙二酸柠檬酸杆菌、C.tetanomorphiim或米曲霉(A.0ryzae)。参见，例如 Botting, Biochemistry27:2953-2955 (1988)；和Kato, Appl Microbiol.BiotechnoL50:468-474 (1998),其通过提述完整并入本文。
[0205]6-氨基-2-庚烯二酸可生物转化成2-氨基-2-庚烯二酸，其使用催化6_氨基-2-庚烯二酸到2-氨基-2-庚二酸(亦称为2-氨基庚二酸或alpha氨基庚二酸盐)的烯酸还原的酶。催化6-氨基-2-庚烯二酸的烯酸还原的酶例子包括分类在ECl.3.1如ECl.3.1.31中的烯酸还原酶。在一些实施方案中，所述烯酸还原酶是ECl.3.1.31中的YqjM或0PR1/3,其分别来自枯草芽孢杆菌或L.esculentum。参见，例如Stueckler, Org.Lett.9:5409-5411 (2007) ；Kitzing,J.Biol.Chem.280:27904-27913 (2005)；Hall, Angew.Chem.1nt.Ed.46:3934-3937 (2007)；和 Breithaupt, Proc.Natl.Acad.SciUSA103:14337-14342 (2006)，其通过提述完整并入本文。
[0206]2-氨基庚二酸可转化成相应的2-庚烯二酸(亦称为2，3-二脱氢庚二酸)，其通过催化2-氨基庚二酸的还原性脱氨基化的酶。催化2-氨基庚二酸的还原性脱氨基化的酶例子包括分类在 EC4.3.1 中的氨裂合酶，如 EC4.3.1.1 ；EC4.3.1.2 ；EC4.3.1.3 ；EC4.3.1.12 ；EC4.3.1.13 ;*EC4.3.1.24，如上文描述的。2-庚烯二酸可转化成2-庚烯二酸CoA，其使用CoA转移酶(例如，分类在EC2.8.3如EC2.8.3.12或EC2.8.3.13中的CoA转移酶)和酸硫醇连接酶(例如分类在EC6.2.1如EC6.2.1.3 ；EC6.2.1.14 ;或EC6.2.1.23中的酸-硫醇连接酶)。
[0207]然后，将2-庚烯二酸CoA转化成庚二酸-CoA，其通过催化2_庚烯二酸的烯酸还原的酶，如分类在ECl.3.1.中的烯酸还原酶。庚二酸-CoA可如上文所述转化成庚二酸。[0208]如图10和图3中显示的，α酮庚二酸还可进行I轮链延伸成为α -酮-辛二酸，其可被脱羧以形成庚二酸半醛或转化成α-氨基辛二酸(在脱羧时将直接产生7-氨基庚酸)。例示性脱羧酶包括EC4.1.1中的那些，如EC4.1.1.11 ；EC4.1.1.15 ；EC4.1.1.17 ；EC4.1.1.18 ；EC4.1.1.19 ；EC4.1.1.20 和 EC4.1.1.86。在一些实施方案中，所述脱羧酶包括EC4.1.1.1中的来自乳酸乳球菌的酮异戊酸脱羧酶kivD ；EC4.1.1.7中的来自恶臭假单胞菌(P.putida)的苯甲酰甲酸脱羧酶mdIC A460I或BFD ；EC4.1.1.1中的来自酿酒酵母的丙酮酸脱羧酶同工酶I和2Pdcl ;来自运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶Pdc(I472A);或EC4.1.1.72中的来自乳酸乳球菌的支链alpha-酮酸脱羧酶kdcA，如记载于W02011/031147的，其通过提述完整并入本文。
[0209]α -氨基辛二酸可转化成7-氨基庚酸，其使用链延伸酶如存在于产甲烷细菌(例如Methanobacterium autotrophicum)中的那些。这类链延伸酶包括但不限于AksA、AksD和AksE或F，如上文论述的。例示性AksA酶包括但不限于EC2.3.3.中的那些。EC2.3.3中的例示性酶包括但不限于EC2.3.13或2.3.3.14。例示性AksD酶包括EC4.2.1.中的那些。EC4.2.1中的例示性酶包括但不限于EC4.2.1.33。例示性AksF酶包括但不限于ECl.1.1.中的酶。ECl.1.1中的例示性酶包括但不限于ECl.1.1.85。而且在此情况下，第四组酶包括脱羧酶。例示性脱羧酶包括EC4.1.1.中的那些。EC4.1.1中的例示性脱羧酶包括但不限于 EC4.1.1.11 ；EC4.1.1.15 ；EC4.1.1.17 ；EC4.1.1.18 ；EC4.1.1.19 ；EC4.1.1.20和 EC4.1.1.86。
[0210]在一个实施方案中，可使α酮庚二酸与一种或多种催化到α羟基庚二酸的酮还原的酶(例如羰基还原酶如ECl.1.1.184)接触，其相应地可使用催化CoA转移的酶(例如上述CoA转移酶)转化成α -羟基庚二酸CoA。α -羟基庚二酸CoA可转化成2_庚烯二酸CoA，其使用催化α -羟基庚二酸-CoA脱水的酶(例如分类在EC4.2.1下的水裂合酶如EC4.2.1.2.EC4.2.1.5 9、EC4.2.1.61)。2-庚烯二酸 CoA 可转化成庚二酸 CoA，其使用催化2-庚烯二酸CoA的烯酸还原的酶。在上文描述了合适的烯酸还原酶。
[0211 ] 在一些实施方案中，本发明提供一种重组宿主细胞，其包含将D，L- 二氨基庚二酸优先转化成庚二酸所需的一种或多种酶。
[0212]1.5.8巴豆酸酯途径
[0213]庚二酰-CoA的来源以及最终的庚二酸的来源是其中起始碳源是巴豆酸酯的生物合成途径。该生物合成途径例示于图9。参见，例如Mouttaki, H.,等,Applied Envtl.Microbiology73:930-938 (2001)。巴豆酸酯分解成乙酰-CoA。已报告图9所示生物合成途径中产生的2/3的乙酰-CoA被转化成乙酸。在一些实施方案中，本发明提供一种重组宿主细胞，其在会将乙酰-CoA转化成乙酸的酶(例如磷酸乙酰转移酶和乙酸激酶)中有缺陷，从而使得乙酰-CoA在图9所示许多代谢步骤中被转化成乙酰乙酰-CoA，然后转化成戊烯二酰-CoA。然后戊烯二酰-CoA被转化成戊二酰-CoA。戊二酰-CoA经过链延伸以形成3-氧庚二酰-CoA。在还原、脱水和第二次还原后，获得庚二酰-CoA。
[0214]在图9所示生物合成途径中，庚二酰-CoA最终被转化成环己烷羧酸。这类生物合成途径已在S.aciditrophicus中观察到。如此，在一些实施方案中，本发明提供一种重组宿主细胞，其中编码会将庚二酰-Cok转化成环己-1-烯-1-羧基-Cok并最终转化成环己烷羧酸的酶被“敲除”，从而使得代谢途径在庚二酰-CoA终止。[0215]1.5.9 萘满(Tetralin)降解途径
[0216]在一些实施方案中，使用来自鞘氨醇单胞菌和棒状杆菌菌种的萘满(苯环己烷)降解途径产生庚二酸半醒。7-氧庚酸作为Sphingomonas macrogolitabid中萘满降解途径的中间物产生。Lopez-Sanchez, A.,等，Appl.Environ.Microbiol.76:110-118 (2010)。萘满通过切割两个芳香环代谢，得到丙酮酸和庚二酸半醛。萘满(一种有机溶剂)是源自萘的复杂起始材料。萘目前自煤焦油产生，但已知用于萘合成的生物合成途径发生在白蚁、真菌和一些植物类型中。Chen, J.等，Nature392:558-559 (1998) ；Daisy, B.H.,等，Microbiologyl48:3737-3741 (2002) jPAzuma，H.，等，Phytochemistry42:999-1004 (1996)。庚二酸半醛可转化成7-氨基庚酸或7-羟基庚酸，如上文论述的。
[0217]1.11来自2-氧庚二酸的六亚甲基二胺
[0218]本发明的一些实施方案还提供一种从2-氧庚二酸产生六亚甲基二胺的方法，包括使用重组的宿主细胞。2-氧庚二酸是产甲烷古细菌中辅酶B生物合成途径中的已知中间物。
