包含来自基因型3a的丙型肝炎病毒基因组的核酸的核酸构建物的制作方法
【专利摘要】本发明提供核酸，该核酸依次包含基因型3a的丙型肝炎病毒基因组的、包含特定的核苷酸序列的5’非翻译区、编码基因型3a的丙型肝炎病毒的NS3蛋白的特定氨基酸序列、NS4A蛋白的特定氨基酸序列、NS4B蛋白的特定氨基酸序列、NS5A蛋白的特定氨基酸序列和NS5B蛋白的特定氨基酸序列的核苷酸序列、以及包含基因型3a的丙型肝炎病毒基因组的特定的核苷酸序列的3’非翻译区。
【专利说明】包含来自基因型3a的丙型肝炎病毒基因组的核酸的核酸 构建物
【技术领域】
[0001] 本发明涉及来自基因型3a的丙型肝炎病毒基因组的核酸、包含该核酸的核酸构 建物和筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法。
【背景技术】
[0002] 在丙型肝炎病毒（Hepatitis C virus;以下记作HCV)的基础研究和抗HCV药的 开发研究中，可以高效率地扩增HCV的实验系统必不可少。具体而言，需要在培养细胞中扩 增HCV的系统或在培养细胞中评价HCV的增殖的系统，如果可以建立这些系统，则认为上述 研究会飞跃性地进步。
[0003] 已知HCV是属于黄病毒科的、以单链的（+)链有义RNA作为基因组的病毒，其成为 丙型肝炎的病因。HCV根据其基因型或血清型而分为多个类型，根据Simmonds等人的使用 HCV株的核苷酸序列的系统分析法，将HCV的基因型分为基因型1?6,并进一步将它们分 为亚型（非专利文献1)。目前，关于HCV的多个基因型，正在确定基因组全长的核苷酸序列 (非专利文献2?5)。
[0004] HCV的感染在全球广泛存在，在日本、美国和欧州，基因型1的HCV感染患者的比例 多。而在印度、尼泊尔、巴基斯坦和澳大利亚，基因型3的HCV感染患者的比例多，这是其特 征（非专利文献6和7)。
[0005] 直至近年，都无法使培养细胞感染上HCV、或者无法使HCV基因组在培养细胞中复 制，因此关于HCV的复制机制或感染机制的研究，需要使用黑猩猩作为实验动物来进行体 内实验。但是，通过由作为基因型lb的HCV的Coni株、HCV-N株和HCV-0株、以及作为基 因型la的HCV的H77c株制作了亚基因组复制子RNA，关于HCV的复制机制的研究，可以使 用培养细胞进行体外实验（专利文献1和非专利文献8?11)。这里，HCV的亚基因组复制 子RNA是指包含一部分HCV基因组的RNA，该RNA不具有感染性HCV颗粒的产生能力，但将 其导入培养细胞中时可以自主复制来自HCV基因组的RNA。
[0006] 另外，由作为基因型2a的HCV的JFH-1株不仅制作了亚基因组复制子RNA、还制作 了在体外产生感染性HCV颗粒的全基因组复制子RNA，关于HCV的感染机制的研究，也可以 使用培养细胞进行体外实验（非专利文献12和13)。这里，HCV的全基因组复制子RNA是 指，包含HCV基因组的全长、即5'非翻译区、结构基因、非结构基因和3'非翻译区的RNA，将 其导入培养细胞中时可以自主复制来自HCV基因组的RNA。
[0007] 目前，具有在使用培养细胞的体外系统中产生感染性HCV颗粒的能力的RNA只有 来自基因型2a的JFH-1株的RNA，为了得到HCV疫苗的原料而可以通过体外系统大量制备 HCV颗粒的物质仅限于JFH-1株的HCV或来自JFH-1株的全基因组复制子。
[0008] 针对丙型肝炎的主要的治疗是通过干扰素-α或干扰素-β的单独疗法和干扰 素-α与作为嘌呤-核苷衍生物的利巴韦林的联合疗法来进行的。但是，已知即使进行上 述治疗，在所有治疗患者中也仅约60%确认到疗效，即使是表现出效果的患者，若中止治疗 则有一半以上会复发。另外，干扰素的疗效与HCV的基因型有关，已知其对基因型lb的效 果低，而对基因型2a或3a的效果较高（非专利文献14)。关于干扰素的疗效根据HCV的 基因型而不同的原因尚未明确，但认为其原因之一在于HCV的复制机制或复制效率存在差 异。
[0009] 近年来，作为针对丙型肝炎的新的治疗药，还正在开发抗来自HCV的蛋白酶或聚 合酶的抑制剂。但据报道，作为HCV的NS3/4蛋白酶抑制剂的TMC435虽然对除基因型3a 以外的基因型1?6的抑制效果高，但其对基因型3a的抑制效果低，其对HCV的效果根据 基因型而不同（非专利文献15)。
[0010] 现有技术文献 专利文献 专利文献1 :日本特开2001-17187号公报； 非专利文献 非专利文献 l:Simmonds 等人，Hepatology, 1994 年，第 10卷，第 1321-1324 页； 非专利文献2 :Choo等人，Science, 1989年，第244卷，第359-362页； 非专利文献 3 :Kato 等人，Journal of Medical Virology, 1992 年，第 64 卷，第 334-339 页； 非专利文献 4 :0kamoto 等人，Journal of General Virology, 1992 年，第 73 卷， 第 673-679 页； 非专利文献 5 :Yoshioka 等人，Hepatology, 1992 年，第 16 卷，第 293-299 页； 非专利文献 6:GRAVITZ，Nature, 2011 年，第 474 卷，第 s2-s4 页； 非专利文献7 :Rehman 等人，Genetic Vaccines and Therapy, 2011 年，第9卷， 第2-5页； 非专利文献8 :Lomann等人，Science, 1999年，第285卷，第110-113页； 非专利文献9 :Blight等人，Science, 2000年，第290卷，第1972-1974页； 非专利文献 l〇:Friebe等人，Journal of Virology, 2001 年，第 75 卷，第 12047-12057 页； 非专利文献 11 :Ikeda 等人，Journal of Virology, 2002 年，第 76 卷，第 2997-3006 页； 非专利文献 12 :Kato 等人，Gastroenterology, 2003 年，第 125 卷，第 1808-1817 页； 非专利文献 13 :Wakita 等人，Nature Medicine, 2005 年，第 11 卷，第 791-796 页； 非 专 利文献 14 ：Mori 等人,Biochemical and Biophysical Research Communications, 1992 年，第 183 卷，第 334-342 页； 非专利文献 15 :Reesink等人，Gastroenterology, 2010年，第 138卷，第 913-921 页。
【发明内容】
[0011] 发明所要解决的课题 但是，目前制作的HCV的亚基因组复制子RNA仅限于来自基因型la、lb和2a的HCV株 的几种，另外，关于产生感染性HCV颗粒的全基因组复制子RNA，正在制作的也只是来自由 嵌合基因构成的基因组的全基因组复制子RNA，所述嵌合基因是指来自基因型2a的JFH-1 株的基因组或来自不同于JFH-1株的株的结构基因与JFH-1株的非结构基因的嵌合基因。 因此，难以阐明HCV的基因型与HCV的复制机制或复制效率的关系，关于作为HCV疫苗的原 料的可以人工制备的HCV颗粒的种类，也仅限于基因型2a，这是现状。
[0012] 而且，在使用来自相同基因型的HCV的亚基因组复制子RNA或全基因组复制子RNA 的研究中，无法在不同的基因型间比较HCV的复制机制或复制效率的差异，不依赖于基因 型而发挥疗效的抗HCV药的开发的线索尚未找到。
[0013] g卩，在HCV的研究领域和医疗领域中，为了开发不依赖于基因型的抗HCV药、特别 是抗基因型3a的抗HCV药，迫切希望获得基因型3a的HCV株和制作基因型3a的HCV的复 制子RNA。
[0014] 因此，本发明的目的在于提供：新的基因型3a的HCV株、以及来自新的基因型3a 的HCV株的具有自主复制能力的复制子RNA。
[0015] 解决课题的方法 本发明人等为了解决上述课题进行了深入研究，结果发现了从急性丙型肝炎患者体内 分离的、作为新的基因型3a的HCV的S310A株，并由该S310A株成功制作了具有自主复制 能力的复制子RNA，从而完成了本发明。
[0016] SP,本发明包含以下内容。
[0017] [1]核酸，该核酸依次包含：基因型3a的丙型肝炎病毒基因组的、包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号1?340的核苷酸序列的5'非翻译区、编码SEQ ID NO: 14的氨基酸 编号1033?1663的NS3蛋白的氨基酸序列、氨基酸编号1664?1717的NS4A蛋白的氨基 酸序列、氨基酸编号1718?1978的NS4B蛋白的氨基酸序列、氨基酸编号1979?2430的 NS5A蛋白的氨基酸序列和氨基酸编号2431?3021的NS5B蛋白的氨基酸序列的核苷酸序 列、以及包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号9407?9655的核苷酸序列的3'非翻译区（其 中，当该核酸为RNA时，将核苷酸序列中的胸腺嘧啶（t)理解成尿嘧啶（u))。
[0018] [2]上述[1]所述的核酸，其中， 上述编码NS3蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号 3437?5329的核苷酸序列， 上述编码NS4A蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号 5330?5491的核苷酸序列， 上述编码NS4B蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号 5492?6274的核苷酸序列， 上述编码NS5A蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号 6275?7630的核苷酸序列， 上述编码NS5B蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号 7631?9406的核苷酸序列。
[0019] [3]上述[1]或[2]所述的核酸，其中，上述5'非翻译区在SEQ ID NO: 1的核苷 酸编号1?340的核苷酸序列中包含1个或多个核苷酸的缺失、取代或添加。
[0020] [4]核酸，该核酸是在上述[1]?[3]中任一项所述的核酸的核苷酸序列中具有 核苷酸突变的核酸，以SEQ ID N0: 14所示氨基酸序列为基准时，该核苷酸突变包括引起下 述（a)?（g)的至少一个氨基酸取代的核苷酸突变： (a) 第1286位的苏氨酸取代成异亮氨酸， (b) 第2188位的苏氨酸取代成丙氨酸， (c) 第2198位的精氨酸取代成组氨酸， (d) 第2210位的丝氨酸取代成异亮氨酸， (e) 第2496位的苏氨酸取代成异亮氨酸， (f) 第2895位的精氨酸取代甘氨酸， (g) 第2895位的精氨酸取代成赖氨酸。
[0021] [5]上述[1]?[4]中任一项所述的核酸，该核酸进一步包含丙型肝炎病毒基因 组的、编码核心蛋白的核苷酸序列、编码E1蛋白的核苷酸序列、编码E2蛋白的核苷酸序列、 编码P7蛋白的核苷酸序列和编码NS2蛋白的核苷酸序列。
[0022] [6]上述[5]所述的核酸，其中， 编码核心蛋白的核苷酸序列为编码SEQ ID N0: 14的氨基酸编号1?191的核心蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列， 编码E1蛋白的核苷酸序列为编码SEQ ID N0: 14的氨基酸编号192?383的E1蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列， 编码E2蛋白的核苷酸序列为编码SEQ ID N0: 14的氨基酸编号384?752的E2蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列， 编码P7蛋白的核苷酸序列为编码SEQ ID N0: 14的氨基酸编号753?815的p7蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列， 编码NS2蛋白的核苷酸序列为编码SEQ ID N0: 14的氨基酸编号816?1032的NS2 蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0023] [7]上述[5]所述的核酸，该核酸包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0: 49?SEQ ID NO: 51中的任一个所不的核苷酸序列。
[0024] [8]上述[4]所述的核酸，该核酸包含SEQ ID N0: 17?SEQ ID N0: 23和SEQ ID NO: 54中的任一个所不的核苷酸序列。
[0025] 上述[1]?[8]所述的核酸可以进一步包含外来基因和/或IRES序列。
[0026] [9]丙型肝炎病毒的亚基因组复制子RNA，其包含上述[1]?[4]和[8]中任一项 所述的核酸。
[0027] [10]丙型肝炎病毒的全基因组复制子RNA，其包含上述[5]?[7]中任一项所述 的核酸。
[0028] [11]丙型肝炎病毒颗粒，其含有上述[5]?[7]中任一项所述的核酸作为病毒基 因组。
[0029] 上述[1]?[8]所述的核酸可以是DNA。另外，包含上述[1]?[8]所述的核酸、 特别是这样的DNA的表达载体也是本发明的优选方案。
[0030] [12]细胞，该细胞中导入有上述[1]?[8]中任一项所述的核酸。
[0031] [13]丙型肝炎病毒疫苗，该疫苗含有上述[11]所述的丙型肝炎病毒颗粒或其一 部分。
[0032] [14]丙型肝炎病毒的抗体，该抗体将上述[11]的丙型肝炎病毒颗粒为抗原识 别。
[0033] [15]抗丙型肝炎病毒物质的筛选方法，该筛选方法包括下述步骤： 培养步骤，在受检物质的存在下和不存在下，培养上述[12]所述的细胞、或上述[11] 所述的丙型肝炎病毒颗粒和丙型肝炎病毒敏感性细胞的混合物； 定量步骤，定量上述培养步骤中在培养物中得到的亚基因组复制子RNA、全基因组复制 子RNA或丙型肝炎病毒颗粒的量；以及 评价步骤，上述定量步骤的结果，当在受检物质的存在下培养的培养物中定量到的亚 基因组复制子RNA、全基因组复制子RNA或丙型肝炎病毒颗粒的量分别少于在上述受检物 质的不存在下培养的培养物中定量到的亚基因组复制子RNA、全基因组复制子RNA或丙型 肝炎病毒颗粒的量时，评价为上述受检物质具有抗丙型肝炎病毒活性。
