生产肉毒杆菌毒素的方法
生产肉毒杆菌毒素的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生产肉毒杆菌毒素的方法，更具体地涉及一种用于制备肉毒杆菌毒素 的方法，该方法包括步骤：(a)用酸处理肉毒杆菌毒素生产株的培养物，以沉淀肉毒杆菌毒 素；(b)向沉淀的肉毒杆菌毒素中加入缓冲液，接着用蛋白酶抑制剂和核酸酶处理，从而提 取肉毒杆菌毒素；（C)用酸处理提取出的肉毒杆菌毒素以沉淀肉毒杆菌毒素并在缓冲液中 溶解沉淀物；和（d)通过阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素。
【背景技术】
[0002] 自19世纪90年代已发现各种分泌神经毒素的梭菌属（Clostridium sp.) 的菌株，并且在过去的70年已对从这些菌株分泌的毒素进行了表征（Schant，E. J.et al.，Microbiol. Rev.，56:80, 1992)。
[0003] 源自梭菌属菌株的神经毒素，即肉毒杆菌毒素，根据它们的血清学性质被分为 七种类型（类型A至G)。每种毒素具有约150KDa大小的毒素蛋白并且天然含有几种 非毒性蛋白的复合物。中等复合物（300kDa)由毒素蛋白和无毒的非血凝素蛋白组成， 大复合物（450kDa)和非常大的复合物（900kDa)由结合到血凝素的中等复合物组成 (Sugiyama, H.，Microbiol. Rev.，44:419, 1980)。已知这种非毒性的血凝素蛋白是用于保护 毒素免受肠道内的低PH值和各种蛋白酶的作用。
[0004] 在细胞中，毒素被合成为具有约150kDa的分子量的单个多肽，然后通过胞内蛋白 酶作用或用人造酶如胰蛋白酶处理，在从N-末端开始的1/3位置裂解成两个单位：轻链 (L ;分子量：50kDa)和重链（H ;分子量：100kDa)。相比于单个多肽，裂解的毒素具有大大 增加的毒性。两个单位通过二硫键彼此连接并具有不同的功能。重链结合至靶细胞的受体 (Park. Μ. K.，et al·，FEMS Microbiol. Lett. ,72:243,1990)并用于在低 pH 值（pH 4)与生 物膜相互作用，以形成通道（Mantecucco, C. et al.，TIBS.，18:324, 1993)，轻链具有药理活 性，因此通过例如电穿孔导入细胞时，利用洗涤剂赋予细胞渗透性或干扰神经递质的分泌 (Poulain, B. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 85:4090, 1988) 〇
[0005] 毒素在神经肌肉接头的胆碱能神经突触前处抑制乙酰胆碱的胞吐作用，造成乏 力。已认为用非常少量的毒素进行处理展现毒性，这表明毒素具有任何酶活性（Simpson，L. L. et al.，Ann. Rev. Pharmaeol. Toxicol.，26:427, 1986) 〇
[0006] 根据最近的报道，毒素具有金属肽酶活性，并且其底物由小突触、突触融合蛋白、 25KDa的突触相关蛋白（SNAP25)等组成，它们是胞吐机械复合物的单位蛋白。每种类型的 毒素使用上述三种蛋白质之一作为底物，并且已知B、D、F和G型毒素在特定位点裂解小突 触，A型和E型毒素在特定位点裂解SNAP25,和C型在特定位点裂解突触融合蛋白（Binz，T. et al.，J. Biol. Chem.，265:9153, 1994) 〇
[0007] 特别是，已知A型肉毒杆菌毒素可溶于pH为4. 0-6. 8的稀释水溶液。已知稳定的 非毒性蛋白质在PH大约为7或更高时从神经毒素中分离，并且结果是，毒性逐渐丧失。特 别是，已知毒性随pH和温度的增加而减少。
[0008] 肉毒杆菌毒素即使少量对人体也是致命的并且易于大量产生。因此，它与炭疽杆 菌、鼠疫和天花病毒一起构成四大生物恐怖武器。然而发现，当A型肉毒杆菌毒素在以不全 身影响人体的剂量注射时，它可以在注射部位使局部肌肉麻痹。根据这个特点，A型肉毒杆 菌毒素可以在广泛的应用中使用，包括除皱纹药剂，治疗痉挛性偏瘫和脑瘫的药剂等。因此 对于A型肉毒杆菌毒素的需求增加，并且已积极地进行对生产肉毒杆菌毒素以满足该需求 的方法的研究。