[0219]如此，本发明提供包含以下的重组宿主细胞:能将2-氧庚二酸转化成2-氨基庚二酸的酶(例如EC2.6.1.67中的氨基转移酶)、能将2-氨基庚二酸转化成2-氨基-7-氧庚酸的酶(例如ECl.4.1中的还原酶)、能将2-氨基-7-氧庚酸转化成2，7-二氨基庚酸的酶(例如EC2.6.1中的1-氨基转移酶)、能将2，7- 二氨基庚酸转化成六亚甲基二胺的酶(例如EC4.1.1中的脱羧酶)。在一些实施方案中，所述能产生六亚甲基二胺的重组宿主细胞包含任意或所有的这些酶。本发明的实施方案还提供一种产生六亚甲基二胺的方法，其包括使用这些重组宿主细胞。
[0220]在一些实施方案中，本发明提供一种用于从可再生原料如糖、脂肪酸、甘油和合成气产生六亚甲基二胺的方法。在一些实施方案中，能产生六亚甲基二胺的非天然存在的宿主细胞包含将可再生原料转化成六亚甲基二胺所需的任意或所有酶。
[0221]2.2重组宿主细胞
[0222] 本公开特征是重组表达I种或多种(例如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、18种或更多种、19种或更多种、或20种或更多种、或甚至更多种)用于在本文所述的一种途径中产生化合物的酶的重组宿主细胞，以及使用这类宿主细胞来产生二和三官能C7烷的方法。例如，宿主细胞可包含一种或多种(如上文)外源性核酸，其编码一种或多种(如上文)以下酶:催化D，L 二氨基庚二酸或alpha-氨基庚二酸的还原性脱氨基化的酶；催化2-庚烯二酸到庚二酸的烯酸还原的酶；催化庚二酸到庚二酸半醛的羧酸还原的酶，催化庚二酸半醛到7-氨基庚酸的半醛氨基化的酶，催化7-氨基庚酸到庚内酰胺的酰胺水解的酶，催化7-氨基庚酸到7-氨基庚醛的醛脱氢的酶；催化氨基基团到7-氨基庚醛的转移以产生1，7-二氨基庚烷的酶；催化CoA到2-庚烯二酸转移以产生2-庚烯二酸-CoA的酶；催化2-庚烯二酸-CoA到庚二酰-CoA的烯酸还原的酶；催化庚二酰-CoA以产生庚二酸的硫酯水解的酶；催化庚二酸到庚二酸半醛的羧酸还原的酶；催化alpha氨基庚二酸的氨基基团转移以产生alpha酮庚二酸的酶；催化alpha酮庚二酸到alpha羟基庚二酸的羰基还原的酶；催化CoA到alpha羟基庚二酸转移以产生alpha羟基庚二酸CoA的酶；催化alpha羟基庚二酸到2_庚烯二酸的还原的酶；催化alpha酮庚二酸到alpha酮辛二酸的alpha酮酸链延伸的酶,催化氨基基团到alpha酮辛二酸转移以产生alpha-氨基辛二酸酯的酶，催化alpha氨基辛二酸到7_氨基庚酸的alpha酮酸脱羧的酶；催化alpha酮辛二酸的alpha酮酸脱羧以产生庚二酸半醛的脱羧的酶；催化6-氨基_2_庚烯二酸的烯酸还原以产生庚二酸的酶；或催化庚二酰[acp]到庚二酸的硫酯水解的酶。重组宿主细胞可含有由编码一种或多种上文所列酶的一种或多种(如上文)核酸组成的任意亚组。
[0223]使用的宿主细胞通常具有许多特性:它们可容易地进行遗传修饰、对本发明方法中使用的条件耐受、且生长至工业有用的细胞密度。
[0224]任选地，所述宿主细胞可以是单细胞微生物，或可以是细胞系的细胞。宿主细胞可以具有野生基因型。在此情况中，用于催化本发明方法中一个或多个步骤的酶天然存在于宿主细胞中且以在本发明方法中具有工业用途的水平表达。在一个备选方案中，宿主细胞已经过遗传修饰从而以在本发明实施方案的方法中具有工业用途的水平表达酶。所述酶可源自表达其的细胞。在一个备选方案中，所述酶源自不同的菌株或物种的细胞。
[0225]在一个备选方案中，所述宿主细胞是原核生物的。在另一个备选中，其为真核生物的。通常使用单细胞微生物。
[0226]术语原核细胞包括革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌。合适的革兰氏阴性细菌的例子包括:大肠杆菌、沼泽红假单胞菌、鞘氨醇单胞菌、假单胞菌、和属于以下属的其他细菌:棒状杆菌属、沙门氏菌属、伯克霍尔德氏菌属、莫拉氏菌属、产碱杆菌属、嗜冷杆菌属、栖热袍菌属、不动杆菌属、红细菌属、固氮弧菌属和红螺菌属。合适的革兰氏阳性细菌的例子包括链球菌属、乳杆菌属、和属于以下属的其他细菌:诺卡氏菌属、芽孢杆菌属、红球菌属、梭菌属、链霉囷属和节杆囷属。
[0227]真核宿主细胞包括来自酵母和其他真菌的那些细胞，以及例如昆虫、小鼠、大鼠、灵长类或人的细胞。合适的真核宿主细胞的例子包括酵母解脂西洋蓍霉、假丝酵母属如热带假丝酵母、白色假丝酵母、C.cloacae、C.guiIlermondii> C.1ntermedia、麦芽糖假丝酵母、C.parapsilosis、C.zeylenoides、属于以下属的酵母:红酵母属、根霉属、丝孢酵母属和油脂酵母属，以及属于以下属的其他真菌:曲霉属、外瓶霉属、毛霉属、木霉属、枝孢属、平革菌属、Cladophialophora、拟青霉属、Scedosporium 和 Ophiostoma0
[0228]可以以多种不同形式提供宿主细胞。所述细胞可以是静息细胞。即，在培养物中生长细胞并在用作生物催化剂之前从培养基取出。所述细胞可在生长后直接使用，或者可在使用前将其储存。储存的典型方法包括冷冻。在一个备选方案中，所述细胞在使用前冻干。在一个别的备选方案中，所述细胞是生长的细胞。即，细胞在培养时实施其生物催化作用。如果特定生物催化反应的底物不能跨越细胞膜由宿主细胞转化，那么在一个备选方案中，可使用粗裂解物。粗裂解物是在裂解细胞后产生的细胞组分的初始悬液。细胞的裂解可通过任何手段实施，包括化学或机械手段。根据其一般知识和本文中教导，其他裂解方法对于技术人员来说将是明显的。在另一个备选方案中，可使用澄清的裂解物。澄清的裂解物可通过将粗裂解物离心以使未裂解细胞和其他细胞残片形成团粒来制备。
[0229]在一些实施 方案中，提供基本纯的重组宿主细胞培养物。如本文中使用的,重组细胞的“基本纯的培养物”是其中低于约40%(即，低于约:35% ；30% ；25% ；20% ；15%；10% ；5% ；2% ；1% ；0.5% ；0.25% ；0.1% ；0.01% ；0.001% ；0.0001% ;或甚至更低)的培养物中活细胞总数是重组细胞(例如细菌、真菌(包括酵母)、支原体或原生动物细胞)以外的活细胞的细胞培养物。术语“约”在此背景中意指相关百分数可以在所指示百分数之上或之下15%。如此，例如，约20%可以是17%到23%。这类重组细胞的培养物包含细胞和生长、储存或运输培养基。培养基可以是液体、半固体(例如凝胶状介质)或冷冻的。培养物包括液体中或半固体培养基中/上生长或在储存或运输培养基(包括冷冻储存或运输培养基)中储存或运输的细胞。培养物在培养容器或储存容器或基质中(例如培养皿、烧瓶或管或储存小瓶或管)。
[0230]在一个实施方案中，本公开的重组细胞可从发酵工艺收获，其通过常规方法如过滤或离心，并在维持高活性的同时配制成干团粒或干粉末配制物。用于产生展现出本文中公开的一种或多种活性的干粉末全重组细胞组合物的工艺包括喷干、冻干、流化床干燥、真空转鼓干燥或团聚等。所述组合物可以是货架稳定的、干生物催化剂组合物，其适用于本文中描述的生物合成方法。干燥方法如冻干、流化床干燥或采用挤压(extrusion)/球团团粒化(spheronisation pelleting)继之以流化床干燥的方法可尤其有用。这些工艺的温度可为<100°C，但通常<70°C以维持高残余活性和立体选择性。干粉末配制物应具有0-10%w/w，通常2-5%w/w的水含量。可含有稳定化添加剂如盐(例如KCl)、糖、蛋白质等以改进重组细胞在干燥过程期间的热耐受性或改进干燥属性。
[0231]在一些实施方案中，可代替重组宿主或重组或非重组细胞的裂解物，或与其组合来使用部分或完全纯化的酶。完全或部分纯化的酶可以是本文所述任意重组细胞的或非重组细胞的完全或部分纯化的裂解物。纯化方法是本领域中公知的。部分或完全纯化具有的优点在于，感兴趣的酶与可能干扰(通过也与底物反应或通过将中间物或期望产物转化为不想要的化合物)由该酶催化的反应的其他细胞组分分开。纯化确实向任何生物催化剂制备加入了别的步骤，然而且因此并非在所有情况中均为合适的。对使用部分或完全纯化的酶的适宜性的确定将完全在遵循本文教导的技术人员的能力之内。