[0034] [16]上述[5]所述的核酸，其中，上述核酸为来自2个以上的丙型肝炎病毒株的 基因组的嵌合核酸，其从5'侧往3'侧依次包含： SEQ ID NO: 1的丙型肝炎病毒基因组以外的丙型肝炎病毒基因组的编码核心蛋白的 核苷酸序列、编码E1蛋白的核苷酸序列、编码E2蛋白的核苷酸序列和编码p7蛋白的核苷 酸序列； 编码由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号2786?3436的序列构成的NS2蛋白的核苷酸序 列、编码SEQ ID NO: 1的丙型肝炎病毒基因组以外的丙型肝炎病毒基因组的NS2蛋白的 核苷酸序列、或编码由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号2786?3436的核苷酸序列构成的NS2 蛋白的核苷酸序列的一部分与编码SEQ ID NO: 1的丙型肝炎病毒基因组以外的丙型肝炎 病毒基因组的NS2蛋白的核苷酸序列的一部分连接而成的编码嵌合型NS2蛋白的核苷酸序 列；以及 SEQ ID NO: 1中的、编码由核苷酸编号3437?5329的序列构成的NS3蛋白的核苷 酸序列、编码由核苷酸编号5330?5491的序列构成的NS4A蛋白的核苷酸序列、编码由核 苷酸编号5492?6274的序列构成的NS4B蛋白的核苷酸序列、编码由核苷酸编号6275? 7630的序列构成的NS5A蛋白的核苷酸序列和编码由核苷酸编号7631?9406的序列构成 的NS5B蛋白的核苷酸序列。
[0035] [17]核酸，该核酸是在上述[16]所述的核酸的核苷酸序列中具有核苷酸突变的 核酸，以SEQ ID N0: 14所示氨基酸序列为基准时，该核酸具有引起下述（a)?（g)中的至 少一个氨基酸取代的核苷酸突变： (a) 第1286位的苏氨酸取代成异亮氨酸， (b) 第2188位的苏氨酸取代成丙氨酸， (c) 第2198位的精氨酸取代成组氨酸， (d) 第2210位的丝氨酸取代成异亮氨酸， (e) 第2496位的苏氨酸取代成异亮氨酸， (f) 第2895位的精氨酸取代成甘氨酸， (g) 第2895位的精氨酸取代成赖氨酸。
[0036] [18]上述[16]或[17]所述的核酸，该核酸包含SEQ ID NO: 1的丙型肝炎病毒 基因组以外的丙型肝炎病毒基因组的5'非翻译区，以代替上述包含SEQ ID NO: 1的核苷 酸编号1?340的核苷酸序列的5'非翻译区。
[0037] [19]丙型肝炎病毒的嵌合全基因组复制子RNA，其包含上述[16]?[18]所述的 核酸。
[0038] 本说明书包含作为本申请的优先权主张的基础的日本国专利申请2011-189695 号的公开内容。
[0039] 发明效果 根据本发明，可以提供在培养细胞中具有自主复制能力的基因型3a的HCV的复制子 RNA。
【专利附图】
【附图说明】
[0040] 图1是表示HCV S310A株（野生型）的全长基因组RNA的结构（A)、S310A株 的HCV亚基因组复制子RNA表达载体pS310ASGR-Neo的结构（B)、以及通过T7聚合酶由 pS310ASGR-Neo合成的S310A株的HCV亚基因组复制子RNA的结构（C)的图； 图2表示导入了野生型S310A株的HCV亚基因组复制子RNA的Huh7细胞的集落形成 的结果； 图3表示S310A亚基因组复制子复制细胞（克隆）中所含的HCV亚基因组复制子RNA 的拷贝数的定量结果； 图4是表示S310A亚基因组复制子复制细胞（克隆）中的复制子RNA复制对干扰素的 敏感性的图； 图5是表示S310A亚基因组复制子复制细胞（克隆）中的复制子RNA复制对NS3蛋白 酶抑制剂VX-950的敏感性的图； 图6是表示S310A亚基因组复制子复制细胞（克隆）中的复制子RNA复制对NS3蛋白 酶抑制剂BILN-2061的敏感性的图； 图7是表示S310A亚基因组复制子复制细胞（克隆）中的复制子RNA复制对NS5B聚 合酶抑制剂JTK-109的敏感性的图； 图8是表示S310A亚基因组复制子复制细胞（克隆）中的复制子RNA复制对NS5B聚 合酶抑制剂PSI-6130的敏感性的图； 图9是在pS310ASGR-Neo的结构上示意性地表示S310A亚基因组复制子复制细胞（克 隆）中鉴定的氨基酸取代（突变）的位置的图； 图10是表示突变体S310A株（导入了适应性突变的S310A株）的HCV亚基因组复制 子RNA表达载体的结构的图； 图11表示导入了野生型S310A株的HCV亚基因组复制子RNA及其突变体的HCV亚基 因组复制子RNA的细胞的集落形成的结果； 图12是表示插入了萤光素酶基因（Luc)来代替Neo基因的S310A株的HCV亚基因组 复制子RNA及其表达载体pS310ASGR-Luc的结构以及它们的制作过程的图； 图13是表示包含萤光素酶基因的突变体S310A株的HCV亚基因组复制子RNA的复制 能力（发光强度）的图； 图14是表示突变体S310A株（导入了适应性突变的S310A株）的HCV全基因组复制 子RNA(HCV全长基因组）的结构的图； 图15是表示突变体S310A株的HCV全基因组复制子RNA(HCV全长基因组）的HCV颗 粒产生能力（培养上清中的核心蛋白量）的图； 图16是表示来自突变体S310A株（导入了适应性突变的S310A株）、来自J6CF株、来 自JFH-1株和来自TH株的HCV基因组的结构、以及包含突变体S310A株的非结构基因和来 自J6CF株、来自JFH-1株或来自TH株的结构基因的嵌合HCV基因组的结构的图。作为突变 体S310A株的HCV全基因组复制子RNA (全长基因组RNA突变体）的S310A R2198H、S310A S2210I或S310A R2895K分别包含R2198H、S2210I或R2895K的突变，在最上部显示的HCV 基因组的结构上，汇总图示这些突变的位置（实际上单独包含各突变）。
【具体实施方式】
[0041] 本说明书中使用的科学用语、技术用语和命名法，只要没有特别定义，则具有与本 领域技术人员通常所理解的意义相同的意义。另外，关于分子生物学和免疫学领域的普通 的技术和学术用语，是指基于Sambrook等人Molecular Cloning A Laboratory Manual (第 3 版、2001 年）和 Ed Harlow 等人的 Antibodies :A Laboratory Manual (1988 年）中记载 的方法和定义的用语。而且，本说明书中引用的所有出版物、专利和专利申请，其全体作为 参考而引用到本说明书中。
[0042] 丙型肝炎病毒（HCV)是以单链的（+)链有义RNA作为基因组的病毒。HCV的基因 组由5'非翻译区（5' UTR)、编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、 NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列（病毒蛋白编码区）和3'非翻 译区（3' UTR)构成。HCV基因组（HCV全长基因组）是从5'侧往3'侧依次配置5' UTR、编 码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋 白和NS5B蛋白的核苷酸序列、以及3'UTR而形成的RNA。为了与由一部分HCV基因组构成 的核酸进行区别，由其全长构成的HCV基因组还称作"HCV全长基因组"、"全长HCV基因组"、 "HCV全长基因组RNA"、"全长HCV基因组RNA"或"全长基因组RNA"。
[0043] 作为HCV的实际状态，其以病毒颗粒的形式存在。HCV的病毒颗粒（HCV颗粒）在 由HCV的结构蛋白构成的病毒壳的内部含有HCV基因组。
[0044] HCV的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白是形成HCV颗粒的"结构蛋白"，将编 码该结构蛋白的核酸称作"结构基因"。包含这些结构基因的HCV基因组上的序列还称作 "结构区"。HCV的NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白是不形 成HCV颗粒的"非结构蛋白"，将编码该非结构蛋白的核酸称作"非结构基因"。包含这些非 结构基因的HCV基因组上的序列还称作"非结构区"。非结构蛋白具有参与HCV基因组的复 制、HCV蛋白的加工等的功能。
[0045] HCV的5'非翻译区（5' UTR)提供用于蛋白翻译的内部核糖体进入位点（以下记 作IRES)和复制所必需的元件。HCV的5' UTR是指自基因组的5'末端起约360个核苷酸 的区。
[0046] HCV的3'非翻译区（3, UTR)辅助HCV的复制。HCV的3' UTR包含可变区、PolyU 区和约100个核苷酸的附加区。
[0047] 在HCV中，10种病毒蛋白（核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋 白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白）以依次相连的1个前体蛋白（多聚蛋 白）的形式被翻译，之后，利用细胞内和病毒的蛋白酶，分别成为10种成熟的病毒蛋白（核 心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和 NS5B蛋白）。
[0048] 已知HCV中有各种基因型，但已知各种基因型的HCV的基因组具有同样的基因结 构。在本发明中，HCV的"基因型"是指，按照Simmonds等人的国际分类进行分类的基因型。
[0049] 由序列表的SEQ ID NO: 1的核苷酸序列构成的核酸是自急性重症丙型肝炎患者 分离的、作为新的基因型3a的HCV的S310A株的基因组。SEQ ID NO: 1所示序列是S310A 株的全长基因组RNA的cDNA序列，但将该核苷酸序列中的胸腺嘧啶（t)理解成尿嘧啶（u) 的序列是RNA序列。自患者分离HCV基因组的方法记载在Kato等人，Gastroenterology, 2003 年，第 125 卷，第 1808-1817 页中。
[0050] 在上述S310A株的全长HCV基因组序列（SEQ ID NO: 1)中，5'非翻译区（5'UTR) 由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号1?340的序列构成，核心蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的 核苷酸编号341?913的序列构成，El蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号914? 1489的序列构成，E2蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号1490?2596的序列构 成，P7蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号2597?2785的序列构成，NS2蛋白编 码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号2786?3436的序列构成，NS3蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号3437?5329的序列构成，NS4A蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的 核苷酸编号5330?5491的序列构成，NS4B蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号 5492?6274的序列构成，NS5A蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号6275?7630 的序列构成，NS5B蛋白编码序列由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号7631?9406的序列构成， 3'非翻译区（3, UTR)由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号9407?9655的序列构成。关于该 S310A株的全长HCV基因组的结构，见图1A。
[0051] 具体而言，S310A株的全长HCV基因组（SEQ ID NO: 1)的5'非翻译区（5, UTR) 由SEQ ID N0: 2所示核苷酸序列构成，核心蛋白编码序列由SEQ ID N0: 3所示核苷酸序 列构成，E1蛋白编码序列由SEQ ID N0: 4所示核苷酸序列构成，E2蛋白编码序列由SEQ ID N0: 5所示核苷酸序列构成，p7蛋白编码序列由SEQ ID N0: 6所示核苷酸序列构成， NS2蛋白编码序列由SEQ ID N0: 7所示核苷酸序列构成，NS3蛋白编码序列由SEQ ID N0: 8所示核苷酸序列构成,NS4A蛋白编码序列由SEQ ID NO: 9所示核苷酸序列构成，NS4B蛋 白编码序列由SEQ ID N0: 10所示核苷酸序列构成，NS5A蛋白编码序列由SEQ ID N0: 11 所示核苷酸序列构成，NS5B蛋白编码序列由SEQ ID NO: 12所示核苷酸序列构成，3'非翻 译区（3, UTR)由SEQ ID N0: 13所示核苷酸序列构成。
[0052] S310A株的前体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID N0: 14所示。SEQ ID N0: 14所示 的S310A株的前体蛋白的氨基酸序列由包含SEQ ID NO: 1所示野生型S310A株的全长基 因组RNA的cDNA序列的核苷酸编号341?9406 (包含终止密码子）的序列的部分的核苷 酸序列编码。
[0053] 本发明提供：作为上述新的基因型3a的HCV的S310A株的基因组、以及来自该 S310A株的具有自主复制能力的复制子RNA或其核酸。
[0054] "核酸"包括RNA和DNA。另外，本说明书中的"蛋白编码区"、"编码蛋白的核苷酸 序列"、"编码蛋白的序列"和"蛋白编码序列"是指编码规定的蛋白的氨基酸序列的核苷酸 序列，可以包含也可以不包含起始密码子和终止密码子。
[0055] 本说明书中，在核酸为RNA的情况下，当引用序列表的SEQ ID N0来特定RNA的核 苷酸序列或核苷酸时，该SEQ ID N0所示核苷酸序列中的胸腺嘧啶（t)理解成尿嘧啶（u)。
[0056] 在优选实施方式中，本发明提供核酸，该核酸依次包含：基因型3a的丙型肝炎病 毒（例如S310A株或其突变体）的基因组的、包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号1?340的 核苷酸序列的5'非翻译区、编码SEQ ID N0: 14(由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列编码的前 体蛋白）的氨基酸编号1033?1663的NS3蛋白的氨基酸序列、氨基酸编号1664?1717 的NS4A蛋白的氨基酸序列、氨基酸编号1718?1978的NS4B蛋白的氨基酸序列、氨基酸编 号1979?2430的NS5A蛋白的氨基酸序列和氨基酸编号2431?3021的NS5B蛋白的氨基 酸序列的核苷酸序列、以及包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号9407?9655的核苷酸序列的 3'非翻译区。在另一优选实施方式中，该核酸的5'非翻译区在SEQ ID NO: 1的核苷酸编 号1?340的核苷酸序列中可以包含1个或多个（例如2?20个、优选2?5个）核苷酸 的缺失、取代或添加。优选该核酸的5'非翻译区与SEQ ID NO: 1的核苷酸编号1?340 的核苷酸序列具有95%以上、优选97%以上、进一步优选99%以上、例如99. 5%以上的核苷 酸序列同源性。