[0009] 目前典型的商品化产品是购自美国Allergan公司的BOTOX? (纯化的A型肉 毒杆菌毒素的神经毒素复合物）。100单位小瓶的BOTOX?由约5ng的纯化的A型肉毒杆 菌毒素的神经毒素复合物，〇. 5mg人血清白蛋白和0. 9mg氯化钠组成并且用不含防腐剂的 无菌盐水（注射0.9 %氯化钠）重构。其他商品化产品包括购自Ipsen Ltd.，UK, MyoBloc? 的:Dysport⑩（A型肉毒杆菌毒素和血凝素的复合物，其在含有肉毒杆菌毒素的药物组 合物中具有乳糖和人血清白蛋白并在使用前用〇. 9%氯化钠重构），（可注射溶液（pH 约5. 6)，包含B型肉毒杆菌毒素、人血清白蛋白、琥珀酸钠和氯化钠），购自Solstice Neurosciences，Inc.。常规用于生产肉毒杆菌毒素的方法包括酸沉淀法、盐沉淀法和色谱 法。
[0010] 例如，日本专利公开号1994-192296公开了一种通过培养肉毒梭菌细菌，接着进 行酸沉淀，提取，添加核酸酶和结晶来生产结晶A型肉毒杆菌毒素的方法。此外，美国专利 5696077公开了一种通过培养肉毒梭菌细菌，接着进行酸沉淀，提取，离子交换色谱，凝胶过 滤色谱和结晶来生产结晶B型肉毒杆菌毒素的方法。
[0011] Simpson等人通过重力流色谱，随后通过HPLC，使用亲和树脂、大小排阻色谱，和 包括使用两种不同的离子交换柱的离子（阴离子和阳离子）交换色谱的捕获来纯化肉毒神 经毒素，生产A型肉毒杆菌毒素 （Method in Enzymology, 165:76, 1988)，王等人使用沉淀和 离子色谱来纯化A型肉毒杆菌毒素 （Dermatol Las Faci Cosm Surg. ,2002:58, 2002)。
[0012] 此外，美国专利6818409公开了使用离子交换和乳糖柱纯化肉毒杆菌毒素，和美 国专利号7452697公开了一种通过离子交换色谱和疏水色谱的A型肉毒杆菌毒素。韩国专 利公开号2009-0091501公开了通过酸沉淀和阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素的方法， 以及美国公开号2013-0156756公开了通过阴离子交换色谱和阳离子交换色谱纯化肉毒杆 菌毒素的方法。
[0013] 然而，传统方法的问题在于使用阴离子交换色谱不利地影响肉毒杆菌毒素的凝胶 条带图案（美国专利号7452697)，并且问题还在于这些常规方法由于纯化时间长而难以商 业上应用。另外，由于作为肉毒杆菌毒素生产菌株的肉毒杆菌是一种厌氧细菌，存在着细菌 发酵应在厌氧系统中执行的问题，因此难以大量生产肉毒杆菌毒素。此外，存在着通过上述 纯化方法纯化的活性成分肉毒杆菌毒素并未清楚地分离和鉴定的问题，并因此含有杂质。 此外，生产肉毒杆菌毒素的传统方法存在着必需要进行过滤或透析过程以纯化高纯度的肉 毒杆菌毒素的问题，这表明纯化过程是复杂且困难的。
[0014] 因此，本发明人进行了广泛的努力，以解决现有技术中存在的上述问题，并且结果 发现，当肉毒杆菌毒素生产株的培养物用酸处理以形成肉毒杆菌毒素沉淀物并且通过阴离 子交换色谱纯化所形成的沉淀物时，可以省略过滤、透析和乙醇沉淀步骤，并且生产所述肉 毒杆菌毒素的工艺非常容易，并且通过该生产方法可以生产具有98%或更高纯度的肉毒杆 菌毒素，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0015] 本发明的一个目的是提供一种通过简单的工艺来生产高纯度肉毒杆菌毒素的方 法。