[0232]在一些实施方案中，本发明方法中的一种或多种转化将由生物催化剂在需氧条件下进行。在一个备选方案中，本发明方法中的一种或多种转化将在厌氧条件下进行。在一个别的备选方案中，本发明方法中的一些步骤将在需氧条件下进行而一些步骤将在厌氧条件下进行。
[0233]2.3全细胞生物催化剂的修饰
[0234]本发明方法中使用的生物催化剂可以是未经修饰的物种宿主细胞，其中天然存在该酶。然而，通常需要遗传修饰宿主细胞以产生非天然存在(即重组或工程化)的宿主细胞。
[0235]2.4宿主细胞基因组的染色体修饰
[0236]在一些实施方案中，已修饰了全细胞生物催化剂(即宿主细胞)的染色体。该修饰可以是染色体中核酸的插入、缺失或取代。对细胞染色体引起修饰的方法是公知的，例如转座子诱变、Cre-Lox介导的重组、lambda Red和RecET介导的重组。
[0237]稳定整合到核酸染色体中是有利的，因为其允许维持核酸而无需可选择标志物。
[0238]通过实施重复插入，可以将许多不同核酸稳定整合到宿主细胞生物催化剂的染色体中。稳定整合意指可将宿主细胞培养超过5代而不失去该改变。一般而言，稳定的遗传改变包括持续超过10代的修饰，特别稳定的修饰将持续超过约25代，且更特别稳定的遗传修饰将超过50代(包括无限期)。
[0239]2.5对宿主细胞生物催化剂基因组的附加体修饰
[0240]在一些实施方案中，修改宿主细胞基因组的附加体组成。附加体意指任何自主复制元件，例如质粒(可为线性或环状)、粘粒、酵母人工染色体(YAC)等。附加体元件经常对其宿主细胞施加代谢负荷，且因此在缺乏确保附加体的至少一个拷贝在细胞分裂后存在于每个子细胞的任何活性划分机制的情况下，需要纳入可选择标志。
[0241]2.6导入的核酸序列
[0242]导入细胞的核酸可包含一种或多种(例如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、18种或更多种、19种或更多种、或20种或更多种、或甚至更多)的许多元件。通常地，这些元件之一编码用于产生双官能或三官能C7烷或这类分子前体的酶。在一些备选方案中，该核酸编码的蛋白质并非是在本发明方法中发挥功能的酶。
[0243]通常而言，启动子可操作地连接于核酸。启动子的选择将取决于意图的应用，且可容易地由技术人员确定。例如，如果酶催化的反应可能对特定宿主细胞有害，那么可以期望使用受调节的或可诱导的启动子，从而使得基因表达可在需要时打开或关闭。或者，可能优选的是使得表达受弱或强构成性启动子驱动以确保该酶在生长的所有阶段均表达。适用于真核细胞系统的例示性启动子包括SV40早期启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、小鼠乳房肿瘤病毒(MMTV)类固醇可诱导的启动子、和Moloney鼠白血病病毒(MMLV)启动子。例示性酵母启动子包括3-磷酸甘油酸酯激酶启动子、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)启动子、半乳糖激酶(GALl)启动子 、半乳糖差向异构酶(galactoepimerase)启动子和醇脱氢酶(ADH)启动子。酵母中的其他合适的启动子是本领域中技术人员已知的。适用于细菌细胞系统的例示性启动子包括但不限于:T7、Τ3、SP6、Iac和trp启动子。
[0244]如果需要确保表达，那么导入的核酸还可以可操作地连接以如需要的包含5’不翻译区(UTR)、3’UTR、增强子和/或终止子区。这类元件将是技术人员已知的。
[0245]2.7多种酶在宿主细胞中的表达
[0246]在一些实施方案中，使用单一菌株的宿主细胞来表达超过一种(例如2种或更多种、3种或更多种、4种或更多种、5种或更多种、6种或更多种、7种或更多种、8种或更多种、9种或更多种、10种或更多种、11种或更多种、12种或更多种、13种或更多种、14种或更多种、15种或更多种、16种或更多种、17种或更多种、18种或更多种、19种或更多种、或20种或更多种、或甚至更多种)用在本发明方法中的酶。在此情况中，所述多种酶可由同一种导入核酸编码。在一个备选方案中，所述酶可编码在分开的导入核酸片段上。酶可均从单个启动子表达(例如通过将酶以操纵子的形式排布)。在一个备选方案中，酶可从多个分开的启动子表达。在一些情况中，可通过相同化学物诱导多个分开的启动子(例如，多种酶中每种可从酵母GAL启动子表达，如此意味着每个基因可用半乳糖诱导)。其他合适的启动子是本领域中已知的。在一个备选方案中，编码本发明方法中使用的酶的每个基因在不同启动子的控制下。如此，可经由不同诱导化合物的使用来分别诱导不同的酶。在另一个备选方案中，使用折中办法，其中许多酶在相同启动子的控制下，而许多酶在不同启动子的控制下。当已在宿主细胞中生成众多酶途径且期望协调途径的其他成员来控制途径的每个成员，但分开控制每个途径时，这一备选方案特别有利。
[0247]可对多种酶是从染色体还是从质粒表达进行其他考虑。在其中从质粒表达酶的情况下，有利地，每种质粒包含不同的起点和/或不同的可选择标志。
[0248]多种酶在单一细胞中表达是有利的，因为如果共表达的酶在反应途径中彼此承接直接作用，这确保上游酶反应的产物立即可受下游酶的作用。这避免了以下需要:(i)中间物的纯化和第二反应容器的设置以实施第二反应；或(ii)将产物从包含上游酶的细胞运输到其可受包含下游酶的细胞作用的培养基中。
[0249]2.8伴侣蛋白系统 [0250]当细胞已工程化为在非自然条件下(例如，当某物种天然的蛋白质以高于自然水平的水平表达或者在一个备选方案中，当来自不同物种的蛋白质在宿主细胞中表达时)表达蛋白质时，在一些情况下该蛋白将不会以活性形式表达。相反它会不正确地折叠并累积为非功能性“包含体”聚集物。在此情况下，用于表达该蛋白质的细胞可进行遗传修饰以进一步表达伴侣蛋白，其能够阻止该蛋白质的错误折叠，或者能够将其从聚集状态重折叠。纳入这类伴侣蛋白是有利的，因为它增加每细胞的活性蛋白质的量，且因此增加本发明方法的总体效率。所表达的伴侣蛋白可以是宿主细胞的伴侣蛋白。在一个备选方案中，伴侣蛋白可来自与该蛋白质相同的物种/菌株。典型的用于表达的伴侣蛋白包括GroEL/GroES家族的成员和DnaJ/DnaK/GrpE家族的成员。原型大肠杆菌GroEL/GroES和DnaJ/DnaK/GrpE蛋白的同源物已在其他原核物种中鉴定出来(参见例如)，且真核同源物也是已知的(GroEL和GroES分别对应于真核蛋白Hsp60和HsplO,而DnaJ、DnaK和GrpE分别对应于真核蛋白HSp70、HSp40和Hsp24)。这些蛋白质已在许多酵母物种(例如酿酒酵母)中鉴定出来。用于与用在本发明方法中的酶共表达的适宜伴侣蛋白的选择对于遵循本文中教导的技术人员来说将是明显的。
[0251]2.9宿主细胞的代谢工程化
[0252]代谢工程化是优化宿主细胞中参数以增加细胞产生化合物能力的过程。任选地，本发明方法中使用的宿主细胞已经过工程化以优化上文论述的双官能C7烷的输出。
[0253]增加细胞产生一种化合物能力的代谢工程化主要经由两种方法进行。第一种是优化途径中从起始材料产生期望产物的酶。在导致双官能C7烷产生的多酶途径中(如附图所示和前面部分所述的)，可以使用技术人员已知的技术(例如，二维电泳、使用同位素标记的前体、和核磁共振(NMR)光谱学)来测定途径中每种中间物的浓度，并因此确定哪个酶转化是限速步骤，即反应方案中的哪个步骤最慢。这可以通过观察中间物的积累来确定，中间物的积累指示作用于此中间物的酶在限制转化的总体速率。在此情况中，因而应增加该中间物反应的速率。这可通过多种手段进行。首先，可提高限制性酶的表达水平。任选地，这可以通过将编码该酶的基因置于强启动子，例如T7启动子(如果该酶在大肠杆菌中表达)或TEF启动子(如果该酶在酵母中表达)的控制下来实现。第二种选择是提高编码存在于细胞的该酶的基因的拷贝数，例如通过将该基因置于多拷贝质粒上，或通过将基因的多拷贝纳入宿主细胞的染色体中(这些拷贝可掺入染色体的同一位置或在染色体的不同位置)。