[0057] 在一实施方式中，本发明的核酸依次包含：包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号1? 340的核苷酸序列的5'非翻译区、SEQ ID NO: 1的核苷酸编号3437?5329的编码NS3蛋 白的氨基酸序列的核苷酸序列、SEQ ID NO: 1的核苷酸编号5330?5491的编码NS4A蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列、SEQ ID NO: 1的核苷酸编号5492?6274的编码NS4B蛋白的 氨基酸序列的核苷酸序列、SEQ ID NO: 1的核苷酸编号6275?7630的编码NS5A蛋白的 氨基酸序列的核苷酸序列、SEQ ID NO: 1的核苷酸编号7631?9406的编码NS5B蛋白的 氨基酸序列的核苷酸序列、以及包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号9407?9655的核苷酸序 列的3'非翻译区。在另一优选实施方式中，该核酸的5'非翻译区在SEQ ID NO: 1的核苷 酸编号1?340的核苷酸序列中可以包含1个或多个（例如2?20个、优选2?5个）核 苷酸的缺失、取代或添加。优选该核酸的5'非翻译区与SEQ ID NO: 1的核苷酸编号1? 340的核苷酸序列具有95%以上、优选97%以上、进一步优选99%以上、例如99. 5%以上的核 苷酸序列同源性。
[0058] 本发明的核酸可以包含：丙型肝炎病毒基因组的、编码核心蛋白的核苷酸序列、编 码E1蛋白的核苷酸序列、编码E2蛋白的核苷酸序列、编码p7蛋白的核苷酸序列和编码NS2 蛋白的核苷酸序列。这样的本发明的核酸能够编码HCV亚基因组复制子RNA。
[0059] 本发明的核酸可以进一步包含：丙型肝炎病毒基因组的、编码核心蛋白的核苷酸 序列、编码E1蛋白的核苷酸序列、编码E2蛋白的核苷酸序列、编码p7蛋白的核苷酸序列和 编码NS2蛋白的核苷酸序列。这样的本发明的核酸能够编码HCV全基因组复制子RNA。此 时，编码核心蛋白的核苷酸序列、编码E1蛋白的核苷酸序列、编码E2蛋白的核苷酸序列、编 码P7蛋白的核苷酸序列和编码NS2蛋白的核苷酸序列可以来自基因型3a的丙型肝炎病毒 (例如S310A株或其突变体）的基因组。
[0060] 当为来自基因型3a的丙型肝炎病毒基因组的核苷酸序列时，编码核心蛋白的核 苷酸序列优选为编码SEQ ID N0: 14的氨基酸编号1?191的核心蛋白的氨基酸序列的 核苷酸序列。另外，编码El蛋白的核苷酸序列优选为编码SEQ ID NO: 14的氨基酸编号 192?383的El蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。编码E2蛋白的核苷酸序列优选为编码 SEQ ID NO: 14的氨基酸编号384?752的E2蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。编码p7 蛋白的核苷酸序列优选为编码SEQ ID NO: 14的氨基酸编号753?815的p7蛋白的氨基 酸序列的核苷酸序列。编码NS2蛋白的核苷酸序列优选为编码SEQ ID NO: 14的氨基酸编 号816?1032的NS2蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
[0061] 编码核心蛋白的核苷酸序列、编码E1蛋白的核苷酸序列、编码E2蛋白的核苷酸序 列、编码P7蛋白的核苷酸序列和编码NS2蛋白的核苷酸序列还可以来自基因型3a以外的 基因型（例如1&、113、2 &、213、2(3、313、4、5&或6&)的!1(^(例如!1(^的现有株）的基因组，此 时，它们成为嵌合型的核酸（嵌合核酸）。
[0062] 本发明的核酸可以是在上述核酸的核苷酸序列中包含1个或多个（优选2?50 个、例如2?10个）核苷酸突变的核酸。对核苷酸突变没有限定，但优选为核苷酸的缺失、 取代或添加。核苷酸突变可以是不会引起氨基酸取代的同义取代，只要不丧失自主复制能 力，还可以是引起氨基酸取代的非同义取代。只要不丧失自主复制能力，氨基酸取代可以是 保守取代，也可以是非保守取代。
[0063] 本发明的核酸还可以包含来自基因型3a以外的基因型（例如la、lb、2a、2b、2c、 3b、4、5a或6a)的HCV (例如HCV的现有株）的基因组的5'非翻译区，以代替包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号1?340的核苷酸序列的5'非翻译区。
[0064] 本发明的核酸还可以包含外来基因（抗药性基因或报道基因等）和IRES序列。
[0065] 本发明的核酸可以是HCV亚基因组复制子RNA或HCV全基因组复制子RNA等HCV 复制子RNA或编码其的核酸。本发明的核酸例如可以是包含编码HCV复制子RNA的核苷酸 序列的表达盒等。本发明的核酸可以是DNA、RNA、或DNA和RNA的嵌合等，还可以包含修饰 核苷酸等。
[0066] 在本发明中，"复制子RNA"是指具有在培养细胞（典型的是HCV敏感性细胞）内 进行自主复制的能力的RNA。导入到细胞中的复制子RNA进行自主复制、且其RNA拷贝在细 胞分裂后被分配到子细胞中，所以使用复制子RNA时可以稳定地导入到细胞中。
[0067] HCV的复制子RNA(HCV复制子RNA)是指，包含HCV基因组RNA的一部分或全长、 且进行自主复制的RNA。将包含HCV基因组RNA的一部分且进行自主复制的RNA称作HCV 亚基因组复制子RNA，将包含HCV基因组RNA的全长且进行自主复制的RNA称作HCV全基 因组复制子RNA。"HCV复制子RNA"包含HCV亚基因组复制子RNA和HCV全基因组复制子 RNA双方。
[0068] 本发明中的"HCV亚基因组复制子RNA"，其优选从5'侧往3'侧依次包含HCV的 5'非翻译区（5, UTR)、编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷 酸序列、以及3'非翻译区（3' UTR)。另外，关于HCV亚基因组复制子RNA，为了对其进行检 测，优选包含外来基因（例如抗药性基因或报道基因）和IRES序列，在这种情况下，优选在 HCV亚基因组复制子RNA的NS3蛋白编码区的5'侧包含外来基因（抗药性基因或报道基 因）和IRES序列。
[0069] 本发明的"HCV亚基因组复制子RNA"优选包含本发明的核酸。本发明的"HCV亚 基因组复制子RNA"优选由本发明的核酸表达的HCV亚基因组复制子RNA。本发明的一优 选的"HCV亚基因组复制子RNA"的例子为：从5'侧往3'侧依次包含HCV的5'非翻译区 (5' UTR)、自编码核心蛋白的核苷酸序列的5'末端起57个核苷酸的序列、外来基因（抗药 性基因或报道基因 ）、I RES序列、编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋 白的核苷酸序列、以及3'非翻译区（3' UTR)的HCV亚基因组复制子RNA。
[0070] 本发明中的"HCV全基因组复制子RNA"优选从5'侧往3'侧依次配置HCV的5' 非翻译区（5' UTR)、编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋 白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列和3'非翻译区（3' UTR)而形成的HCV 全基因组复制子RNA。HCV全基因组复制子RNA可以进一步包含外来基因（抗药性基因或 报道基因）和IRES序列。这种情况下，优选在HCV全基因组复制子RNA的编码核心蛋白的 核苷酸序列的5'侧包含外来基因（抗药性基因或报道基因）和IRES序列。
[0071] 当HCV全长基因组核酸具有自主复制能力时，该基因组是复制子RNA。将包含HCV 全长基因组核酸的复制子RNA称作HCV全基因组复制子RNA。当由HCV全长基因组序列构 成的RNA(HCV全长基因组RNA)具有自主复制能力时，其是HCV全基因组复制子RNA。
[0072] 作为HCV复制子RNA (HCV全基因组复制子RNA和HCV亚基因组复制子RNA)和本 发明的核酸所能包含的抗药性基因的例子，例如可以列举：新霉素抗性基因、潮霉素抗性基 因、胸苷激酶基因、卡那霉素抗性基因、吡啶硫胺素抗性基因、腺苷酰基转移酶基因 、Zeocin 抗性基因、嘌呤霉素抗性基因、杀稻瘟菌素 S抗性基因等，优选新霉素抗性基因、潮霉素抗 性基因，进一步优选新霉素抗性基因。
[0073] 作为HCV复制子RNA和本发明的核酸所能包含的报道基因的例子，例如可以列举 催化发光反应或显色反应的酶的结构基因。作为优选的报道基因的例子，可以列举来自转 座子Tn9的氯霉素乙酰转移酶基因、来自大肠杆菌的β葡糖醛酸酶或β半乳糖苷酶基因、 萤光素酶基因、绿色萤光蛋白基因、来自水母的水母素（4々才U Aaequorin)基因、分泌 型胎盘碱性磷酸酶（SEAP)基因等。
[0074] 在HCV复制子RNA或本发明的核酸中，可以只包含抗药性基因或报道基因中的 任意一种，也可以包含两者。在HCV复制子RNA或本发明的核酸中，可以包含1个也可以 包含2个以上的抗药性基因或报道基因。包含2个以上的抗药性基因或报道基因时，可以 将各基因与来自病毒的2A肽基因以形成正确的读框（框架）的方式连接。作为2A肽， 可以列举来自明脉扁刺蛾病毒（Thosea asigna virus)的2A肽（T2A)、来自口蹄疫病毒 (Foot-and-mouth disease virus)的 2A 肤（F2A)、来自马鼻炎 A 病毒（Equin rhinitis A virus)的 2A 肤（E2A)、来自猪捷申病毒 l(Porcine teschovirus 1)的 2A肤（P2A) (Kim等 人，PoLos One·, 2011 年，第 6(4)卷，el8556)。
[0075] HCV复制子RNA和本发明的核酸所能包含的IRES序列与上述相同，例如是指可以 使核糖体结合在RNA内部并开始翻译的内部核糖体结合位点。作为IRES序列的优选的例 子，可以列举EMCV IRES(脑心肌炎病毒的内部核糖体结合位点）、FMDV IRES、HCV IRES等， 更优选 EMCV IRES 和 HCV IRES，最优选 EMCV IRES。
[0076] 在HCV复制子RNA和本发明的核酸中，抗药性基因和/或报道基因以由HCV复制 子RNA按照正确的读框（框架）进行翻译的方式连接。由HCV复制子RNA或本发明的核酸 编码的蛋白优选作为一系列的多肽被翻译、表达后，被蛋白酶切断形成各蛋白，以游离的方 式经由蛋白酶切位点等彼此相连。
[0077] HCV敏感性细胞是指在细胞培养系统中容许HCV颗粒的感染或HCV复制子RNA的 复制的细胞，可以列举Huh7细胞、！fepG2细胞、MY-N9细胞、HeLa细胞、293细胞、或作为 Huh7细胞的衍生株的Huh7. 5细胞、Huh7. 5. 1细胞。另外，还可以列举使CD81基因和/或 Claudinl基因在Huh7细胞、!fepG2细胞、頂Y-N9细胞、HeLa细胞或293细胞中表达的细胞 (Lindenbach等人，Science, 2005年，第 309 卷，第 623-626 页；Evans 等人，Nature, 2007年，第446卷，第 801-805 页；Akazawa 等人，J. Virol. 2007年，第 81 卷，第 5036-5045页）。其中，特别优选使用Huh7细胞或Huh7细胞的衍生株。需要说明的是，在 本发明中，"衍生株"是指由该细胞诱导的株。
[0078] 研究显示：在HCV基因组的有效复制中，往往需要在基因组的核苷酸序列中发生 突变（Lohmann 等人，Journal of Virology, 2001 年，第 75 卷，第 1437-1449 页）。将 提高复制能力的突变称作适应性突变（adaptive mutation)。
[0079] 本发明的核酸和HCV复制子RNA也可以包含适应性突变。例如，作为上述的S310A 株的、HCV亚基因组复制子RNA的复制能力提高的适应性突变，以SEQ ID N0: 14所示氨基 酸序列（S310A株的前体蛋白的全长氨基酸序列）为基准时，可以列举T1286I(第1286位 的苏氨酸（Τ)突变成异亮氨酸（Ι))、Τ2188Α(第2188位的苏氨酸（Τ)突变成丙氨酸（Α))、 R2198H(第2198位的精氨酸（R)突变成组氨酸（H))、S2210I(第2210位的丝氨酸（S)突变 成异亮氨酸（I))、T2496I (第2496位的苏氨酸（T)突变成异亮氨酸（I))、R2895G (第2895 位的精氨酸（R)突变成甘氨酸（G))和R2895K (第2895位的精氨酸（R)突变成赖氨酸（K))。 通过将这些适应性突变单独或组合导入本发明的核酸和HCV复制子RNA、例如上述S310A株 的HCV基因组中，可以获得复制能力提高的HCV亚基因组复制子RNA或HCV全基因组复制子 RNA或编码它们的核酸。在本发明中，本发明的核酸和HCV复制子RNA所具有的、更优选的 核苷酸突变为：引起氨基酸序列的T1286I的突变、R2198H的突变、S2210I的突变或R2895K 的突变的突变，进一步优选的核苷酸突变为：引起氨基酸序列的R2198H突变、S2210I突变 或R2895K突变的突变。另外，还可以单独导入公知文献记载的适应性突变，或者将其与上 述突变组合导入。将要导入的突变只要是来自上述S310A株的HCV复制子RNA的复制能力 提高的突变即可。需要说明的是，T1286I是NS3蛋白内的突变，T2188A、R2198H和S2210I 的突变是NS5A蛋白内的突变，T2496I、R2985G和R2985K是NS5B蛋白内的突变。
[0080] 向本发明的核酸和HCV复制子RNA、例如分离的基因型3a的野生型HCV基因组中 导入突变时，可以采用PCR法或市售的突变导入试剂盒（例如东洋纺社制的KOD-Plus-诱 变试剂盒等）。作为PCR法，例如，以将基因型3a的野生型HCV基因组RNA的cDNA克隆化 的载体为模板，使用由该cDNA的序列设计的、包含将要导入的突变的正向和反向引物实施 PCR，从而可以扩增目标序列部分。具体而言，合成多个彼此具有重复序列的不同的PCR产 物，混合这些PCR产物，以其为模板，使用包含目标核酸的5'端的正向引物和包含该核酸的 互补链的5'端的反向引物进行PCR，从而可以扩增该目标核酸。用限制酶切断所合成的核 酸的各末端，再与将用相同的酶切断的野生型HCV基因组RNA的cDNA克隆化的载体连接。 这样的操作的基本技术例如还记载在国际公开第04/104198号、国际公开第06/022422号、 Wakita 等人，2005 年，Nature Medicine,第 11 号，第791-796页和 Lindenbach 等人， 2005 年，Science,第 309 号，第 623-626 页中。
