一种双酶梭菌z-13及其应用
【技术领域】
[0001 ] 本发明涉及一种双酶梭菌Z_13(Clostridium bifermentans)及其应用，属于微生 物发酵技术领域。
【背景技术】
[0002] 由于抗生素菌渣对生态环境和人类健康存在潜在危害性，国家已将其明确列为危 险废物，禁止用于饲料和肥料。抗生素菌渣如按危险废物处置，所产生的高额处置费用将使 企业无法承受。另一方面，抗生素菌渣含水率一般在70 %~93 %，干基中含有大量的菌体蛋 白（约40%以上）、粗脂肪（约2~20%)、多糖（约10%以上）、多种氨基酸（如天门冬氨酸、谷氨 酸、缬氨酸、白氨酸等）、微量元素及培养基残留物等营养物质。如果直接丢弃，不仅会造成 极大的资源浪费，而且由于其极易腐败，引发严重的环境污染。
[0003] 抗生素菌渣含有丰富的有机物质，是厌氧发酵的优良原料。厌氧发酵技术也是抗 生素菌渣无害化、资源化处理的一种有效途径。但是抗生素菌渣厌氧发酵系统运行有机负 荷偏低，处理能力与产生量严重不匹配，远不能满足处理需求。投加高效功能微生物是提高 有机废弃物厌氧发酵效率的有效方法，筛选能够高效降解抗生素菌渣的微生物是其关键所 在。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于提供一种编号为Z-13的双酶梭菌，其代谢产物具有降解蛋白的 能力，并且该菌可利用多种物质产挥发性有机酸，如乙酸、丁酸等。另一方面本发明还提供 了上述菌株的用途。
[0005] 为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为： 本发明的双酶梭菌Z-13于2015年10月30日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微 生物菌种保藏中心进行了保藏，保藏号为:CGMCC No. 11561。
[0006] 进一步的，本发明的双酶梭菌Z-13合成蛋白酶，具有降解蛋白质能力。
[0007] 进一步的，本发明的双酶梭菌Z-13能利用碳源产乙酸。
[0008] 进一步的，所述碳源优选葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、淀粉、丙酸钠或丁酸钠。
[0009] 本发明还提供了所述双酶梭菌Z-13的应用，用于含蛋白有机废弃物处理。
[0010] 进一步的，本发明的双酶梭菌Z-13应用于抗生素菌渣厌氧发酵、沼气发酵或含蛋 白有机废水处理。
[0011] 进一步的，本发明的双酶梭菌Z-13应用于抗生素菌渣厌氧发酵、沼气发酵或含蛋 白有机废水处理时菌液的接种量为1~20%(菌液与接种后料液的体积比），且双酶梭菌Z-13 菌的含菌量不低于1〇 8个/mL。
[0012] 本发明所述的双酶梭菌Z-13(CGMCC No. 11561)，在LB培养基上生长，菌落圆形、 乳白色、四周光滑、湿润、不透明、菌落边缘整齐。菌体杆状，革兰氏阳性、形成芽孢，严格厌 氧生长。VP试验阴性，可使明胶液化，水解酪蛋白，水解淀粉，硝酸盐还原和H 2S产生实验 阴性，吲哚实验阳性。
[0013] 本发明所述的双酶梭菌Z-13适宜生长温度为25~35 °C，pH值为6.8~7.5。
[0014]本发明的双酶梭菌Z-13在常温和中温条件下，可提高抗生素菌渣沼气产量30%以 上。其次，本发明的双酶梭菌Z-13,可利用多种底物产生蛋白酶、挥发性有机酸，显著提高含 多种有机混杂底物的降解效率。再者，本发明的双酶梭菌Z-13除用于抗生素菌渣厌氧发酵 外，还可有效提高其他含蛋白的废弃物或废水厌氧发酵水解及产沼气效率。本发明的实现， 不仅可以有效提高抗生素菌渣厌氧发酵效率，而且对促进有机废弃物无害化、资源化和能 源化利用有重要意义，有着切实的经济、社会效益和广阔的应用前景。
[0015] 生物样品保藏信息 双酶梭菌2-13，分类命名为01〇81：1^(1;[1111113丨€61'11161^3118，已于2015年10月30日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址:北京市朝阳区北辰西 路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，菌种保藏号为CGMCC No. 11561。
【附图说明】
[0016] 图1为本发明双酶梭菌Z-13的系统发育树。
【具体实施方式】
[0017] 实施例1双酶梭菌Z-13分离和保藏 双酶梭菌Z-13是从石家庄市某污水处理厂厌氧污泥中，通过富集培养、传代、梯度稀释 方法分离获得。
[0018] 具体方法是:从石家庄某污水处理厂取厌氧污泥，取少量污泥放到装有富集培养 基的厌氧瓶中，35 °C富集培养。传代稳定后，采用改良Hungate滚管技术，用蛋白酶产生菌 初筛培养基进行分离筛选，35 °C培养48~72 h，挑选透明圈直径(D)与菌落直径(d)之比D/ d值较大的菌落，接种于LB培养基，4 °C保存备用。
[0019] 通过酶活测定法进行复筛。将分离得到的菌株接到LB液体培养基中，于35 °C培养 箱培养48~72 h，发酵液在温度4 °C，转速8000 r/min下离心10 min，取上清液测定蛋白 酶活力。测定方法采用国标GB/T 23527-2009(蛋白酶测定方法）。获得菌株Z-13的蛋白酶 活力达25~3〇 u/mL。
[0020] 采用培养基： (1)富集培养基(g/L):胰蛋白胨2.5,酪蛋白3,酵母提取物5,蛋白胨2.5，L-半胱氨 酸盐酸盐〇.5，NaCl 5，KH2P〇4l，MgS〇4 0.5,0.1%的刃天青指示剂2滴，去离子水定容，pH值 7.0~7.2〇
[0021] (2)蛋白酶初筛培养基(g/L):脱脂奶粉10,琼脂粉15,去离子水定容，pH 7.0~ 7.2。
[0022] (3)LB培养基(g/L):酵母提取物5,胰蛋白胨10,氯化钠10,琼脂15,去离子水定容， pH 7.0~7.4〇
[0023]该菌株Z-13,在LB培养基上生长，菌落圆形、乳白色、四周光滑、湿润、不透明、菌落 边缘不整齐。菌体杆状，革兰氏阳性、形成芽孢，严格厌氧生长。VP试验阴性，可使明胶液 化，水解酪蛋白和淀粉，硝酸盐还原和H 2S产生实验阴性，吲哚实验阳性。可利用葡萄糖、麦 芽糖、蔗糖、乳糖产酸产H2。
[0024] 菌株16S rDNA序列分析:选取处于对数生长期的菌液，用天根公司细菌基因组DNA 提取试剂盒提取菌株基因组DNA，以其为模板，进行PCR扩增。
[0025] 扩增引物为细菌通用引物： 正向引物为Pf: 5'-AGAGTTTGACC TG