[0254]提高双官能C7烷的产生(如附图中显示和前述部分描述的)还可以通过使得任一种能将底物、任意中间物或产物转向到并非本方法目标的代谢途径中的酶的活性失活或降低。因此，可降低酶活性以增加双官能C7烷的产率。如此，在一些实施方案中，本文中公开的重组宿主细胞可在能将本发明方法的起始材料或在产生双官能C7烷的反应途径中产生的任意中间物转向成不同的、不想要的终产物的一种或多种酶中具有缺陷(例如通过缺失编码感兴趣酶的核酸或降低核酸的表达)。在一个备选方案中，所述酶未缺失，而是改变为使其以低于野生型酶的速率作用于底物、中间物或产物。在其中酶催化可逆反应的情况中，所述酶应改变为使其仅以期望的反应方向作用。
[0255]例如，在一些实施方案中，重组宿主细胞可在能将庚二酰_[acp]转化成7-酮-8-氨基壬酸(KAPA)或将6-羧基己酰基-CoA (庚二酰-CoA)转化成KAPA的酶中具有缺陷(例如BioF的缺失或失活，该基因编码7-酮-8-氨基壬酸合成酶(E.C.2.3.1.47))。
[0256]在一些实施方案中，重组宿主细胞可在二氨基庚二酸脱羧酶中具有缺陷，其创建赖氨酸营养缺陷型。赖氨酸营养缺陷型对于D, L 二氨基庚二酸(赖氨酸的中间前体)的碳通量的去调节可尤其有用。赖氨酸营养缺陷型将需要补料分批发酵。
[0257]2.10生长全细胞生物催化剂
[0258]在本发明的一些实施方案中，使用在实施本发明方法中转化时生长(即分裂)的宿主细胞。在这些实施方案中，所述细胞在优化期望双官能C7烷产生的条件下培养。可培养本文中所述的任一种重组宿主细胞以产生和/或分泌本发明的生物合成产物。如本文中使用的，术语培养等同于发酵罐和生物反应器。
[0259]2.10.1 培养基 [0260]在一些情况中，用于生长的碳源将以营养液，例如Luria培养基或酵母提取培养基的形式提供。在其他情况中，可使用适于宿主细胞生长的限定培养基(即，其中每种组分浓度已知的培养基)。在一个备选方案中，生长培养基包含葡萄糖作为碳源。在另一个备选方案中，宿主细胞使用的培养基中的碳源是葡萄糖、蔗糖、木糖、脂肪酸和甘油。
[0261]2.10.2多种菌株在相同培养物中的生长
[0262]在一些实施方案中，催化本发明方法中转化的酶存在于超过一种菌株/物种的细胞中，其中同时使用那些超过一种菌株/物种的细胞。在其中当实施本发明方法中的转化时多种菌株/物种在生长的情况中(即细胞在共培养)，选择的菌株/物种必须选择为使得一种菌株不与其他菌株竞争。这类关系可通过向共培养物引入人工共生获得。即，使用的两种菌株/物种对于必要但是不同的养分各自为营养缺陷的。此外，其他菌株应工程化为产生过量的该养分，从而使得两种菌株在培养物的生长培养基不包含这两种必要养分时能在培养物中一起存活。适宜的营养缺陷体的选择将完全在遵循本文教导的技术人员的能力以内。
[0263]2.10.3 发酵
[0264]本文所述培养条件可以扩大规模并连续生长用于制备庚烷-1，7- 二元酸、7-氧庚酸、7-羟基庚酸、7-羟基庚醛、7-氨基庚酸、七亚甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚内酰胺。例示性的生长规程包括，例如补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离，或连续发酵和连续分离。所有这些工艺均为本领域中公知的。发酵规程对于商业量的二和三官能C7烷的生物合成产生尤其有用。一般地且如同非连续培养规程地，前文描述的庚烷-1，7- 二元酸、7-氧庚酸、7-羟基庚酸、7-羟基庚醛、7-氨基庚酸、七亚甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚内酰胺的连续和/或接近连续产生包括在充足的养分和培养基存在下培养产生本文所述庚烷-1，7-二元酸、7-氧庚酸、7-羟基庚酸、7-羟基庚醛、7-氨基庚酸、七亚甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚内酰胺的重组宿主细胞以维持和/或近乎维持指数期生长。在这类条件下的连续培养可包括例如，I天、2、3、4、5、6或7天或更长。另外，连续培养可包括I周、2、3、4或5周或更长并长达数个月。或者，如果适合特定应用的话，重组细胞可培养数小时。应理解连续和/或接近连续培养条件还可包括在这些例示性时段之间的所有时间间期。还理解培养本发明宿主细胞的时间是用于产生针对期望目的充足量的产物的充足时间段。
[0265]发酵规程是本领域中公知的。简言之，用于生物合成产生前文所述庚烷-1，7- 二元酸、7-氧庚酸、7-羟基庚酸、7-羟基庚醛、7-氨基庚酸、七亚甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚内酰胺的发酵可以例如，补料分批发酵和分批分离；补料分批发酵和连续分离，或连续分离和连续发酵利用。分批和连续发酵规程的例子是本领域中公知的。
[0266]除了上文使用本文所述庚烷-1，7- 二元酸、7-氧庚酸、7-羟基庚酸、7_羟基庚醛、7-氨基庚酸、七亚甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚内酰胺生产者来连续生产大量这些的发酵规程以外，庚烷-1，7-二元酸、7-氧庚酸、7-羟基庚酸、7-羟基庚醛、7-氨基庚酸、七亚甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇或庚内酰胺生产者还可以例如，同时进行别的规程以将产物转化成其他化合物，或使产物可与发酵培养物分开并序贯进行化学或生物催化转化以如期望的将产物转化成其他化合物。
[0267]2.11本发明的组合物
[0268]本发明还提供包含依照本发明的重组宿主细胞以及庚烷-1，7- 二元酸、7-氧庚酸、7-羟基庚酸、7-羟基庚醛、7-氨基庚酸、七亚甲基二胺、1，7-庚二醇、7-氨基庚醛、7-氨基庚醇和庚内酰胺的组合物。本发明还提供包含依照本发明的重组宿主细胞和原料的组合物。在一些实施方案中，所述原料是可再生原料，例如其中所述原料选自下组:葡萄糖、蔗糖、木糖、脂肪酸和甘油。在一些实施方案中，所述原料是多芳香烃，例如苯、甲苯或莽草酸。
[0269]3.1实施例
[0270] 在一般性描述本发明后，通过对以下实施例的提述将会更容易地理解本发明，其通过例示提供且不意图为限制的。理解可对本文中公开的例示性实施方案进行各种修改和变化，而不背离本发明的精神和范围。
[0271]3.1.1通过氨裂合酶(EC4.3.1.-)的2，6_ 二氨基庚二酸酯到2_氨基_5，6_脱氢庚二酸(6-氨基-2-庚烯二元酸)和2-氨基庚二酸到2-庚烯二元酸的转化(见图10)
[0272]3.1.1.1诜择MAL酶某闵靶物
[0273]在鉴定了涉及2，6- 二氨基庚二酸到庚二酸(其用于产生尼龙7，7)的转化和庚二酸到7-氨基庚酸的转化的途径后，选择来自这些途径的基因靶物。具体地，选择来自包括甲基天冬氨酸氨裂合酶(MAL ;EC4.3.1.2)在内的氨裂合酶家族(EC4.3.1)的酶靶物，该选择基于其广泛底物特异性、在大范围宿主中的存在、被克隆和外源表达的能力和用于合理设计蛋白质工程的可获晶体结构。选择来自无丙二酸柠檬酸杆菌(Citrobacteramalonaticus)、假破伤风梭菌(Clostridiumtetanomorphum)和米曲霉的MAL基因。由无丙二酸柠檬酸杆菌(GeneBank AB005294 ;片段 1641-2882878596..879060NM_NM)和假破伤风梭菌(GeneBank S48141 ;片段756-1997)编码的MAL酶具有显著的相异性(57%同一性)。米曲霉MAL基因(GeneBank XMOO1827609)是进化趋异的(与无丙二酸柠檬酸杆菌MAL44%同一性，与假破伤风梭菌MAL39%同一性)，其可显示不同的催化特性和/或选择性。另一种不寻常的氨裂合酶(其为用于2，6-二氨基庚二酸酯和2-氨基庚二酸的还原性脱氨基化的潜在酶的)是来自突光假单胞菌(Pseudomonas fIuorescens)的D-葡糖氨酸氨裂合酶(EC4.3.1.9)(登录号BAD69624)。这是一种催化α，β -消除的不寻常的氨裂合酶:
[0274]D-葡糖氨酸一 >2-脱氢-3-脱氧-D-葡糖酸+NH3
[0275]
【权利要求】
1.一种转化化合物的方法，所述方法包括使选自2，6 二氨基庚二酸盐(2，6DAP)和α -氨基-庚二酸盐(AAP)的化合物与催化2，6DAP到6_氨基-2-庚烯二酸(6Α2ΗΑ)的还原性脱氨基化或AAP到2-庚烯二酸(2HDA)的还原性脱氨基化的酶接触，其中产生6Α2ΗΑ或 2HDA。
2.权利要求1的方法，其中所述化合物是2，6DAP。
3.权利要求2的方法，其还包括使所述6Α2ΗΑ与催化6Α2ΗΑ到AAP的烯酸还原的酶接触，其中产生ΑΑΡ。
4.权利要求3的方法，其还包括使所述AAP与催化AAP到2HDA的还原性脱氨基化的酶接触，其中产生2HDA。
5.权利要求4的方法，其还包括使所述2HDA与催化2HDA到庚二酸(PA)的烯酸还原的酶接触，其中产生PA。
6.权利要求5的方法，其还包括使所述PA与催化PA到庚二酸半醛(PAS)的羧酸还原的酶接触，其中产生PAS。
7.权利要求6的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7-氨基-庚酸(7ΑΗΑ)的半醛氨基化的酶接触，其中产生7ΑΗΑ。
8.权利要求7的方法，其还包括使所述7ΑΗΑ与催化7ΑΗΑ到庚内酰胺(ENTL)的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
9.权利要求7的方 法，其还包括使所述7ΑΗΑ与催化7ΑΗΑ到7-氨基-庚醛(7ΑΗΤ)的醛脱氢的酶接触，其中产生AHT。
10.权利要求9的方法，其还包括使所述7ΑΗΤ与催化氨基基团到7ΑΗΤ的转移以产生1，7- 二氨基庚烷(1，7DAH)的酶接触，其中产生1，7DAH。
11.权利要求4的方法，其还包括使所述2HDA与催化辅酶A(CoA)到2HAD的转移以产生2-庚烯二酸-CoA (2HDA-CoA)的酶接触，其中产生2HDA_CoA。
12.权利要求11的方法，其还包括使所述2HDA-CoA与催化2HDA_CoA到庚二酰-CoA(PCoA)的烯酸还原的酶接触，其中产生PCoA。
13.权利要求12的方法，其还包括使所述PCoA与催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接触，其中产生PA。
14.权利要求13的方法，其还包括使所述PA与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，其中产生PAS。
15.权利要求14的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，其中产生7AHA。
16.权利要求15的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
17.权利要求15的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，其中产生7AHT。
18.权利要求17的方法，其还包括使所述7AHT与催化氨基基团到7AHT的转移以产生I, 7DAH的酶接触，其中产生1，7DAH。
19.权利要求4的方法，其还包括使所述AAP与催化氨基基团到AAP的转移以产生α-酮-庚二酸盐(AKP)的酶接触，其中产生ΑΚΡ。
20.权利要求19的方法，其还包括使所述AKP与催化AKP到α-羟基-庚二酸盐(AHP)的酮还原的一种或多种酶接触，其中产生ΑΗΡ。
21.权利要求20的方法，其还包括使所述AHP与催化CoA到AHP的转移以产生α-羟基-庚二酸盐(AHP-CoA)的酶接触，其中产生AHP-CoA。
22.权利要求21的方法，其还包括使所述AHP-CoA与催化AHP-CoA到2HDA_CoA的脱水的酶接触，其中产生2HDA-CoA。
23.权利要求22的方法，其还包括使所述2HDA-CoA与催化2HDA_CoA到PCoA的烯酸还原的酶接触，其中产生PCoA。
24.权利要求23的方法，其还包括使所述PCoA与催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接触，其中产生PA。
25.权利要求24的方法，其还包括使所述PA与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，其中产生PAS。
26.权利要求25的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，其中产生7AHA。
27.权利要求26的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
28.权利要求26的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，其中产生7AHT。
29.权利要求28的方法，其还包括使所述7AHT与催化氨基基团到7AHT的转移以产生I, 7DAH的酶接触，其中产生1，7DAH。
30.权利要求20的方法，其还包括使所述AHP与催化AHP到2HDA的脱水的酶接触，其中产生2HDA。
31.权利要求30的方法，其还包括使所述2HDA与催化2HDA到庚二酸(PA)的烯酸还原的酶接触，其中产生PA。
32.权利要求31的方法，其还包括使所述PA与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，其中产生PAS。
33.权利要求32的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，其中产生7AHA。
34.权利要求33的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
35.权利要求33的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，其中产生7AHT。
36.权利要求35的方法，其还包括使所述7AHT与催化氨基基团到7AHT的转移以产生I, 7DAH的酶接触，其中产生1，7DAH。
37.权利要求30的方法，其还包括使所述2HDA与催化CoA到2HAD的转移以产生2HDA-CoA的酶接触，其中产生2HDA-CoA。
38.权利要求37的方法，其还包括使所述2HDA-CoA与催化2HDA_CoA到PCoA的烯酸还原的酶接触，其中产生PCoA。
39.权利要求38的方法，其还包括使所述PCoA与催化PCoA到PA的硫酯水解的酶接触，其中产生PA。
40.权利要求39的方法，其还包括使所述PA与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，其中产生PAS。
41.权利要求40的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，其中产生7AHA。
42.权利要求41的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
43.权利要求41的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，其中产生7AHT。
44.权利 要求43的方法，其还包括使所述7AHT与催化氨基基团到7AHT的转移以产生I, 7DAH的酶接触，其中产生1，7DAH。
45.权利要求19的方法，其还包括使所述AKP与催化AKP到α-酮-辛二酸盐(AKS)的α-酮酸链延伸的酶接触，其中产生AKS。
46.权利要求45的方法，其还包括使所述AKS与催化氨基基团到AKS的转移以产生α-氨基辛二酸盐(AAS)的酶接触，其中产生AAS。