[0081] 作为本发明的核酸和HCV亚基因组复制子RNA的一实施方式，可以列举从5'侧往 3'侧依次包含上述的S310A株的全长HCV基因组（SEQ ID NO: 1)中的5'非翻译区（5'UTR) (SEQ ID NO: 2)、NS3 蛋白编码序列（SEQ ID NO: 8)、NS4A 蛋白编码序列（SEQ ID NO: 9)、 NS4B蛋白编码序列（SEQ ID NO: 10)、NS5A蛋白编码序列（SEQ ID NO: 11)、NS5B蛋白编 码序列（SEQ ID NO: 12)和 3' 非翻译区（3, UTR) (SEQ ID NO: 13)的核酸。
[0082] 作为本发明的核酸和HCV亚基因组复制子RNA的另一实施方式，可以列举：在从 5'侧往3'侧依次包含S310A株的全长HCV基因组（SEQ ID NO: 1)中的5'非翻译区（5'UTR) (SEQ ID NO: 2)、NS3 蛋白编码序列（SEQ ID NO: 8)、NS4A 蛋白编码序列（SEQ ID NO: 9)、 NS4B蛋白编码序列（SEQ ID NO: 10)、NS5A蛋白编码序列（SEQ ID NO: 11)、NS5B蛋白编 码序列（SEQ ID NO: 12)和3'非翻译区（3, UTR) (SEQ ID NO: 13)的核苷酸序列中，包含 选自 T1286I、T2188A、R2198H、S2210I、T2496I、R2895G 和 R2895K 的至少一个突变的核酸。 作为本发明的核酸和HCV亚基因组复制子RNA，还优选列举从5'侧往3'侧依次包含S310A 株的全长HCV基因组中的5'非翻译区（5' UTR)、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、 NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3'非翻译区（3' UTR)、并且 还包含T1286I、R2198H或R2895K的突变的核酸。作为本发明的核酸和HCV亚基因组复制 子RNA，进一步优选列举：从5'侧往3'侧依次包含S310A株的全长HCV基因组中的5'非 翻译区（5' UTR)、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编 码序列、NS5B蛋白编码序列和3'非翻译区（3, UTR)、并且还包含R2198H或R2895K的突变 的核酸。
[0083] 上述的HCV亚基因组复制子RNA可以进一步包含抗药性基因和/或报道基因以及 IRES序列。此时，优选在5' UTR的下游插入抗药性基因或/和报道基因，并进一步在其下 游插入IRES序列。
[0084] 作为本发明的HCV亚基因组复制子RNA的进一步优选的实施方式，可以列举由 SEQ ID N0: 16所示核苷酸序列构成的核酸（野生型S310A株的HCV亚基因组复制子RNA、 图1C)。作为本发明的HCV亚基因组复制子RNA的另一优选实施方式，可以列举在SEQ ID NO: 16 所示核苷酸序列中导入有选自 T1286I、T2188A、R2198H、S2210I、T2496I、R2895G 和 R2895K的突变的RNA，更优选列举导入有T1286I、R2198H或R2895K的突变的RNA。例如，可 以例示包含SEQ ID N0: 17 (在野生型S310A株的HCV亚基因组复制子RNA中包含T1286I 的突变的序列）、SEQ ID N0: 18(在野生型S310A株的HCV亚基因组复制子RNA中包含 R2198H的突变的序列）或SEQ ID N0: 19 (在野生型S310A株的HCV亚基因组复制子RNA 中包含R2895K的突变的序列）所示核苷酸序列的核酸。
[0085] 构成本发明的HCV亚基因组复制子RNA的核酸可以是：虽然在引起上述突变的核 苷酸以外的核苷酸中进一步具有其他突变，但与包含上述突变的核酸具有相同的复制能力 的核酸。作为这样的其他突变，可以列举1个或多个核苷酸的取代，该具有其他突变的核酸 优选与原始核酸的核苷酸序列具有90%以上、优选95%以上、进一步优选97%以上的核苷酸 序列同源性。而且，作为这样的其他突变，可以列举1个或多个核苷酸的缺失或添加。此时， 该具有其他突变的核酸优选与原始核酸的核苷酸序列具有90%以上、优选95%以上、进一步 优选97%以上的核苷酸序列同源性，并且，当其他突变为编码蛋白的序列内的缺失或添加 时，优选被翻译成蛋白的氨基酸序列的读框不偏移。而且，作为这样的其他突变，可以列举 HCV基因组的5'非翻译区内或3'非翻译区内的1个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，该 具有其他突变的核酸优选与原始核酸的核苷酸序列具有90%以上、优选95%以上、进一步优 选97%以上的核苷酸序列同源性。而且，作为这样的其他突变，可以列举编码HCV基因组的 HCV蛋白的核苷酸序列（病毒蛋白编码区）内的1个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，该 具有其他突变的核酸优选与原始核酸的核苷酸序列具有90%以上、优选95%以上、进一步优 选97%以上的核苷酸序列同源性，并且，当其他突变为缺失或添加时，优选被翻译成HCV蛋 白的氨基酸序列的读框不偏移。
[0086] 在本说明书中，氨基酸或氨基酸残基通过生物学领域通常使用的氨基酸的单字母 符号或 3 字母符号（Sambrook 等人，Molecular Cloning :A Laboratory Manual 第二版， 1989年）来记载。这样书写的氨基酸还包含进行了氢氧化、糖链加成、硫酸化等翻译后修饰 的氨基酸。
[0087] 在本说明书中，有时通过"以SEQ ID NO: "X"所示的…氨基酸序列为基准时第 "Y"位的（氨基酸）"的表述来指定SEQ ID N0所示氨基酸序列中的特定位置的氨基酸。例 如，"以SEQ ID N0: 14所示S310A株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时第"Y"位的（氨基 酸）"的记载是指，在SEQ ID N0: 14所示HCV的S310A株的前体蛋白的氨基酸序列中，以 N末端的第1氨基酸（甲硫氨酸）作为第1位时，该氨基酸是位于第"Y"位的氨基酸残基。 采用"以SEQ ID NO: "X"所示的…氨基酸序列为基准时第"Y"位的（氨基酸）"的表述指 定的氨基酸，只要其在序列比对上与SEQ ID NO: "X"的第"Y"位的氨基酸对应即可，例如 其在SEQ ID NO: "X"的序列突变体（末端切断序列等）中可以位于第"Y"位，但也可以不 位于第"Y"位。具体而言，例如记载为"以SEQ ID N0: 14所示S310A株的前体蛋白的氨基 酸序列为基准时，由第2496位的苏氨酸被取代成异亮氨酸的S310A株的NS3蛋白、NS4A蛋 白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的氨基酸序列构成的前体蛋白"时，例如还是指在SEQ ID N0: 14中虽然位于第2496位但由于SEQ ID N0: 14的氨基酸序列的N末端的末端切 断（截短）而使其距末端切断序列上的N末端的位置不是第2496位的苏氨酸在蛋白中被 取代成异亮氨酸。
[0088] 在本说明书中，R2895K等的书写表示特定位置的氨基酸的取代，根据文脉还表示 引起该氨基酸取代的核苷酸突变。例如，核酸的核苷酸发生突变，原始核酸所编码的氨基酸 序列中的第2895位R (精氨酸）取代成K (赖氨酸）时，有时将该核苷酸突变称作R2895K取 代（突变）。另外，有时将编码具有该突变的氨基酸序列的核酸称作包含R2895K取代（突 变）的核酸、或导入了 R2895K取代（突变）的核酸。或者，还有时将这样的突变称作引起 氨基酸序列中的R2895K取代（突变）的核苷酸突变、或引起氨基酸序列中的R2895K取代 (突变）的突变。例如，有时将导入了 R2895K取代（突变）的HCV复制子RNA称作R2895K 突变体HCV复制子RNA。同时具有多个突变时，例如，具有T2496I的氨基酸取代和R2895K 的氨基酸取代时，有时表述为"包含T2496I/R2895K的取代（突变"氨基酸取代"有时 表述为"氨基酸突变"。
[0089] 引起特定的氨基酸取代的核苷酸突变可以根据周知的遗传密码表来选择。例如， 引起R2895K取代的突变是导致由编码精氨酸的密码子"CGU"、"CGC"、"CGA"、"CGG"、"AGA" 或"AGG"变为编码赖氨酸的密码子"AAA"或"AAG"的突变。在S310A株的全长基因组序列 (SEQ ID NO: 1)中，引起R2895K取代的核苷酸突变是使密码子"AGA"（SEQ ID NO: 1的第 9023位?第9025位）变为"AAG"或"AAA"的突变。即，这是使SEQ ID NO: 1的第9024 位?第9025位的核苷酸序列由5' -GA-3'突变成5' -AG-3'、或者使第9024位的核苷酸由 G突变成A的核苷酸突变。
[0090] 同样，以SEQ ID N0: 14所示S310A株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，第2198 位的精氨酸取代成组氨酸的氨基酸取代记作R2198H。在S310A株的全长基因组序列（SEQ ID NO: 1)中，引起R2198H取代的核苷酸突变是指使编码精氨酸的密码子"C⑶"（SEQ ID NO: 1的第6932位?第6934位）变成编码组氨酸的密码子"CAU"或"CAC"的突变。
[0091] 同样，以SEQ ID N0: 14所示S310A株的前体蛋白的氨基酸序列为基准时，第1286 位的苏氨酸取代成异亮氨酸的氨基酸取代记作T1286I。在S310A株的全长基因组序列（SEQ ID NO: 1)中，引起T1286I取代的核苷酸突变是使编码苏氨酸的密码子"ACU"(SEQ ID N0: 1的第4196位?第4198位）变为编码异亮氨酸的密码子"AUU"、"AUC"或"AUA"的突变。
[0092] 另外，在本说明书中，SEQ ID N0所示核苷酸序列的核苷酸编号是以在SEQ ID N0 所不核苷酸序列中以5'末端的第1核苷酸为第1位而附上了核苷酸编号的编号为基准。
[0093] HCV亚基因组复制子RNA通过由表达载体进行转录（表达）即可获得。与HCV亚 基因组复制子RNA表达载体的构建有关的基本技术记载在Lohmann等人，Science, 1999 年，第 285 卷，第 110-113 页和 Kato 等人，Gastroenterology, 2003 年，第 125卷， 第1808-1817页中。具体而言，例如，通过在5'侧往3'侧的方向将5'非翻译区（5'UTR)、 编码核心蛋白的区的57个核苷酸、外来基因（抗药性基因或报道基因 ）、EMCV IRES序列、 编码NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列以及3'非翻译 区（3' UTR)依次连接的cDNA插入T7启动子的下游，可以构建HCV亚基因组复制子RNA表 达载体。需要说明的是，在各核苷酸序列的连接中，在连接位点可以包含限制酶切位点等添 加序列。
[0094] 上述的HCV亚基因组复制子RNA，可以利用聚合酶由构建的HCV亚基因组复制子 RNA表达载体合成。例如，作为以在T7启动子的控制下将HCV cDNA克隆化的核酸为模板在 体外制作RNA的方法，可以列举使用MEGAscript T7试剂盒（Ambion公司）等进行的合成。 由该载体转录的HCV亚基因组复制子RNA被导入细胞中时进行自主复制。本发明包含导入 有HCV亚基因组复制子RNA的细胞。
[0095] 作为启动子，不仅使用T7启动子，还可以使用SP6启动子、T3启动子、T5启动子等 任意的启动子，但优选17启动子。
[0096] 作为载体，可以使用 pUC19 (TaKaRa 公司）、pBR322 (TaKaRa 公司）、pGEM-T、pGEM_T Easy、pGEM_3Z (均由 Promega 公司制）、pSP72 (Promega 公司）、pCRII (Invitrogen 公司）、 pT7Blue(Novagen公司）等各种载体。
[0097] 作为将要导入HCV亚基因组复制子RNA的细胞，只要是容许HCV亚基因组复制子 RNA的复制的细胞即可，可以列举上述的HCV敏感性细胞。特别优选使用Huh7细胞或Huh7 细胞的衍生株。
[0098] 作为将HCV亚基因组复制子RNA导入细胞中的方法，可以采用公知的任意方法。例 如，可以列举磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、脂质转染法、显微注射法、电穿孔法，但优选 列举脂质转染法和电穿孔法，进一步优选列举电穿孔法。
[0099] 作为评价导入的HCV亚基因组复制子RNA的复制能力的方法，可以列举测定HCV 亚基因组复制子RNA所连接的外来基因的功能、即通过该基因的表达而表现出来的功能。 当外来基因为抗药性基因时，计测在含有药物的选择培养基中增殖的细胞数或细胞的集落 数，从而可以评价HCV亚基因组复制子RNA的复制能力。此时，细胞数或细胞的集落数越 多，则可以评价为复制能力越高。当外来基因为酶时，通过计测其酶活性，可以评价HCV亚 基因组复制子RNA的复制能力。此时，酶活性越高，则可以评价为复制能力越高。作为其他 方法，通过利用定量的RT-PCR定量已复制的RNA的量，也可以直接评价HCV亚基因组复制 子RNA的复制能力。
[0100] 本发明的HCV全基因组复制子RNA还包含HCV全长基因组RNA本身，可以按照与上 述的HCV亚基因组复制子RNA相同的程序来制作。关于本发明的HCV全基因组复制子RNA， 通过将上述的HCV亚基因组复制子RNA的复制能力有所提高的适应性突变与上述的HCV亚 基因组复制子RNA同样地导入基因型3a的野生型的S310A株等的HCV全长基因组RNA中， 可以制作HCV全基因组复制子RNA。这里，将在野生型的S310A株的HCV全长基因组RNA中 导入有上述适应性突变的HCV基因组称作S310A株突变体或突变体S310A株。
[0101] 作为导入突变的方法，可以利用上述方法将突变导入野生型的S310A株的HCV全 长基因组中，也可以通过将野生型的HCV基因组的结构基因部分与亚基因组复制子突变体 连接而导入突变。
[0102] 上述HCV全基因组复制子RNA的一实施方式涉及复制子RNA，该复制子RNA从5' 侧往3'侧依次包含S310A株的全长基因组RNA(SEQ ID N0: 1)、即5'非翻译区（5' UTR) (SEQ ID N0: 2)、核心蛋白编码序列（SEQ ID NO: 3)、E1蛋白编码序列（SEQ ID NO: 4)、E2 蛋白编码序列（SEQ ID NO: 5)、p7蛋白编码序列（SEQ ID NO: 6)、NS2蛋白编码序列（SEQ ID NO: 7)、NS3 蛋白编码序列（SEQ ID NO: 8)、NS4A 蛋白编码序列（SEQ ID NO: 9)、NS4B 蛋白编码序列（SEQ ID NO: 10)、NS5A蛋白编码序列（SEQ ID NO: 11)、NS5B蛋白编码序列 (SEQ ID NO: 12)和 3' 非翻译区（3, UTR) (SEQ ID NO: 13)。