[0016] 为了达到上述目的，本发明提供了用于生产肉毒杆菌毒素的方法，该方法包括以 下步骤：(a)用酸处理肉毒杆菌毒素生产株的培养物，以沉淀肉毒杆菌毒素；(b)向沉淀的 肉毒杆菌毒素中加入缓冲液，接着用蛋白酶抑制剂和核酸酶处理，从而提取肉毒杆菌毒素； (c) 用酸处理提取出的肉毒杆菌毒素以沉淀肉毒杆菌毒素并在缓冲液中溶解沉淀物；和 (d) 通过阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素。
【附图说明】
[0017] 图1是示出根据本发明的生产肉毒杆菌毒素的过程的示意图。
[0018] 图2示出测量通过初级阴离子交换色谱对肉毒杆菌毒素进行纯化后的纯度结果。
[0019] 图3示出测量通过二次阴离子交换色谱对肉毒杆菌毒素进行纯化后的纯度结果。
[0020] 图4示出测量用本发明方法生产的肉毒杆菌毒素和BOTOX? (Allergan)处 理所造成的复合肌肉动作电位振幅的增加或减少的结果。N :无注射液；S :盐水注射；B2 : BTX-A-I，两个单位；D2 :BTX-A-2,两个单位；B4 :BTX-A-1，四个单位；D4 :BTX-A-2,四个单 位；B8 :BTX-A-1，八个单位；和D8 :BTX-A-2,八个单位。
[0021] 图5示出测量用本发明方法生产的肉毒杆菌毒素和BOTOSi (Allergan)处 理所造成的传导速度的结果。N :无注射液；S :盐水注射；B2 :BTX-A-1，两个单位；D2 : BTX-A-2,两个单位；B4 :BTX-A-1，四个单位；D4 :BTX-A-2,四个单位；B8 :BTX-A-1，八个单 位；和D8 :BTX-A-2,八个单位。
【具体实施方式】
[0022] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普 通技术人员的通常理解具有相同的含义。大体上，将在下面描述的本文中使用的命名法和 实验方法是本领域公知的且通常采用的。
[0023] 在一个方面，本发明涉及一种生产肉毒杆菌毒素方法，该方法包括步骤：(a)用酸 处理肉毒杆菌毒素生产株的培养物，以沉淀肉毒杆菌毒素；(b)向沉淀的肉毒杆菌毒素中 加入缓冲液，接着用蛋白酶抑制剂和核酸酶处理，从而提取肉毒杆菌毒素；（C)用酸处理提 取出的肉毒杆菌毒素以沉淀肉毒杆菌毒素并在缓冲液中溶解沉淀物；和（d)通过阴离子交 换色谱法纯化肉毒杆菌毒素（图1)。
[0024] 通过本发明的方法生产所得的肉毒杆菌毒素可以用各种方法保存，包括冷冻储藏 和冻干储藏。
[0025] 本发明的方法可以在步骤（d)后进一步包括步骤：(e)用硫酸铵处理含有肉毒杆 菌毒素的阴离子交换色谱级分，以形成沉淀物，并将沉淀物在缓冲液中溶解；和（f)通过阴 离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素。
[0026] 在本发明中，肉毒杆菌毒素生产株优选肉毒杆菌（Clostridium botul
【技术领域】
[0001] 本发明涉及生产肉毒杆菌毒素的方法，更具体地涉及一种用于制备肉毒杆菌毒素 的方法，该方法包括步骤：(a)用酸处理肉毒杆菌毒素生产株的培养物，以沉淀肉毒杆菌毒 素；(b)向沉淀的肉毒杆菌毒素中加入缓冲液，接着用蛋白酶抑制剂和核酸酶处理，从而提 取肉毒杆菌毒素；（C)用酸处理提取出的肉毒杆菌毒素以沉淀肉毒杆菌毒素并在缓冲液中 溶解沉淀物；和（d)通过阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素。
【背景技术】
[0002] 自19世纪90年代已发现各种分泌神经毒素的梭菌属（Clostridium sp.) 的菌株，并且在过去的70年已对从这些菌株分泌的毒素进行了表征（Schant，E. J.et al.，Microbiol. Rev.，56:80, 1992)。
[0003] 源自梭菌属菌株的神经毒素，即肉毒杆菌毒素，根据它们的血清学性质被分为 七种类型（类型A至G)。每种毒素具有约150KDa大小的毒素蛋白并且天然含有几种 非毒性蛋白的复合物。中等复合物（300kDa)由毒素蛋白和无毒的非血凝素蛋白组成， 大复合物（450kDa)和非常大的复合物（900kDa)由结合到血凝素的中等复合物组成 (Sugiyama, H.，Microbiol. Rev.，44:419, 1980)。已知这种非毒性的血凝素蛋白是用于保护 毒素免受肠道内的低PH值和各种蛋白酶的作用。