47.权利要求46的方法，其还包括使所述AAS与催化AAS到7ΑΗΑ的α-酮酸脱羧化的酶接触，其中产生7ΑΗΑ。
48.权利要求47的方法，其还包括使所述7ΑΗΑ与催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
49.权利要求47的方法，其还包括使所述7ΑΗΑ与催化7ΑΗΑ到7ΑΗΤ的醛脱氢的酶接触，其中产生7ΑΗΤ。
50.权利要求49的方法，其还包括使所述7ΑΗΤ与催化氨基基团到7ΑΗΤ的转移以产生I, 7DAH的酶接触，其中产生1，7DAH。
51.权利要求45的方法，其还包括使所述AKS与催化AKS到PAS的α-酮酸脱羧化的酶接触，其中产生PAS。
52.权利要求51的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接触，其中产生7ΑΗΑ。
53.权利要求52的方法，其还包括使所述7ΑΗΑ与催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
54.权利要求52的方法，其还包括使所述7ΑΗΑ与催化7ΑΗΑ到7ΑΗΤ的醛脱氢的酶接触，其中产生7ΑΗΤ。
55.权利要求54的方法，其还包括使所述7ΑΗΤ与催化氨基基团到7ΑΗΤ的转移以产生I, 7DAH的酶接触，其中产生1，7DAH。
56.权利要求23的方法，其还包括使所述PCoA与催化PCoA到PAS的还原的酶接触，其中产生PAS。
57.权利要求56的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接触，其中产生7ΑΗΑ。
58.权利要求57的方法，其还包括使所述7ΑΗΑ与催化7ΑΗΑ到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
59.权利要求57的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，其中产生7AHT。
60.权利要求59的方法，其还包括使所述7AHT与催化氨基基团到7AHT的转移以产生I, 7DAH的酶接触，其中产生1，7DAH。
61.权利要求38的方法，其还包括使所述PCoA与催化PCoA到PAS的还原的酶接触，其中产生PAS。
62.权利要求61的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，其中产生7AHA。
63.权利要求62的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
64.权利要求62的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，其中产生7AHT。
65.权利要求64的方法，其还包括使所述7AHT与催化氨基基团到7AHT的转移以产生I,7DAH的酶接触，其中产生1，7DAH。
66.一种转化化合物的方法，所述方法包括使选自6A2HA和2HDA的化合物与催化6A2HA到AAP的烯酸还原或2HDA到PA的烯酸还原的酶接触，其中产生AAP或PA。
67.一种转化化合物的方法，所述方法包括使选自PCoA和庚二酰[acp] (PACP)的化合物与催化PCoA或PACP到PA的硫酯酶水解的酶接触，其中产生PA。
68.权利要求67的方法，其还包括使所述PA与催化PA到PAS的羧酸还原的酶接触，其中产生PAS。
69.权利要求68的方法，其还包括使所述PAS与催化PAS到7AHA的半醛氨基化的酶接触，其中产生7AHA。
70.权利要求69的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到ENTL的酰胺水解的酶接触，其中产生ENTL。
71.权利要求69的方法，其还包括使所述7AHA与催化7AHA到7AHT的醛脱氢的酶接触，其中产生7AHT。
72.权利要求71的方法，其还包括使所述7AHT与催化氨基基团到7AHT的转移以产生I,7DAH的酶接触，其中产生1，7DAH。
73.一种转化化合物的方法，所述方法包括使AKP与催化AKP到AHP的酮还原的一种或多种酶接触，其中产生ΑΗΡ。
74.权利要求73的方法，其中所述AKP通过α-酮己二酸或α-酮戊二酸的链延伸产生。
75.权利要求73的方法，其进一步包括AHP到PA或到PcoA的转化。
76.一种转化化合物的方法，所述方法包括通过α-酮酸链延伸将AKP转化为AKS。
77.权利要求76的方法，其中所述AKP通过α-酮己二酸或α-酮戊二酸的链延伸产生。
78.一种转化化合物的方法，所述方法包括使所述PAS与催化PAS到7ΑΗΑ的半醛氨基化的酶接触，其中产生7AM。
79.权利要求78的方法，其中通过从2，6DAP、AKG、PCoA或PACP的转化获得所述PAS。
80.一种转化化合物的方法，所述方法包括使选自PCoA和PACP的化合物与催化该化合物到PAS还原的酶接触，其中产生PAS。
81.一种转化化合物的方法，所述方法包括使PAS与催化PAS到7-羟基-庚酸(7HHA)的醇脱氢的酶接触，其中产生7HHA。
82.权利要求1-81中任一项的方法，其中所述酶、或一种或多种酶是纯化的酶。
83.权利要求1-81中任一项的方法，其中所述酶、或一种或多种酶在细胞裂解物或部分纯化的细胞裂解物中。
84.权利要求1-81中任一项的方法，其中所述酶、或一种或多种酶在重组表达其的细胞中。
85.权利要求1或2的方法，其中所述酶包含氨裂合酶。
86.权利要求85的方法，其中所述氨裂合酶是EC4.3.1中的氨裂合酶。
87.权利要求86的方法，其中所述EC4.3.1中的氨裂合酶包括EC4.3.1.1 ；EC4.3.1.2 ；EC4.3.1.3 ；EC4.3.1.12 ；EC4.3.1.13 ;或 EC4.3.1.24。
88.权利要求3、5、12、23、31、38和66中任一项的方法，其中所述酶包括烯酸还原酶。
89.权利要求88的方法，其中所述烯酸还原酶包括ECl.3.1中的烯酸还原酶。
90.权利要求89 的方法，其中所述ECl.3.1中的烯酸还原酶包括ECl.3.1.31。
91.权利要求6、14、25、32、40和68中任一项的方法，其中所述酶包括羧酸还原酶。
92.权利要求91的方法，其中所述羧酸还原酶包括ECl.2.99中的羧酸还原酶。
93.权利要求92的方法，其中所述ECl.2.99中的羧酸还原酶包括ECl.2.99.6。
94.权利要求7、15、26、33、52、57、62、69和78中任一项的方法，其中所述酶包括ω转氨酶。
95.权利要求94的方法，其中所述ω转氨酶包括EC2.6.1中的转氨酶。
96.权利要求95的方法，其中所述EC2.6.1中的ω转氨酶包括EC2.6.1.18 ；EC2.6.1.19 ；EC2.6.1.2 ；EC2.6.1.7 ；EC2.6.1.29 ；EC2.6.1.36 ；EC2.6.1.39 ；EC2.6.1.42 ；或 EC2.6.1.68。
97.权利要求13、24、39、56、61和67中任一项的方法，其中所述酶包含硫酯酶、酸-硫醇连接酶或CoA转移酶。
98.权利要求97的方法，其中所述硫酯酶包含EC3.1.2中的硫酯酶。
99.权利要求98的方法，其中所述EC3.1.2中的硫酯酶包括EC3.1.2.18 ；EC3.1.2.19 ；或 EC3.1.2.20。
100.权利要求97的方法，其中所述酸-硫醇连接酶包括EC6.2.1中的酸-硫醇连接酶。
101.权利要求100的方法，其中所述EC6.2.1中的酸-硫醇连接酶包括EC6.2.1.3 ；EC6.2.1.14 jEC6.2.1.23。
102.权利要求97的方法，其中所述CoA转移酶包括EC2.8.3中的CoA转移酶。
103.权利要求102的方法，其中所述EC2.8.3中的CoA转移酶包括EC2.8.3.12或EC2.8.3.13。