[0103] 上述HCV全基因组复制子RNA的另一实施方式涉及在S310株的全长基因组RNA 中导入有上述适应性突变的核酸。作为该HCV全基因组复制子RNA的优选的实施方式，可 以列举：在从5'侧往3'侧依次包含上述的S310A株的全长基因组RNA(SEQ ID NO: 1)、即 5'非翻译区（5, UTR) (SEQ ID NO: 2)、核心蛋白编码序列（SEQ ID NO: 3)、E1蛋白编码序 列（SEQ ID NO: 4)、E2 蛋白编码序列（SEQ ID NO: 5)、p7 蛋白编码序列（SEQ ID NO: 6)、 NS2蛋白编码序列（SEQ ID NO: 7)、NS3蛋白编码序列（SEQ ID NO: 8)、NS4A蛋白编码序 列（SEQ ID NO: 9)、NS4B 蛋白编码序列（SEQ ID NO: 10)、NS5A 蛋白编码序列（SEQ ID NO: 11)、NS5B 蛋白编码序列（SEQ ID NO: 12)和 3' 非翻译区（3, UTR) (SEQ ID NO: 13)的核 苷酸序列中包含 T1286I、T2188A、R2198H、S2210I、T2496I、R2895G 或 R2895K 的突变的 RNA。 优选列举：在从5'侧往3'侧依次包含S310A株的全长基因组RNA (SEQ ID NO: 1)、即5' 非翻译区（5' UTR)、核心蛋白编码序列、El蛋白编码序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序 列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A 蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3'非翻译区（3' UTR)的核苷酸序列中包含R2198H、 S2210I或R2895K的突变的核酸。
[0104] HCV全基因组复制子RNA可以进一步包含抗药性基因和/或报道基因、以及IRES 序列。此时，优选在5'非翻译区（5'UTR)的下游插入抗药性基因或/和报道基因，并进一 步在其下游插入IRES序列。
[0105] 作为上述HCV全基因组复制子RNA的进一步优选的实施方式，可以列举包含SEQ ID NO: 49(包含S2210I的突变的全基因组核苷酸序列）、SEQ ID NO: 50(包含R2198H的 突变的全基因组核苷酸序列）或SEQ ID N0: 51 (包含R2895K的突变的全基因组核苷酸序 列）所示核苷酸序列的RNA。具体而言，由SEQ ID N0: 49所示具有引起第2210位的丝氨 酸取代成异亮氨酸的取代的突变的核苷酸序列构成的核酸、由SEQ ID N0: 50所示具有引 起第2198位的精氨酸取代组氨酸的取代的突变的核苷酸序列构成的核酸、或由SEQ ID N0: 51所示具有引起第2895位的精氨酸取代成赖氨酸的取代的突变的核苷酸序列构成的核酸 符合。
[0106] 构成本发明的HCV全基因组复制子RNA的核酸可以是：虽然在引起上述突变的核 苷酸以外的核苷酸中进一步具有其他突变，但与包含上述突变的核酸具有同等的复制能力 的核酸。作为这样的其他突变，可以列举1个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，该具有其 他突变的核酸优选与原始核酸的核苷酸序列具有90%以上、优选95%以上、进一步优选97% 以上的核苷酸序列同源性。而且，作为这样的其他突变，可以列举HCV基因组的5'非翻译 区内或3'非翻译区内的1个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，该具有其他突变的核酸优 选与原始核酸的核苷酸序列具有90%以上、优选95%以上、进一步优选97%以上的核苷酸序 列同源性。而且，作为这样的其他突变，可以列举编码HCV基因组的HCV蛋白的核苷酸序列 (病毒蛋白编码区）内的1个或多个核苷酸的缺失、取代或添加，该具有其他突变的核酸优 选与原始核酸的核苷酸序列具有90%以上、优选95%以上、进一步优选97%以上的核苷酸序 列同源性，并且当其他突变为缺失或添加时，优选被翻译成HCV蛋白的氨基酸序列的读框 不偏移。
[0107] 上述的HCV全基因组复制子RNA的制作中使用的表达载体可以利用国际公开第 05/080575号中记载的技术来制作。具体而言，利用常规方法重建HCV的全长基因组RNA所 对应的cDNA，并将其插入启动子的下游，制作DNA克隆。上述启动子优选为质粒克隆中所含 的启动子。作为启动子，可以使用T7启动子、SP6启动子、T3启动子、T5启动子等，优选T7 启动子。作为载体，可以使用pUC19(TaKaRa公司）、pBR322(TaKaRa公司）、pGEM-T、pGEM-T Easy、pGEM_3Z (均由 Promega 公司制）、pSP72 (Promega 公司）、pCRII (Invitrogen 公司）、 pT7Blue(Novagen 公司）等。
[0108] 由表达载体制作HCV全基因组复制子RNA时，以所制作的上述DNA克隆为模板，利 用聚合酶合成RNA。以在T7启动子的控制下将HCV cDNA克隆化的核酸为模板，在体外制作 RNA时，可以使用MEGAscript T7试剂盒（Ambion公司）等进行合成。RNA的合成可以利用 常规方法从5' UTR开始。当DNA克隆为质粒克隆时，还可以使用通过限制酶从质粒克隆中 切出的DNA片段作为模板，合成RNA。需要说明的是，优选所合成的RNA的3'末端与HCV基 因组RNA的3' UTR的末端一致，不添加或者不删除其他的序列。
[0109] 上述的HCV全基因组复制子RNA或其核酸若被导入培养细胞（典型的是HCV敏感 性细胞）中，则进行自主复制，产生HCV颗粒（丙型肝炎病毒），另外，若用含有上述的HCV 全基因组复制子RNA或其核酸作为病毒基因组的HCV颗粒感染培养细胞（典型的是HCV敏 感性细胞），则产生HCV颗粒。即，导入了上述的HCV全基因组复制子RNA或其核酸的培养 细胞、或被含有上述的HCV全基因组复制子RNA或其核酸作为病毒基因组的HCV颗粒感染 的培养细胞可用于HCV颗粒的大量生产。
[0110] 更具体而言，由导入了上述的HCV全基因组复制子RNA或其核酸的培养细胞（典 型的是HCV敏感性细胞）、或被含有上述的HCV全基因组复制子RNA或其核酸作为病毒基因 组的HCV颗粒（丙型肝炎病毒）感染的培养细胞（典型的是HCV敏感性细胞）产生的HCV 颗粒，其进一步感染其他的培养细胞（典型的是HCV敏感性细胞），在该细胞内HCV的基因 组RNA被复制、包装，可以反复产生HCV颗粒。用HCV颗粒感染培养细胞时，例如可以将导 入了 HCV全基因组复制子RNA或其核酸的培养细胞的培养上清添加在HCV敏感性细胞（例 如Huh7细胞）中来实施。
[0111] 作为将要导入上述的HCV全基因组复制子RNA或其核酸的细胞、或将要感染上述 HCV颗粒（丙型肝炎病毒）的细胞，优选培养细胞，只要是容许HCV复制子RNA的复制或HCV 颗粒的形成的细胞即可，可以列举上述的HCV敏感性细胞。特别优选使用Huh7细胞或Huh7 细胞的衍生株。
[0112] 作为将HCV全基因组复制子RNA导入细胞中的方法，可以采用公知的任意方法。例 如，可以列举磷酸钙共沉淀法、DEAE葡聚糖法、脂质转染法、显微注射法、电穿孔法，但优选 列举脂质转染法和电穿孔法，进一步优选列举电穿孔法。
[0113] 作为评价导入的HCV全基因组复制子RNA的复制能力的方法，可以列举测定HCV 全基因组复制子RNA所连接的外来基因的功能、即通过该基因的表达而表现出来的功能。 当外来基因为抗药性基因时，计测在含有药物的选择培养基中增殖的细胞数或细胞的集落 数，从而可以评价HCV全基因组复制子RNA的复制能力。此时，细胞数或细胞的集落数越 多，则可以评价为复制能力越高。当外来基因为酶时，通过计测其酶活性，可以评价HCV全 基因组复制子RNA的复制能力。此时，酶活性越高，则可以评价为复制能力越高。作为其他 方法，通过利用定量性的RT-PCR定量复制的RNA的量，也可以直接评价HCV全基因组复制 子RNA的复制能力。
[0114] 需要说明的是，本发明还包含：包含上述核酸的病毒基因组和含有上述核酸作为 病毒基因组的丙型肝炎病毒颗粒（丙型肝炎病毒）。
[0115] 上述的HCV全基因组复制子RNA或其核酸在培养细胞中具有HCV颗粒产生能力。 在评价HCV全基因组复制子RNA或其核酸是否具有HCV颗粒产生能力时，只要将该RNA导 入细胞中，测定其细胞培养上清中的HCV颗粒的存在即可。
[0116] 关于细胞的HCV颗粒产生能力，可以使用抗构成释放到培养上清中的HCV颗粒的 蛋白、例如核心蛋白、E1蛋白或E2蛋白的抗体来检测。另外，通过使用特异性引物的RT-PCR 法扩增培养上清中的HCV颗粒所含有的HCV全基因组复制子RNA并进行检测，从而也可以 间接检测HCV颗粒的存在。
[0117] 作为所产生的HCV颗粒是否具有感染能力的评价方法，用导入了 HCV全基因组复 制子RNA或其核酸的细胞的培养上清处理HCV敏感性细胞（例如Huh7细胞），例如在48小 时后将细胞用抗核心抗体进行免疫染色，计数感染细胞数，或者使细胞提取物在SDS-聚丙 烯酰胺凝胶中电泳，通过蛋白质印迹法检测核心蛋白，由此即可进行判断。
[0118] 本发明还提供来自包含基因型3a的HCV(例如S310A株）的2个以上的丙型肝 炎病毒株的基因组的嵌合核酸。具体而言，提供包含基因型3a的S310A株的基因组序列、 S310A株的HCV基因组（SEQ ID NO: 1)以外的HCV基因组、例如各种基因型（la、lb、2a、2b、 3a、3b等）的HCV现有株或基因型3a以外的基因型的HCV的基因组序列的嵌合型HCV基因 组（嵌合HCV基因组）、嵌合型HCV亚基因组复制子RNA (嵌合HCV亚基因组复制子RNA)、 嵌合型HCV全基因组复制子RNA (嵌合HCV全基因组复制子RNA)和嵌合型HCV颗粒（嵌合 HCV颗粒）等。这里，嵌合HCV基因组和嵌合HCV全基因组复制子RNA分别是指包含2个以 上的不同株的HCV的基因组序列的HCV基因组和HCV全基因组复制子RNA，由这些嵌合HCV 基因组或嵌合HCV全基因组复制子RNA产生的HCV颗粒称作嵌合型HCV颗粒。本发明的核 酸还包含这样的嵌合HCV基因组。
[0119] 上述的嵌合HCV基因组可以是包含S310A株或S310A株突变体（导入了适应性突 变的S310A株）的非结构基因和其以外（S310A株和S310A株突变体以外）的HCV株的结 构基因的HCV的嵌合基因组。上述的嵌合HCV基因组可以具有适应性突变等的突变，还可 以使用S310A株突变体来制作。上述的嵌合HCV基因组中使用的S310A株突变体，具体而 言，在 S310A 株中包含 112861、了21884、1?2198!1、522101、了24961、1?28956或1?28951(的突变， 优选包含R2198H、S2210I或R2895K的突变。进一步具体而言，S310A株突变体可以是包含 SEQ ID N0: 49(包含S2210I的突变的全基因组核苷酸序列）、SEQ ID N0: 50(包含R2198H 的突变的全基因组核苷酸序列）或SEQ ID NO: 51 (包含R2895K的突变的全基因组核苷酸 序列）所示核苷酸序列的核酸。
[0120] 嵌合HCV基因组例如从5'侧往3'侧依次包含丙型肝炎病毒的编码核心蛋白的核 苷酸序列、编码E1蛋白的核苷酸序列、编码E2蛋白的核苷酸序列和编码p7蛋白的核苷酸 序列，而且还包含序列表的SEQ ID NO: 1中的、编码由核苷酸编号3437?5329的序列构成 的NS3蛋白的核苷酸序列、编码由核苷酸编号5330?5491的序列构成的NS4A蛋白的核苷 酸序列、编码由核苷酸编号5492?6274的序列构成的NS4B蛋白的核苷酸序列、编码由核 苷酸编号6275?7630的序列构成的NS5A蛋白的核苷酸序列和编码由核苷酸编号7631? 9406的序列构成的NS5B蛋白的核苷酸序列。
[0121] 另外，本发明的嵌合HCV基因组例如可以是核酸，所述核酸从5'侧往3'侧以编码 核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白 和NS5B蛋白的核苷酸序列的顺序包含： S310A株以外的丙型肝炎病毒的基因组（例如丙型肝炎病毒的现有株的基因组或基因 型3a以外的基因型的HCV的基因组）的编码核心蛋白的核苷酸序列、编码E1蛋白的核苷 酸序列、编码E2蛋白的核苷酸序列和编码p7蛋白的核苷酸序列； 编码由序列表的SEQ ID NO: 1的核苷酸编号2786?3436的序列构成的NS2蛋白的 核苷酸序列、编码S310A株以外的丙型肝炎病毒的基因组（例如丙型肝炎病毒的现有株的 基因组或基因型3a以外的基因型的HCV的基因组）的NS2蛋白的核苷酸序列、或编码由序 列表的SEQ ID NO: 1的核苷酸编号2786?3436的序列构成的NS2蛋白的核苷酸序列的 一部分与编码S310A株以外的丙型肝炎病毒的基因组（例如丙型肝炎病毒的现有株的基因 组或基因型3a以外的基因型的HCV的基因组）的NS2蛋白的核苷酸序列的一部分连接而 成的编码嵌合型NS2蛋白的核苷酸序列；以及 序列表的SEQ ID NO: 1中的、编码由核苷酸编号3437?5329的序列构成的NS3蛋 白的核苷酸序列、编码由核苷酸编号5330?5491的序列构成的NS4A蛋白的核苷酸序列、 编码由核苷酸编号5492?6274的序列构成的NS4B蛋白的核苷酸序列、编码由核苷酸编号 6275?7630的序列构成的NS5A蛋白的核苷酸序列和编码由核苷酸编号7631?9406的序 列构成的NS5B蛋白的核苷酸序列。
[0122] 本发明的嵌合HCV基因组在5'末端可以包含基因型3a的HCV基因组的5'非翻 译区、例如包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号1?340的核苷酸序列的5'非翻译区；取而代 之，在5'末端可以包含S310A株的HCV基因组（SEQ ID NO: 1)以外的HCV基因组、例如各 种基因型的HCV现有株的基因组或基因型3a以外的基因型的丙型肝炎病毒基因组的5'非 翻译区。
[0123] 这样的嵌合HCV基因组的例子如图16所示，例如可以列举：包含J6CF株、JFH-1 株或TH株的5'非翻译区、结构基因（核心?p7)和其NS2基因的N末端侧的一部分（例 如编码自NS2蛋白的N末端起第1?第16位的氨基酸序列的序列）、以及S310A株的NS2 基因的后续的C末端侧的序列（例如编码自NS2蛋白的N末端起第17?第217位的氨基 酸序列的序列）和NS2基因以外的非结构基因（NS3?NS5B)和3'非翻译区的嵌合HCV基 因组。这些嵌合 HCV 基因组可以包含 T1286I、T2188A、R2198H、S2210I、T2496I、R2895G 或 R2895K的突变。
[0124] 本发明还提供包含这些嵌合HCV基因组的嵌合全基因组复制子RNA。
[0125] 关于嵌合HCV基因组的制作，例如可以通过将作为S310A株突变体的基因组的 结构基因的核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白的编码序列与其他HCV株的结构基因 重组来制作。该基本技术例如记载在Wakita等人，Nature Medicine, 2005年，第11 卷，第 791-796 页；Lindenbach 等人，Science，2005 年，第 309 卷，第 623-626 页； Pietschmann等人，Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A·，2007年，第 103卷，第7408-7413 页中。
[0126] 在使用HCV株的核苷酸序列的系统分析法中，HCV被分为基因型1?基因型6这6 个类型，并进一步将各类型分为若干个亚型。作为已知的HCV的现有株的例子，具体而言， 作为基因型la的HCV株，已知有H77株（GenBank检索号AF011751);作为遗传型lb型的 HCV株，已知有J1株（GenBank检索号D89815)、Conl株（GenBank检索号AJ238799、有时还 称作 Con-1 株、coni 株）、TH 株（Wakita 等人，The Journal of Biological Chemistry, 1994年，第 269 卷，第 14205-14210 页；日本特开 2004-179 号公报）、HCV-N株（GenBank 检索号AF139594)和HCV-0株（GenBank检索号AB191333);作为基因型2a的HCV株，已知 有JFH-1株（GenBank检索号AB047639、有时还称作JFH1株）、J6CF株（GenBank检索号 AF177036)、JCH-1 株（GenBank 检索号 AB047640)、JCH-2 株（GenBank 检索号 AB047641)、 JCH-3 株（GenBank 检索号 AB047642)、JCH-4 株（GenBank 检索号 AB047643)、JCH-5 株 (GenBank检索号AB047644)和JCH-6株（GenBank检索号AB047645)。而且，作为基因型2b 的HCV株，已知有HC-J8株（GenBank检索号D01221)等；作为基因型3a的HCV株，已知有 NZL1 株（GenBank 检索号 D17763)、K3a/650 株（GenBank 检索号 D28917)、S52 株（GenBank 检索号⑶814263)等；作为基因型3b的HCV株，已知有Tr-Kj株（GenBank检索号D49374) 等；作为基因型4a的HCV株，已知有ED43株（GenBank检索号Y11604)等。关于其他株，也 已经报道了 GenBank 检索号的列表（Tokita 等人，Journal of General Virology, 1998 年，第 79 卷，第 1847-1857 页；Cristina, J. & Colina, R·，Virology Journal, 2006年，第3卷，第1-8页）。
[0127] 在一实施方式中，上述的嵌合HCV基因组是核酸，该核酸包含来自将编码来自 S310A株突变体以外的HCV株的核心蛋白、El蛋白、E2蛋白和p7蛋白、来自S310A株突变 体或S310A株突变体以外的HCV株的NS2蛋白、以及来自S310A株突变体的NS3蛋白、NS4A 蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的各核苷酸序列从5'侧往3'侧以编码核心蛋白、 E1蛋白、E2蛋白、p7蛋白、NS2蛋白、NS3蛋白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋 白的核苷酸序列的顺序配置而形成的HCV的嵌合基因。另外，上述的NS2蛋白可以是S310A 株突变体的NS2蛋白与来自S310A株及其突变体以外的HCV株的NS2蛋白的嵌合型NS2蛋 白（嵌合NS2蛋白）。这里，既是HCV的S310A株以外又是S310A株突变体以外的HCV株优 选为上述的HCV的现有株。
[0128] 这里，嵌合NS2蛋白是指，S310A株突变体的NS2蛋白的一部分氨基酸序列与来自 S310A株和S310A株突变体以外的HCV株的NS2蛋白的一部分氨基酸序列连接，整体上由 NS2的全长氨基酸序列构成的NS2蛋白。在上述嵌合HCV基因组的核酸中，NS2蛋白可以来 自S310A株突变体，或者可以是由来自S310A株突变体以外的HCV株的NS2蛋白的一部分 与来自S310A株突变体的NS2蛋白的剩余部分构成的嵌合NS2蛋白。此时，该嵌合NS2蛋 白与非嵌合的NS2蛋白具有相同的功能。例如，当来自S310A株突变体以外的HCV株的NS2 蛋白的一部分由编码NS2蛋白的N末端的氨基酸残基?第16位氨基酸残基的核苷酸序列 构成时，来自S310A株及其突变体的NS2蛋白的剩余部分由编码自N末端起第17位的氨基 酸残基?C末端的氨基酸残基的核苷酸序列构成。
[0129] 上述的嵌合HCV基因组的核酸优选进一步在上述编码核心蛋白的核苷酸序列的 5'侧包含5' UTR、以及在上述编码NS5B蛋白的区的3'侧包含3' UTR。5' UTR和/或3' UTR 只要是来自任意的HCV株的序列即可，优选为来自S310A株突变体以外的HCV株的5' UTR 和来自S310A株突变体的3' UTR。
[0130] 在上述的嵌合HCV基因组中，S310A株突变体以外的HCV株、S卩HCV的现有株优选 属于基因型la、lb或2a的株。属于基因型la的株例如包含H77株。属于基因型lb的株例 如包含TH株、Coni株、J1株和它们的衍生株。属于基因型2a的株例如包含JFH-1株、J6CF 株等。优选株为JFH-1株、J6CF株或TH株，特别优选为JFH-1株。需要说明的是，S310A株 及其突变体以外的HCV株的基因组核苷酸序列信息可以由上述的文献或GenBank获取。
[0131] 上述嵌合HCV基因组的核酸例如是来自J6CF株和S310A株的嵌合核酸，并且包含 选自T1286I、S2210I、R2198H和R2895K的至少一个突变。上述嵌合HCV基因组的核酸例如 是来自JFH-1株和S310A株的嵌合核酸，并且包含选自T1286I、S2210I、R2198H和R2895K 的至少一个突变。上述嵌合HCV基因组的核酸例如是来自TH株和S310A株的嵌合核酸，并 且包含选自T1286I、S2210I、R2198H和R2895K的至少一个突变。
[0132] 图16显示：S310A株突变体（导入了 R2198H、S2210I或R2895K的适应性突变的 S310A株）、J6CF株、JFH-1株和TH株的HCV的HCV基因组的结构、以及作为嵌合核酸的例子 的包含S310A株突变体（导入了 R2198H、S2210I或R2895K的适应性突变的S310A株）的非 结构基因和J6CF株、JFH-1株或TH株的结构基因的嵌合HCV基因组（分别为J6CF/S310A、 JFH-1/S310A、TH/S310A)的结构。在图 16 所示的嵌合核酸 J6CF/S310A、JFH-1/S310A、TH/ S310A中，5 '非翻译区与结构区相同来自HCV株（分别为J6CF株、JFH-1株或ΤΗ株），3 '非 翻译区与非结构区相同来自S310A株，NS2编码序列与结构区相同是来自HCV株（分别为 J6CF株、JFH-1株或ΤΗ株）的NS2序列与来自S310A株的NS2序列的嵌合序列。这些嵌合 核酸具有R2198H、S2210I或R2895K的适应性突变。
[0133] 本发明提供：包含上述嵌合HCV基因组的核酸的HCV病毒基因组、包含上述嵌合 HCV基因组的核酸作为病毒基因组的丙型肝炎病毒、HCV全基因组复制子RNA、表达载体或 嵌合HCV颗粒。该嵌合HCV颗粒具有下述特征：在细胞培养系统中可以高效率地产生，还具 有高感染性。
[0134] 嵌合HCV基因可以如下制作：以将各HCV基因组RNA的cDNA克隆化的载体为模 板，以合成DNA为引物进行PCR，扩增各HCV基因的必要区并连接，由此即可制得。
[0135] 而且，将嵌合HCV基因 cDNA与T7启动子等启动子的下游的适当的限制酶切位点 连接，可以制作用于合成HCV基因组RNA的表达载体。若将由该表达载体转录的RNA导入 HCV敏感性细胞（例如Huh7细胞等）中，则发生病毒的复制和包装，可以产生感染性HCV颗 粒。
[0136] 包含上述嵌合HCV基因的HCV全基因组复制子RNA在细胞内具有复制能力、或者 具有HCV颗粒产生能力、以及所产生的HCV颗粒的感染性均可通过上述方法来确认。
[0137] 本发明还提供抗丙型肝炎病毒物质的筛选方法，该筛选方法使用上述的HCV亚基 因组复制子RNA、HCV全基因组复制子RNA或丙型肝炎病毒颗粒。
[0138] 导入了上述HCV亚基因组复制子RNA的培养细胞可用于筛选抑制HCV亚基因组复 制子RNA的复制的化合物。即，在受检物质的存在下，培养导入了上述HCV亚基因组复制子 RNA的培养细胞，检测所得培养物中的复制子RNA，从而可以筛选抗HCV物质。这里，培养物 包含培养上清或细胞破碎物。这种情况下，培养物中不存在复制子RNA、或者与在受检物质 的不存在下相比少时，可以判定为上述受检物质能够抑制HCV亚基因组复制子RNA的复制。
[0139] 例如，将由从5'侧到3'侧的方向依次连接有上述S310A株或其突变体的5'非翻 译区（5'UTR)(SEQ ID N0: 2)、核心蛋白编码序列（SEQ ID N0: 3)的57个核苷酸、萤光素 酶基因 、EMCV IRES序列、NS3蛋白编码序列（SEQ ID NO: 8)、NS4A蛋白编码序列（SEQ ID NO: 9)、NS4B 蛋白编码序列（SEQ ID NO: 10)、NS5A 蛋白编码序列（SEQ ID NO: 11)、NS5B 蛋白编码序列（SEQ ID NO: 12)和3'非翻译区（3, UTR) (SEQ ID NO: 13)的RNA构成的 HCV亚基因组复制子RNA导入Huh7细胞中，接着添加受检物质，在48?72小时后测定萤光 素酶活性。关于与未添加受检物质相比能够抑制萤光素酶活性的受检物质，可以判定其具 有抑制HCV亚基因组复制子RNA的复制的作用。
[0140] 将上述HCV全基因组复制子RNA或其核酸导入培养细胞（典型的是HCV敏感性细 胞）中而得到的HCV颗粒（包含嵌合HCV颗粒），除了可用于筛选抑制HCV的感染的中和抗 体或化合物以及抑制HCV的复制的化合物外，还可适用于作为疫苗的用途、作为用于制作 抗HCV抗体的抗原的用途。
[0141] 将上述HCV颗粒用于筛选抑制HCV的感染或复制的物质时，可以列举下述方法： 在受检物质的存在下或不存在下，培养产生上述HCV颗粒的细胞、或者培养上述HCV颗粒 和HCV敏感性细胞、即培养上述HCV颗粒和HCV敏感性细胞的混合物、或者培养感染了上 述HCV颗粒的HCV感染细胞，检测所得培养物中的HCV复制子RNA或HCV颗粒。这里，检测 是指定量培养物中的HCV复制子RNA或HCV颗粒的量。此时，培养物中不存在HCV复制子 RNA和HCV颗粒、或者与在受检物质的不存在下相比少时，可以评价为上述受检物质可以抑 制HCV的感染或复制。
[0142] 具体而言，例如，在受检物质的存在下和不存在下，同时培养上述HCV颗粒和HCV 敏感性细胞，检测所得培养物中的HCV复制子RNA或HCV颗粒，判定该受检物质是否抑制 HCV复制子RNA的复制或HCV颗粒的形，从而可以筛选抗HCV物质。
[0143] 关于培养物中的HCV复制子RNA的检测，可以列举测定HCV亚基因组复制子RNA 所连接的外来基因的功能、即通过该基因的表达而表现出来的功能。例如，当外来基因为酶 时，通过计测其酶活性，可以检测HCV复制子RNA。作为其他方法，通过利用定量的RT-PCR 定量已复制的RNA的量，也可以检测HCV复制子RNA。
[0144] 检测培养物中的HCV颗粒的存在时，通过使用抗构成释放到培养上清中的HCV颗 粒的蛋白（例如核心蛋白、E1蛋白或E2蛋白）的抗体进行检测，或者用抗非结构蛋白的 抗体进行免疫染色，检测感染细胞中的非结构蛋白的存在，或者利用使用了特异性引物的 RT-PCR法扩增培养上清中的HCV颗粒所含有的HCV基因组RNA并进行检测，也可以间接检 测HCV颗粒的存在。
[0145] 另外，当筛选中使用的HCV全基因组复制子RNA包含外来基因时，具体而言，例如 可以列举：由从5'侧到3'侧的方向依次连接有S310A株突变体的HCV的5' UTR、核心蛋白 编码序列的57个核苷酸、萤光素酶基因 、EMCV IRES序列、核心蛋白编码序列、E1蛋白编码 序列、E2蛋白编码序列、p7蛋白编码序列、NS2蛋白编码序列、NS3蛋白编码序列、NS4A蛋 白编码序列、NS4B蛋白编码序列、NS5A蛋白编码序列、NS5B蛋白编码序列和3' UTR的RNA 构成的HCV全基因组复制子RNA。需要说明的是，在各核苷酸序列的连接中，在连接位点可 以包含限制酶切位点等添加序列。将上述HCV全基因组复制子RNA导入Huh7细胞中，得到 HCV颗粒，用该HCV颗粒感染HCV敏感性细胞，同时添加受检物质，在48?72小时后测定萤 光素酶的活性。关于与未添加受检物质相比抑制萤光素酶活性的物质，可以判定其具有抑 制HCV的感染的作用。在上述方法中，抗HCV物质被选择作为可以抑制病毒感染或复制的 物质。
[0146] 另外，在上述方法中，还可以使用包含上述HCV全基因组复制子RNA或其核酸的病 毒基因组、以及含有上述HCV全基因组复制子RNA或其核酸作为病毒基因组的丙型肝炎病 毒。
[0147] 而且，本发明还提供含有上述丙型肝炎病毒颗粒（HCV颗粒）的丙型肝炎病毒疫苗 (HCV疫苗）。
[0148] 作为疫苗的用途，具体而言,还可以将上述HCV颗粒或其一部分直接作为疫苗来 使用，但优选利用该领域已知的方法将其减毒或灭活后使用。病毒的灭活可以通过将福尔 马林、丙内酯、戊二醛等灭活剂例如添加混合在病毒游离液中，使其与病毒反应而达成 (Appaiahgari, Μ· B. &Vrati，S·，Vaccine, 2004 年，第 22 卷，第 3669-3675 页）。
[0149] 上述HCV疫苗可以制成溶液或悬浮液的任一种形式进行给药。或者，可以以适合 溶解或悬浮在液体中的固态物（例如冷冻干燥调整物）的形态来制备，使其在临用前可以 重新构成。这样的固态物或制备物可以乳浊、或者可以在脂质体中胶囊化。
[0150] 在HCV颗粒等活性免疫原性成分中，经常可以混合药学上可接受的、适合于活性 成分的赋形剂。在适当的赋形剂中，例如有水、生理盐水、葡萄糖、甘油、乙醇等或它们的混 合物。
[0151] 而且，如果需要，上述HCV疫苗可以含有少量的助剂（例如加湿剂或乳化剂）、pH 缓冲剂和/或提高疫苗效能的佐剂。
[0152] 佐剂是该免疫系统的非特异性刺激因子。它们会增强宿主对上述HCV疫苗的免疫 应答。因此，在优选方式中，上述HCV疫苗包含佐剂。佐剂的效能通过测定通过给予由HCV 颗粒构成的疫苗而产生的抗体量即可确定。
[0153] 对有效的佐剂的例子没有限定，包含下述佐剂：氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁 酰-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺（thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨 酰胺（CGP11637、称作nor-MDP)、N-乙酰基胞壁酰-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺酰-L-丙氨 酸-2- (Γ -2' -二棕榈酰-sn-甘油基-3-羟基磷酰氧基）-乙胺（CGP19835A、称作MTP-PE) 和RIBI。RIBI是在2%角鲨烯/Tween (注册商标）80乳剂中含有从细菌中提取的3种成分、 即单磷脂A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架（HPL+TDM+CWS)的佐剂。