104.权利要求10、18、19、29、36、44、46、50、60、65和72中任一项的方法，其中所述酶包括氨基转移酶。
105.权利要求104的方法，其中所述氨基转移酶包含EC2.6.1中的氨基转移酶。
106.权利要求105的方法，其中所述EC2.6.1中的氨基转移酶包括EC2.6.1.67。
107.权利要求20或73的方法，其中所述一种或多种酶包括羰基还原酶。
108.权利要求107的方法，其中所述羰基还原酶包括EC.1.1.1.184。
109.权利要求47或51的方法，其中所述酶包括α-酮酸脱羧酶。
110.权利要求56、61、或80的方法，其中所述酶包括脂肪-酰基-CoA还原酶。
111.权利要求110的方法，其中所述脂肪-酰基-CoA还原酶是ECl.2.1中的还原酶。
112.权利要求111的方法，其中所述ECl.2.1中的脂肪-酰基-CoA包括ECl.2.1.50。
113.权利要求9、15、28、35、43、49、55、59、64和71中任一项的方法，其中所述酶包括醛脱氢酶。
114.权利要求113的方法，其中所述醛脱氢酶包括ECl.2.1中的醛脱氢酶。
115.权利要求114的方法，其中所述ECl.2.1中的醛脱氢酶包括ECl.2.1.4或ECl.2.1.63。
116.权利要求11、21和37中任一项的方法，其中所述酶包括CoA转移酶。
117.权利要求116的方法，其中所述CoA转移酶包括EC2.8.3中的CoA转移酶。
118.权利要求117的方法，其中所述EC2.8.3中的CoA转移酶包括EC2.8.3.12或EC2.8.3.13。
119.权利要求8、16、27、34、42、48、53、58、63和70中任一项的方法，其中所述酶是酰胺水解酶。
120.权利要求22或30的方法，其中所述酶包括水裂合酶。
121.权利要求120的方法，其中所述水裂合酶包括EC4.2.1中的水裂合酶。
122.权利要求121的方法，其中所述EC4.2.1中的水裂合酶包括EC4.2.1.2 ；EC4.2.1.59 ；4.2.1.61 ；4.1.2.17 或 4.1.2.18。
123.权利要求45、74、76和77中任一项的方法，其中所述α-酮酸链延伸由包含以下的酶组中的一种或多种催化:AksA、AksD, AksE和AksF。
124.权利要求123的方法，其中所述AksA包括EC2.3.3中的AksA酶。
125.权利要求124的方法，其中所述EC2.3.3中的AksA酶包括EC2.3.3.13或2.3.3.14。
126.权利要求123的方法，其中所述AksD包括EC4.2.1中的AksD酶。
127.权利要求126的方法，其中所述EC4.2.1中的AksD酶包括EC4.2.1.33。
128.权利要求123的方法，其中所述AksF包括ECl.1.1中的AksF酶。
129.权利要求128的方法，其中所述ECl.1.1.中的AksF酶包括ECl.1.1.85。
130.权利要求45、74、76和77中任一项的方法，其中所述一种或多种ct-酮酸链延伸酶来自产甲烷的细菌。
131.权利要求81的方法，其中所述酶包括醇脱氢酶。
132.权利要求131的方法，其中所述醇脱氢酶包括EC.1.1.1.1或ECl.1.1.2。
133.权利要求131的方法,其中所述醇脱氢酶选自来自运动发酵单胞菌(Zymomonasmobilis)的adhA、来自运动发酵单胞菌的adhB、来自丙酮丁醇梭菌(Clostridiumacetobutylicum)的丁醇脱氧酶、酵母属(Saccharomyces) ADHIV、和来自酿酒酵母(S.cerevisiae)的 ADH6。
134.权利要求67或80的方法，其中所述PCoA或PACP源自乙酰-CoA或苯甲酰-CoA。
135.权利要求134的方法，其中所述乙酰-CoA源自可再生原料，包括纤维素原料、糖、甘油或脂肪酸。
136.权利要求134的方法，其中所述乙酰-CoA源自合成气(SynGas)、甲烷或甲醇。
137.权利要求134的方法，其中所述苯甲酰-CoA源自多环芳香烃。
138.权利要求1、2和79中任一项的方法，其中所述2，6DAP由缺少二氨基庚二酸脱羧酶的产赖氨酸生物体产生。
139.权利要求1、2、79和138中任一项的方法，其中所述2，6DAP源自可再生原料。
140.权利要求139的方法，其中所述可再生原料包括糖。
141.一种生物衍生的尼龙_7、尼龙-7，X或尼龙-X, 7。
142.由包括聚合7AHA的工艺产生的尼龙_7，其中所述7AHA源自PAS或AAS。
143.由包括聚合PA和1，7DHA的工艺产生的尼龙_7，7，其中所述PA源自PCoA；PACP ；或 2HDA 而 1，7DHA 源自 7AHA。
144.由包括聚合7AHA 的工艺产生的尼龙_7，其中7AHA由包括以下方法步骤的方法制备: ⑴权利要求2-7 ； (ii)权利要求2-4和11-15； (iii)权利要求2-4和19-26； (iv)权利要求2-4、19-20 和 30-33 ；
(V)权利要求 2-4、19-20、30 和 37-41 ； (vi)权利要求2-4、19 和 45-47 ；
(vii)权利要求2-4、19、45 和 51-52 ;
(viii)权利要求2-4、19-23 和 56-57 ；
(ix)权利要求2-4、19-20、30、37-38 和 61-62 ； (X)权利要求67-69 ； (xi)权利要求73-75； (xii)权利要求76-77； (xiii)权利要求78-79;或 (xiv)权利要求80。
145.由包括聚合1，7DHA和PA的工艺产生的尼龙7，7，其中1，7DHA由包括以下方法步骤的方法制备: (a)权利要求2-7和9-10; (b)权利要求2-4、11-15 和 17-18 ； (c)权利要求2-4、19-26 和 28-29 ；
(d)权利要求2-4、19-20、30-33 和 35-36 ；
(e)权利要求2-4、19-20、37-41 和 43-44 ；
(f)权利要求2-4、19、45-47 和 49-50 ；
(g)权利要求2-4、19、45、51-52 和 54-55 ；(h)权利要求2-4、19-23 和 56-60 ；
(i)权利要求2-4、19-20、37-38 和 61-65 ； (j)权利要求67-69和71-72 ； (k)权利要求73-75 ； (I)权利要求76-77 ； (m)权利要求78-79 ;或 (η)权利要求80，且 其中PA由包括以下方法步骤的方法制备: (ο)权利要求2-5 ； (P)权利要求2-4和11-13 ； (q)权利要求2-4和19-24 ； (r)权利要求 2-4、19-20 和 30-31 ；
(s)权利要求 2-4、19-20、30 和 37-39 ；
(t)权利要求67 ;或 (U)权利要求73-75。
146.一种基本纯的宿主细胞培养物，其实质数目包含一种或多种编码涉及选自7AHA;PA ;1，7DAH ；ENTL ;和7HHA的一种或多种聚合物单体的生物合成的一种或多种酶的外源核酸，其中所述酶选自下组:酰基-CoA还原酶、酰基[acp]还原酶、硫酯水解酶、氨裂合酶、烯酸还原酶、氨基转移酶、CoA转移酶、硫酯酯酶(thioestesterase)、酸-硫醇连接酶、水裂合酶、羰基还原酶、硫酯酶、羧酸还原酶、脂肪-酰基CoA还原酶、ω -转氨酶、α -酮酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶、和催化α-酮酸链延伸的酶。
147.权利要求146的培养物，其中所述细胞是原核细胞。