[0154] 根据需要，可以在上述HCV疫苗中加入具有佐剂活性的一种以上的化合物。作为 该【技术领域】公知的佐剂的具体例子，可以列举：弗氏完全佐剂和弗氏不完全佐剂、维生素 E、非离子嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、矿物油、植物油和卡波普（Carbopol)。作为特别适 合粘膜使用的佐剂，例如可以列举大肠杆菌（E. coli)易热性毒素（LT)或霍乱（Cholera) 毒素（CT)。作为其他适当的佐剂，例如可以列举：氢氧化铝、磷酸铝或氧化铝、油性乳剂（例 如Bayol (注册商标）或Marcol 52(注册商标））、皂苷或维生素 E增溶剂。
[0155] 上述HCV疫苗通常进行胃肠外给药，例如通过皮下注射或肌肉内注射等注射进行 给药。作为适合于其他给药方式的其他处方，可以列举栓剂和某种情况下的口服处方药。
[0156] 在皮下、皮内、肌肉内、静脉内给药的注射剂中，作为与上述HCV疫苗在药学上相 容的载体或稀释剂的具体例子，可以列举：稳定化剂、碳水化合物（例如山梨醇、甘露醇、淀 粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖）、白蛋白或酪蛋白等蛋白、牛血清或脱脂乳等含蛋白的物质、以及 缓冲液（例如磷酸缓冲液）。
[0157] 作为栓剂中使用的现有的粘合剂和载体，例如可以包含聚亚烷基二醇或三甘油。 这样的栓剂可以由含有0. 5%?50%的范围、优选1%?20%的范围的活性成分的混合物形 成。口服处方药含有通常使用的赋形剂。作为该赋形剂，例如可以列举：药用级的甘露醇、 乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。
[0158] 上述HCV疫苗制成溶液、悬浮液、片剂、丸剂、胶囊剂、缓释处方药或粉末剂的形 态，含有10%?95%、优选25%?70%的活性成分（HCV颗粒或其一部分）。该HCV疫苗以适 合于给药剂型的方法、以及具有预防和/或治疗效果的量进行给药。关于应该给药的抗原 量，通常每次给药为0. 01# g?100, 〇〇〇# g的范围，但这取决于被给药的患者、该患者的免 疫系统中的抗体合成能力和所期望的防御程度。另外，还取决于口服、皮下、皮内、肌肉内、 静脉内给药途径等给药途径。
[0159] 另外，上述HCV疫苗可以按照单独给药时间表或联合给药时间表进行给药。优选 为联合给药时间表。按照联合给药时间表进行给药时，接种开始时进行1~1〇的分别给药， 接着按照维持和/或强化免疫应答所必需的时间间隔进行给药，例如作为第2次给药，可在 1~4个月后进行分别的给药。根据需要，几个月后可以继续进行给药。给药的方案也至少部 分性地根据个体的必要性来决定，取决于医生的判断。上述HCV疫苗有下述的使用方法：将 其给予健康人，在健康人体内诱导对HCV的免疫应答，对于新的HCV感染则预防性使用。而 且，该疫苗还有下述的使用方法：将疫苗给予感染了 HCV的患者，在生物体内诱导对HCV的 强免疫反应，从而用作排除HCV的治疗性疫苗。
[0160] 而且，上述HCV颗粒作为用于制作抗HCV抗体的抗原是有效的。通过将上述HCV 颗粒给予哺乳类或鸟类，可以制作抗体。作为哺乳类动物，可以列举小鼠、大鼠、兔、山羊、绵 羊、马、牛、豚鼠、单峰驼、双峰驼、大洋驼等。单峰驼、双峰驼和大洋驼适合于制作仅由Η链 构成的抗体。作为鸟类动物，可以列举鸡、鹅、鸵鸟等。可以采集给予了上述HCV颗粒的动 物的血清，按照已知的方法获得抗体。
[0161] 本发明还提供这些抗HCV抗体。优选该抗HCV抗体可以用作能够灭活HCV的中和 抗体。
[0162] 使用用上述HCV颗粒进行了免疫的动物的细胞，可以制作产生单克隆抗体产 生细胞的杂交瘤。杂交瘤的制造方法众所周知，可以采用Antibodies: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 年）中记载的方法。
[0163] 单克隆抗体产生细胞可以通过细胞融合来制作，还可以按照通过导入癌基因 DNA 或感染Epstein-Barr病毒使B淋巴细胞不死化的其他方法来制作。
[0164] 通过上述方法得到的单克隆抗体或多克隆抗体对HCV的诊断或治疗、预防有效。
[0165] 使用上述HCV颗粒作为抗原而制作的抗体，其作为药物可以和药学上可接受的溶 解剂、添加剂、稳定剂、缓冲液等同时给药。给药途径可以是任一种给药途径，但优选为皮 下、皮内、肌肉内给药，更优选静脉内给药。
[0166] 本发明还提供HCV的治疗或预防方法，该方法包括：将上述的本发明的疫苗或抗 体给予需要治疗的受检体。
[0167] 本发明还提供包含本发明的疫苗或抗体的药物组合物。该药物组合物可以包含溶 解剂、添加剂、稳定剂、缓冲液等药学上可接受的载体。 实施例
[0168] 以下，列举实施例，以更具体地说明本发明。但是，这些实施例是用于进行说明，并 不限制本发明的技术范围。
[0169] (实施例1)野生型S310A株的HCV亚基因组复制子RNA表达载体的构建 自感染了基因型3a的HCV的71岁的急性丙型肝炎患者分离HCV病毒株，命名为S310A 株。该患者在59岁时被诊断为感染了基因型3a的HCV，4年后由于肝硬化而接受了肝脏移 植。具体而言，使用Isogen-LS(Nippon Gene公司）从患者血清中提取RNA并进行纯化， 使用随机六聚体引物来合成cDNA。根据已知的4种基因型3a的HCV基因组的保守序列 (GenBank 检索号 AF046866、D28917、X76918 和 D17763)设计 PCR 引物，使用已合成的 cDNA， 分成9个片段来扩增cDNA。对于不易得到扩增产物的5'末端的序列，利用5' RACE法得到 了扩增产物。将各片段克隆到测序用克隆载体、pGEM-T EASY(Pr〇mega公司）中。利用常规 方法分析这些克隆的核苷酸序列，确定S310A株的全长基因组RNA序列。利用常规方法合 成该全长基因组RNA所对应的cDNA片段。S310A株的全长基因组RNA序列所对应的cDNA 序列见 SEQ ID NO: 1。
[0170] 使用如上操作得到的自急性丙型肝炎患者分离的、作为新的基因型3a的HCV株的 S310A株的全长基因组RNA所对应的cDNA(全长基因组cDNA; SEQ ID NO: 1)的非结构区， 如下操作，构建作为HCV亚基因组复制子RNA表达载体的质粒pS310ASGR-Neo。S310A株的 全长基因组RNA、HCV亚基因组复制子RNA表达载体pS310ASGR-Neo和由该表达载体表达的 HCV亚基因组复制子RNA的结构见图1。需要说明的是，为了与包含氨基酸突变的突变体进 行区别，在本发明中，将不包含氨基酸突变的S310A株称作野生型S310A株。
[0171] 野生型S310A株的全长基因组的核苷酸序列见SEQ ID N0: 1。另外，S310A株的 5'UTR的核苷酸序列见SEQ ID N0: 2、核心蛋白编码序列见SEQ ID NO: 3、E1蛋白编码序 列见SEQ ID NO: 4、E2蛋白编码序列见SEQ ID NO: 5、p7蛋白编码序列见SEQ ID NO: 6、 NS2蛋白编码序列见SEQ ID NO: 7、NS3蛋白编码序列见SEQ ID NO: 8、NS4A蛋白编码序列 见SEQ ID NO: 9、NS4B蛋白编码序列见SEQ ID NO: 10、NS5A蛋白编码序列见SEQ ID NO: 11、NS5B蛋白编码序列见SEQ ID NO: 12、3'UTR的核苷酸序列见SEQ ID NO: 13。需要说 明的是，SEQ ID NO: 1?13中记载着DNA序列，但在意指RNA序列时，将各SEQ ID NO所 示核苷酸序列中的胸腺嘧啶（t)理解成尿嘧啶（u)。
[0172] 由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列（野生型S310A株的全长基因组序列）编码的HCV 前体蛋白（多聚蛋白）的氨基酸序列见SEQ ID NO: 14。SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列 由SEQ ID NO: 1的核苷酸序列的核苷酸编号341?9406(包含终止密码子）编码。另外， S310A株的前体蛋白中的NS3蛋白?NS5B蛋白的区的氨基酸序列见SEQ ID N0: 15。该 SEQ ID NO: 15的氨基酸序列（NS3?NS5B区）对应于SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列的 氨基酸第1033位?第3021位。
[0173] HCV亚基因组复制子RNA表达载体pS310ASGR_Neo的构建，根据Kato等人的文献 (Gastroenterology, 2003年，第 125卷，第 1808-1817 页）和国际公开第 04/104198 号 中所示的程序进行。
[0174] 具体而言，首先，将野生型S310A株的全长基因组RNA(图1A)的cDNA在T7启动 子的控制下插入质粒载体pUC19中，制作重组质粒pS310A。接着，用新霉素抗性基因（neo: 还称作新霉素磷酸转移酶基因）和EMCV IRES(脑心肌炎病毒的内部核糖体结合位点）取 代重组质粒PS310A的结构区（编码核心蛋白、E1蛋白、E2蛋白和p7蛋白）和非结构区 的一部分，从而构建质粒pS310ASGR-Neo。将其命名为HCV亚基因组复制子RNA表达载体 pS310ASGR-Neo。
[0175] 图1B显示HCV亚基因组复制子RNA表达载体pS310ASGR-Neo的结构。在表达载 体pS310ASGR-Neo中，5' UTR、自核心蛋白编码序列的N末端起57个核苷酸（HCV IRES)、 NS3?NS5B蛋白编码序列和3'UTR是来自S310A株的序列。图中，"T7"是指T7启动子。 17启动子是使用T7 RNA聚合酶由各表达载体转录HCV亚基因组复制子RNA所必需的序列 元件。"neo"表示新霉素抗性基因 ，"EMCV IRES"表示脑心肌炎病毒的内部核糖体结合位 点。"C"表示核心蛋白编码序列、"E1"表示E1蛋白编码序列、"E2"表示E2蛋白编码序列、 "P7"表示p7蛋白编码序列、"NS2"表示NS2蛋白编码序列、"NS3"显示NS3蛋白编码序列、 "4A"显示NS4A蛋白编码序列、"4B"显示NS4B蛋白编码序列、"NS5A"显示NS5A蛋白编码 序列、以及"NS5B"显示NS5B蛋白编码序列。如图1C所示，由表达载体pS310ASGR-Neo制 作的HCV亚基因组复制子RNA(S310A株的HCV亚基因组复制子RNA)是转录了 T7启动子下 游的区的RNA。另夕卜，图中的'?coRI"、"PmeI"、"SnaBI"和"XbaI"表示限制酶切位点。需 要说明的是，在图9、10、12、14、16中，图中的书写也相同。
[0176] 表达载体pS310ASGR-Neo在T7启动子的下游连接有S310A亚基因组复制子RNA 的cDNA。S310A株的HCV亚基因组复制子RNA的cDNA核苷酸序列见SEQ ID NO: 16。
[0177] (实施例2)野生型S310A株的HCV亚基因组复制子RNA的制作 用限制酶Xbal切断实施例1中构建的表达载体pS310ASGR-Neo。接着，在10?20// g 的Xbal切断片段中加入20U绿豆核酸酶（总反应液量为50// L)，在30°C下培养30分钟。 绿豆核酸酶是催化选择性地分解双链DNA中的单链部分使其变得平滑的反应的酶。通常， 直接使用上述Xbal切断片段作为模板DNA，利用RNA聚合酶进行RNA转录时，合成在3'末 端过剩地添加有作为Xbal的识别序列的一部分的CUAG这4个核苷酸的复制子RNA。因此， 在本实施例中，通过用绿豆核酸酶处理Xbal切断片段，从Xbal切断片段中除去CTAG这4 个核苷酸。
[0178] 之后，对于包含Xbal切断片段的绿豆核酸酶处理后的溶液，通过进行按照常规方 法的蛋白除去处理，纯化除去了 CTAG这4个核苷酸的Xbal切断片段，将其作为之后的反应 中使用的模板DNA。使用Ambion公司的MEGAscript (注册商标），通过利用T7启动子的转 录反应，在体外由该模板DNA合成RNA。具体而言，根据制造商的使用说明书调制20//L包 含0. 5?1. 0// g模板DNA的反应液，使其在37°C下反应3小时?16小时。
[0179] RNA合成结束后，在反应溶液中添加2U DNase I，在37°C下反应15分钟，从而除去 模板DNA，再利用酸性苯酚进行RNA提取，从而获得由pS310ASGR-Neo转录的野生型S310A 株的HCV亚基因组复制子RNA(图1C) (SEQ ID N0: 16)。
[0180] (实施例3) S310A株的HCV亚基因组复制子复制细胞克隆的建立 利用电穿孔法将实施例2中制作的野生型S310A株的HCV亚基因组复制子RNA(1// g、 3//g、10//g或30//g)导入Huh7细胞中。将进行了电穿孔处理的Huh7细胞（3 X106个） 接种在培养皿中，培养16小时?24小时后，向培养皿中添加 G418 (新霉素）。之后，每周交 换2次培养液，同时继续培养。
[0181] 自接种时起培养21天后，用结晶紫将活细胞染色。其结果，关于导入了 10//g和 30// g的S310A株的HCV亚基因组复制子RNA的细胞，可以确认到集落形成（图2)。集落 形成表示在该细胞中HCV亚基因组复制子RNA被复制。其结果显示出：使用野生型S310A 株的基因组非结构区制作的HCV亚基因组复制子RNA在培养细胞中具有自主复制能力。
[0182] 关于确认到集落形成的、导入了上述HCV亚基因组复制子RNA的细胞，由上述的培 养21天后的培养皿进一步克隆活细胞的集落，继续培养。通过这样的集落的克隆，可以建 立10株细胞克隆。将这些细胞克隆命名为S310A亚基因组复制子复制细胞，另外，给各克 隆附上克隆编号（编号：1?10)。在如此操作而建立的细胞克隆中，导入的S310A株的HCV 亚基因组复制子RNA正在进行自主复制。
[0183] (实施例4) S310A亚基因组复制子复制细胞内的HCV亚基因组复制子RNA的拷贝 数的定量 使用建立的10个克隆（克隆编号：1?10)的S310A亚基因组复制子复制细胞，定量细 胞内的HCV亚基因组复制子RNA的拷贝数。HCV亚基因组复制子RNA的拷贝数的定量根据 Takeuchi 等人的文献（Gastroenterology, 1999 年，第 116 卷，第 636-642 页）和 Kato 等人的文献（Gastroenterology, 2003年，第125卷，第1808-1817页）中所示的方法 进行。
[0184] 该方法是使用 TaqMan 探针法（Parkin Elmer 公司，Applied Biosystems 公司） 的检测系统。具体而言，首先，利用常规方法从S310A亚基因组复制子复制细胞中提取总 RNA。接下来，使用rTth DNA聚合酶，由总RNA合成cDNA，以所合成的cDNA为模板，使用引 物5，-CGGGAGAGCCATAGTGG-3，（SEQIDN0:24)和5，-AGTACCACAAGGCCTTTCG-3，（SEQID N0:25)进行PCR扩增。此时，加入具有核苷酸序列5'-CTGCGGAACCGGTGAGTACAC-3'（SEQ ID NO: 26)、且在其5'末端结合有作为荧光色素的6' -羧基-荧光素（FAM)、在3'末端结 合有作为猝灭剂的6'-羧基-四甲基-罗丹明（TAMRA)的探针。若该探针存在，则在扩增过 程中利用Taq聚合酶的5'核酸外切酶活性，与模板cDNA杂交的探针被分解，荧光色素从探 针中游离出来，猝灭剂所产生的抑制被解除，发出荧光。因此，使用ABI Prism 7700 (Parkin Elmer公司、Applied Biosystems公司）检测该荧光，定量HCV亚基因组复制子RNA的拷贝 数。
[0185] 作为比较对照，使用导入了基因型2a的JFH-1株的HCV亚基因组复制子RNA的细 胞（JFH-1亚基因组复制子复制细胞）。需要说明的是，JFH-1株的HCV亚基因组复制子RNA 表达载体（其结构从5'侧往3'侧依次包含JFH-1株的HCV的5'非翻译区（5' UTR)、核心 蛋白编码区的5'末端的57个核苷酸的序列、新霉素抗性基因 、EMCV IRES序列、编码NS3蛋 白、NS4A蛋白、NS4B蛋白、NS5A蛋白和NS5B蛋白的核苷酸序列、以及3'非翻译区（3'UTR)) 的构建和HCV亚基因组复制子RNA的制作根据Kato等人的文献（Gastroenterology, 2003 年，第125卷，第1808-1817页）和国际公开第04/104198号中记载的方法实施。Huh7 细胞中的导入和拷贝数定量按照与上述相同的方法进行。
[0186] 定量结果见图3。图的横轴的数字表示S310A亚基因组复制子复制细胞克隆的克 隆编号。另外，纵轴表示每1# g的细胞的总RNA在细胞内的HCV亚基因组复制子RNA的拷 贝数。需要说明的是，棒图上部的数值表示各细胞内的HCV亚基因组复制子RNA的拷贝数。
[0187] 其结果，在建立的10个克隆的S310A亚基因组复制子复制细胞中，检测到与JFH-1 亚基因组复制子复制细胞同等或其以上的RNA拷贝数。显示出：来自S310A株的HCV亚基 因组复制子RNA具有与JFH-1株的HCV亚基因组复制子RNA几乎同等或其以上的复制能力。
[0188] (实施例5)抗病毒药对S310A亚基因组复制子复制细胞中的复制子RNA复制的 效果 研究抗病毒药对建立的S310A亚基因组复制子复制细胞（克隆）中的复制子RNA复制 的效果。
[0189] 将S310A亚基因组复制子复制细胞（克隆）和JFH-1亚基因组复制子复制细胞接 种在24孔板中，使达到每孔5 X 104个细胞，第二天，向孔中分别添加干扰素 -a (IFN-〃）、 作为NS3蛋白酶抑制剂的VX-950 (特拉匹韦（telaprevir)) (Lin等人，Journal of Biological Chemistry, 2004年，第 279 卷，第 17508-17514页）和BILN-2061(Daniel 等人，Nature, 2003年，第426卷，第186-189页）、以及作为NS5B聚合酶抑制剂的 JTK-109 (Hirashima 等人，Journal of Medicinal Chemistry, 2006 年，第 49 卷，第 4721-4736 页）和PSI-6130 (Clark 等人，Journal of Medicinal Chemistry, 2005 年， 第48卷，第5504-5508页），使之作用3天。之后，回收细胞，提取总RNA，按照与实施例4 相同的方法定量细胞内的HCV亚基因组复制子RNA的拷贝数。
[0190] 其结果见图4?8。图的横轴表示添加的抑制剂的浓度。另外，纵轴表示HCV RNA 量的变化率，其表示以未添加抑制剂时（〇 IU或0 M)的每1// g细胞的总RNA的亚基因组 复制子RNA量为100%时，添加了抑制剂时的亚基因组复制子RNA量的比率（%)。关于各抑 制剂浓度，棒图的最左的条（白）表示JFH-1亚基因组复制子复制细胞中的结果，左起第 二位的条（亮灰色）表示S310A亚基因组复制子复制细胞克隆6中的结果，左起第三位的 条（黑）表示S310A亚基因组复制子复制细胞克隆9中的结果，最右的条（暗灰色）表示 S310A亚基因组复制子复制细胞克隆10中的结果。
[0191] 使IFN-α作用的结果显示出JFH-1和S310A亚基因组复制子RNA在细胞内的RNA 复制被IFN- a显著抑制（图4)。
[0192] 另一方面，关于作为NS3蛋白酶抑制剂的VX-950和BILN-2061，确认到对JFH-1亚 基因组复制子的复制抑制作用，但没有抑制S310A亚基因组复制子的复制（图5、6)。由此 暗示：基因型3a的NS3蛋白酶不同于基因型2a的NS3蛋白酶，其没有被现有NS3蛋白酶抑 制剂抑制。
[0193] 另外，使作为NS5B聚合酶抑制剂的JTK-109和PSI-6130作用的结果，JFH-1亚基 因组复制子没有受到JTK-109所带来的RNA复制抑制，但在S310A亚基因组复制子中，通过 JTK-109分别确认到显著的RNA复制抑制（图7)。另一方面，使PSI-6130作用时，JFH-1和 S310A亚基因组复制子的RNA复制均浓度依赖性地受到抑制（图8)。
[0194] 以上显示出：本发明的基因型3a的亚基因组复制子适合作为评价抑制基因型3a 复制的药物的工具。
[0195] 另外，还显示出：来自基因型3a的HCV株的亚基因组复制子的复制能力受到不同 于来自基因型2a的HCV株的亚基因组复制子的复制能力的因素的影响。这并非是指本发 明的限定性的解释，认为在基因型3a和2a中由HCV基因组编码的聚合酶的结构不同，其结 果，药物化合物的效果也不同。
[0196] (实施例6) S310A亚基因组复制子复制细胞内的HCV亚基因组复制子RNA的序列 分析 进行实施例3中建立的S310A亚基因组复制子复制细胞（克隆）内存在的HCV亚基因 组复制子RNA的序列分析。
[0197] 首先，从建立的10个克隆和进一步添加的1个克隆共计11个克隆的S310A亚基 因组复制子复制细胞中提取总RNA，利用RT-PCR法扩增其中所含的HCV亚基因组复制子 RNA。在以由HCV亚基因组复制子RNA通过逆转录合成的cDNA为模板的PCR扩增中，使用 5, -TAATACGACTCACTATAG-3'（SEQ ID N0: 27)和 5, -GCGGCTCA CGGACCTTTCAC-3,（SEQ ID NO: 28)作为引物。将PCR扩增产物克隆到测序用克隆载体中，利用常规方法进行序列分 析。
[0198] 序列分析的结果，由S310A亚基因组复制子复制细胞内的HCV亚基因组复制子RNA 鉴定的适应性突变见表1。
[0199] [表 1]
【权利要求】
1. 核酸，该核酸依次包含：基因型3a的丙型肝炎病毒基因组的、包含SEQ ID NO: 1 的核苷酸编号1?340的核苷酸序列的5'非翻译区、编码SEQ ID NO: 14的氨基酸编号 1033?1663的NS3蛋白的氨基酸序列、氨基酸编号1664?1717的NS4A蛋白的氨基酸序 列、氨基酸编号1718?1978的NS4B蛋白的氨基酸序列、氨基酸编号1979?2430的NS5A 蛋白的氨基酸序列和氨基酸编号2431?3021的NS5B蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列、以 及包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号9407?9655的核苷酸序列的3'非翻译区，其中，当该 核酸为RNA时，将核苷酸序列中的胸腺嘧啶（t)理解成尿嘧啶（u)。
2. 权利要求1所述的核酸，其中， 上述编码NS3蛋白的的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号 3437?5329的核苷酸序列， 上述编码NS4A蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号 5330?5491的核苷酸序列， 上述编码NS4B蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号 5492?6274的核苷酸序列， 上述编码NS5A蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号 6275?7630的核苷酸序列， 上述编码NS5B蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号 7631?9406的核苷酸序列。
3. 权利要求1或2所述的核酸，其中，上述5'非翻译区在SEQ ID NO: 1的核苷酸编号 1?340的核苷酸序列中包含1个或多个核苷酸的缺失、取代或添加。
4. 核酸，该核酸是在权利要求1?3中任一项所述的核酸的核苷酸序列中具有核苷 酸突变的核酸，以SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列为基准时，该核苷酸突变包括引起下述 (a)?（g)的至少一个氨基酸取代的核苷酸突变： (a) 第1286位的苏氨酸取代成异亮氨酸， (b) 第2188位的苏氨酸取代成丙氨酸， (c) 第2198位的精氨酸取代成组氨酸， (d) 第2210位的丝氨酸取代成异亮氨酸， (e) 第2496位的苏氨酸取代成异亮氨酸， (f) 第2895位的精氨酸取代甘氨酸， (g) 第2895位的精氨酸取代成赖氨酸。
5. 权利要求1?4中任一项所述的核酸，该核酸进一步包含丙型肝炎病毒基因组的、编 码核心蛋白的核苷酸序列、编码E1蛋白的核苷酸序列、编码E2蛋白的核苷酸序列、编码p7 蛋白的核苷酸序列和编码NS2蛋白的核苷酸序列。
6. 权利要求5所述的核酸，其中， 编码核心蛋白的核苷酸序列为编码SEQ ID NO: 14的氨基酸编号1?191的核心蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列， 编码E1蛋白的核苷酸序列为编码SEQ ID NO: 14的氨基酸编号192?383的E1蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列， 编码E2蛋白的核苷酸序列为编码SEQ ID NO: 14的氨基酸编号384?752的E2蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列， 编码P7蛋白的核苷酸序列为编码SEQ ID NO: 14的氨基酸编号753?815的p7蛋白 的氨基酸序列的核苷酸序列， 编码NS2蛋白的核苷酸序列为编码SEQ ID NO: 14的氨基酸编号816?1032的NS2 蛋白的氨基酸序列的核苷酸序列。
7. 权利要求5所述的核酸，该核酸包含SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO: 49?SEQ ID NO: 51中的任一个所不的核苷酸序列。
8. 权利要求4所述的核酸，该核酸包含SEQ ID NO: 17?SEQ ID NO: 23和SEQ ID NO: 54中的任一个所不的核苷酸序列。
9. 丙型肝炎病毒的亚基因组复制子RNA，其包含权利要求1?4和8中任一项所述的 核酸。
10. 丙型肝炎病毒的全基因组复制子RNA，其包含权利要求5?7中任一项所述的核 酸。
11. 丙型肝炎病毒颗粒，其含有权利要求5?7中任一项所述的核酸作为病毒基因组。
12. 细胞，该细胞中导入有权利要求1?8中任一项所述的核酸。
13. 丙型肝炎病毒疫苗，该疫苗含有权利要求11所述的丙型肝炎病毒颗粒或其一部 分。
14. 丙型肝炎病毒的抗体，该抗体将权利要求11的丙型肝炎病毒颗粒为抗原识别。
15. 筛选抗丙型肝炎病毒物质的方法，该方法包括下述步骤： 培养步骤，在受检物质的存在下和不存在下，培养权利要求12所述的细胞、或权利要 求11所述的丙型肝炎病毒颗粒和丙型肝炎病毒敏感性细胞的混合物； 定量步骤，定量上述培养步骤中在培养物中得到的亚基因组复制子RNA、全基因组复制 子RNA或丙型肝炎病毒颗粒的量；以及 评价步骤，上述定量步骤的结果，当在受检物质的存在下培养的培养物中定量到的亚 基因组复制子RNA、全基因组复制子RNA或丙型肝炎病毒颗粒的量分别少于在上述受检物 质的不存在下培养的培养物中定量到的亚基因组复制子RNA、全基因组复制子RNA或丙型 肝炎病毒颗粒的量时，评价为上述受检物质具有抗丙型肝炎病毒活性。
16. 权利要求5所述的核酸，其中，上述核酸为来自2个以上的丙型肝炎病毒株的基因 组的嵌合核酸，其从5'侧往3'侧依次包含： SEQ ID NO: 1的丙型肝炎病毒基因组以外的丙型肝炎病毒基因组的编码核心蛋白的 核苷酸序列、编码E1蛋白的核苷酸序列、编码E2蛋白的核苷酸序列和编码p7蛋白的核苷 酸序列； 编码由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号2786?3436的序列构成的NS2蛋白的核苷酸序 列、编码SEQ ID NO: 1的丙型肝炎病毒基因组以外的丙型肝炎病毒基因组的NS2蛋白的 核苷酸序列、或编码由SEQ ID NO: 1的核苷酸编号2786?3436的核苷酸序列构成的NS2 蛋白的核苷酸序列的一部分与编码SEQ ID NO: 1的丙型肝炎病毒基因组以外的丙型肝炎 病毒基因组的NS2蛋白的核苷酸序列的一部分连接而成的编码嵌合型NS2蛋白的核苷酸序 列；以及 SEQ ID NO: 1中的、编码由核苷酸编号3437?5329的序列构成的NS3蛋白的核苷 酸序列、编码由核苷酸编号5330?5491的序列构成的NS4A蛋白的核苷酸序列、编码由核 苷酸编号5492?6274的序列构成的NS4B蛋白的核苷酸序列、编码由核苷酸编号6275? 7630的序列构成的NS5A蛋白的核苷酸序列和编码由核苷酸编号7631?9406的序列构成 的NS5B蛋白的核苷酸序列。
17. 核酸，该核酸是在权利要求16所述的核酸的核苷酸序列中具有核苷酸突变的核 酸，以SEQ ID NO: 14所示氨基酸序列为基准时，该核酸具有引起下述（a)?（g)中的至少 一个氨基酸取代的核苷酸突变： (a) 第1286位的苏氨酸取代成异亮氨酸， (b) 第2188位的苏氨酸取代成丙氨酸， (c) 第2198位的精氨酸取代成组氨酸， (d) 第2210位的丝氨酸取代成异亮氨酸， (e) 第2496位的苏氨酸取代成异亮氨酸， (f) 第2895位的精氨酸取代成甘氨酸， (g) 第2895位的精氨酸取代成赖氨酸。
18. 权利要求16或17所述的核酸，该核酸包含SEQ ID NO: 1的丙型肝炎病毒基因组 以外的丙型肝炎病毒基因组的5'非翻译区，以代替上述包含SEQ ID NO: 1的核苷酸编号 1?340的核苷酸序列的5'非翻译区。
19. 丙型肝炎病毒的嵌合全基因组复制子RNA，其包含权利要求16?18中任一项所述 的核酸。
【文档编号】C12Q1/02GK104126008SQ201280042305
【公开日】2014年10月29日 申请日期:2012年8月31日 优先权日:2011年8月31日
【发明者】胁田隆字, M.萨伊德, P.莫雷, C.冈迪奧, 横川宽 申请人:日本国立感染症研究所, 法国国家健康和医学研究所, 东丽株式会社