148.权利要求147的培养物,其中所述原核细胞选自下组:大肠杆菌(Escherichiacoli)、沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)、鞘氨醇单胞菌(sphingomonads)、产甲烧的细菌(例如Methanobacterium autotrophicum)、棒状杆菌属(Corynebacterium)、沙门氏菌属(Salmonella)、伯克霍尔德氏菌属(Burkholderia)、莫拉氏菌属(Moraxella)、产喊杆菌属(Alcaligenes)、嗜冷杆菌属(Psychrobacter)、栖热袍菌属(Thermotoga)、不动杆菌属(Acinetobacteria)、红细菌属(Rhodobacter)、固氮弧菌属(Azoarcus)、红螺菌属(Rhodospirillum)、短杆菌属(Brevibacterium)、链球菌属(Streptococci)、乳杆菌属(Lactobacilli)、诺卡氏菌属(Nocardia)、芽抱杆菌属(Bacillus)、红球菌属(Rhodococcus)、梭菌属(Clostridium)、链霉菌属(Streptomyces)、和节杆菌属(Arthobacter)。
149.权利要求146的培养物，其中所述细胞是真核细胞。
150.权利要求149的培养物，其中所述真核细胞是真菌细胞。
151.权利要求150的培养物，其中所述真菌细胞是酵母细胞。
152.权利要求151的培养物，其中所述酵母细胞是选自以下组的酵母的细胞:解脂西洋蓄霉(Yarrowia Iipolytica)、假丝酵母属(Candida)、红酵母属(Rhodotorula)、根霉属(Rhizopus)、酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、丝孢酵母属(Trichosporon)、伊萨酵母属(Issatchenka)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、德巴利酵母属(Debaryomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)、许旺酵母属(Schwanniomyces)和油脂酵母属(Lipomyces)。
153.权利要求152的培养物，其中所述假丝酵母细胞是选自下组的酵母的细胞:热带假丝酵母(C.tropicalis)、白色假丝酵母(C.albicans)、C.cloacae、C.guiIlermondi1、C.1ntermedia、麦芽糖假丝酵母(C.maltosa)、C.parapsilosis 和 C.Zeylenoides0
154.权利要求150的培养物，其中所述真菌细胞是选自下组的真菌的细胞:曲霉属(Aspergillus)、外瓶霉属(Exophiala)、毛霉属(Mucor)、木霉属(Trichoderma)、枝抱属(Cladosporium)、平革菌属(Phanerochaete)、Cladophialophora、拟青霉属(Paecilomyces)、Scedosporium 和 Ophiostoma0
155.权利要求146的培养物，其中所述氨裂合酶包括EC4.3.1中的氨裂合酶。
156.权利要求155的培养物，其中所述EC4.3.1中的氨裂合酶包括EC4.3.1.1 ；EC4.3.1.2 ；EC4.3.1.3 ；EC4.3.1.12 ；EC4.3.1.13 ;或 EC4.3.1.24。
157.权利要求146的培养物，其中所述烯酸还原酶包括ECl.3.1中的烯酸还原酶。
158.权利要求157的培养物，其中所述ECl.3.1中的烯酸还原酶包括ECl.3.1.31。
159.权利要求146的培养物，其中所述羧酸还原酶包括ECl.2.99中的羧酸还原酶。
160.权利要求159的培养物，其中所述ECl.2.99中的羧酸还原酶包括ECl.2.99.6。
161.权利要求160的培养物，其中所述ω-转氨酶包括EC2.6.1中的转氨酶。
162.权利要求161的培养物，其中所述EC2.6.1中的ω -转氨酶包括EC2.6.1.18 ；EC2.6.1.19 ；EC2.6.1.2 ；EC2.6.1.7 ；EC2.6.1.29 ；EC2.6.1.36 ；EC2.6.1.39 ；EC2.6.1.42 ；或 EC2.6.1.68。
163.权利要求146的培养物，其中所述硫酯酶包括EC3.1.2中的硫酯酶。
164.权利要求163的培养物，其中所述EC3.1.2中的硫酯酶包括EC3.1.2.18 ；EC3.1.2.19 jEC3.1.2.20。
165.权利要求146的培养物，其中所述酸-硫醇连接酶包括EC6.2.1中的酸-硫醇连接酶。
166.权利要求165的培养物，其中所述EC6.2.1中的酸-硫醇连接酶包括EC6.2.1.3 ；EC6.2.1.14 ^EC6.2.1.23。
167.权利要求146的培养物，其中所述CoA转移酶包括EC2.8.3中的CoA转移酶。
168.权利要求167的培养物，其中所述EC2.8.3中的CoA转移酶包括EC2.8.3.12或EC2.8.3.13。
169.权利要求146的培养物，其中所述氨基转移酶包括EC2.6.1中的氨基转移酶。
170.权利要求169的培养物，其中所述EC2.6.1中的氨基转移酶包括EC2.6.1.67。
171.权利要求146的培养物，其中所述羰基还原酶包括EC.1.1.1.184。
172. 权利要求146的培养物，其中所述脂肪-酰基-CoA还原酶包括ECl.2.1中的还原酶。
173.权利要求172的培养物，其中所述ECl.2.1中的脂肪-酰基-CoA包括ECl.2.1.50。
174.权利要求146的培养物，其中所述醛脱氢酶包括ECl.2.1中的醛脱氢酶。
175.权利要求174的培养物，其中所述ECl.2.1中的醛脱氢酶包括ECl.2.1.4或ECl.2.1.63。
176.权利要求146的培养物，其中所述水裂合酶包括EC4.2.1中的水裂合酶。
177.权利要求176的培养物，其中所述EC4.2.1中的水裂合酶包括EC4.2.1.2 ;EC4.2.1.59 ；4.2.1.61 ；4.1.2.17 或 4.1.2.18。
178.权利要求146的培养物，其中所述催化α-酮酸链延伸的酶包括选自包含以下的酶组中的一种或多种酶:AksA、AksD, AksE和AksF酶。
179.权利要求178的培养物，其中所述AksA包括EC2.3.3中的AksA酶。
180.权利要求179的培养物，其中所述EC2.3.3中的AksA酶包括EC2.3.3.13或2.3.3.14。
181.权利要求178的培养物，其中所述AksD包括EC4.2.1中的AksD酶。
182.权利要求181的培养物，其中所述EC4.2.1中的AksD酶包括EC4.2.1.33。
183.权利要求178的培养物，其中所述AksF包括ECl.1.1中的AksF酶。
184.权利要求183的培养物，其中所述ECl.1.1.中的AksF酶包括ECl.1.1.85。
185.权利要求146的培养物，其中所述醇脱氢酶包括EC.1.1.1.1或ECl.1.1.2。
186.权利要求146的培养物，其中所述醇脱氢酶选自来自运动发酵单胞菌的adhA、来自运动发酵单胞菌的adhB、来自丙酮丁醇梭菌的丁醇脱氢酶、酵母属ADHIV、和来自酿酒酵母的ADH6。
187.—种分离的细胞，其包含一种或多种编码涉及选自7AHA;PA;1，7DAH;ENTL;和7HHA的一种或多种聚合物单体的生物合成的一种或多种酶的外源核酸，其中所述酶选自下组:酰基CoA还原酶、酰基[acp]还原酶、硫酯水解酶、氨裂合酶、烯酸还原酶、氨基转移酶、CoA转移酶、硫酯酶、酸-硫醇连接酶、水裂合酶、羰基还原酶、羧酸还原酶、脂肪-酰基CoA还原酶、ω-转氨酶、α-酮酸脱羧酶、醛脱氢酶、醇脱氢酶、和催化α-酮酸链延伸的酶。
【文档编号】C12P13/00GK104011216SQ201280042460
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2012年6月29日 优先权日:2011年6月30日
【发明者】P.S.珀尔曼, 陈昌林, A.L.波特斯, A.V.E.康拉蒂, B.D.赫佐格 申请人:英威达技术有限责任公司