[0004] 在细胞中，毒素被合成为具有约150kDa的分子量的单个多肽，然后通过胞内蛋白 酶作用或用人造酶如胰蛋白酶处理，在从N-末端开始的1/3位置裂解成两个单位：轻链 (L ;分子量：50kDa)和重链（H ;分子量：100kDa)。相比于单个多肽，裂解的毒素具有大大 增加的毒性。两个单位通过二硫键彼此连接并具有不同的功能。重链结合至靶细胞的受体 (Park. Μ. K.，et al·，FEMS Microbiol. Lett. ,72:243,1990)并用于在低 pH 值（pH 4)与生 物膜相互作用，以形成通道（Mantecucco, C. et al.，TIBS.，18:324, 1993)，轻链具有药理活 性，因此通过例如电穿孔导入细胞时，利用洗涤剂赋予细胞渗透性或干扰神经递质的分泌 (Poulain, B. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA. , 85:4090, 1988) 〇
[0005] 毒素在神经肌肉接头的胆碱能神经突触前处抑制乙酰胆碱的胞吐作用，造成乏 力。已认为用非常少量的毒素进行处理展现毒性，这表明毒素具有任何酶活性（Simpson，L. L. et al.，Ann. Rev. Pharmaeol. Toxicol.，26:427, 1986) 〇
[0006] 根据最近的报道，毒素具有金属肽酶活性，并且其底物由小突触、突触融合蛋白、 25KDa的突触相关蛋白（SNAP25)等组成，它们是胞吐机械复合物的单位蛋白。每种类型的 毒素使用上述三种蛋白质之一作为底物，并且已知B、D、F和G型毒素在特定位点裂解小突 触，A型和E型毒素在特定位点裂解SNAP25,和C型在特定位点裂解突触融合蛋白（Binz，T. et al.，J. Biol. Chem.，265:9153, 1994) 〇
[0007] 特别是，已知A型肉毒杆菌毒素可溶于pH为4. 0-6. 8的稀释水溶液。已知稳定的 非毒性蛋白质在PH大约为7或更高时从神经毒素中分离，并且结果是，毒性逐渐丧失。特 别是，已知毒性随pH和温度的增加而减少。
[0008] 肉毒杆菌毒素即使少量对人体也是致命的并且易于大量产生。因此，它与炭疽杆 菌、鼠疫和天花病毒一起构成四大生物恐怖武器。然而发现，当A型肉毒杆菌毒素在以不全 身影响人体的剂量注射时，它可以在注射部位使局部肌肉麻痹。根据这个特点，A型肉毒杆 菌毒素可以在广泛的应用中使用，包括除皱纹药剂，治疗痉挛性偏瘫和脑瘫的药剂等。因此 对于A型肉毒杆菌毒素的需求增加，并且已积极地进行对生产肉毒杆菌毒素以满足该需求 的方法的研究。
[0009] 目前典型的商品化产品是购自美国Allergan公司的BOTOX? (纯化的A型肉 毒杆菌毒素的神经毒素复合物）。100单位小瓶的BOTOX?由约5ng的纯化的A型肉毒杆 菌毒素的神经毒素复合物，〇. 5mg人血清白蛋白和0. 9mg氯化钠组成并且用不含防腐剂的 无菌盐水（注射0.9 %氯化钠）重构。其他商品化产品包括购自Ipsen Ltd.，UK, MyoBloc? 的:Dysport⑩（A型肉毒杆菌毒素和血凝素的复合物，其在含有肉毒杆菌毒素的药物组 合物中具有乳糖和人血清白蛋白并在使用前用〇. 9%氯化钠重构），（可注射溶液（pH 约5. 6)，包含B型肉毒杆菌毒素、人血清白蛋白、琥珀酸钠和氯化钠），购自Solstice Neurosciences，Inc.。常规用于生产肉毒杆菌毒素的方法包括酸沉淀法、盐沉淀法和色谱 法。
[0010] 例如，日本专利公开号1994-192296公开了一种通过培养肉毒梭菌细菌，接着进 行酸沉淀，提取，添加核酸酶和结晶来生产结晶A型肉毒杆菌毒素的方法。此外，美国专利 5696077公开了一种通过培养肉毒梭菌细菌，接着进行酸沉淀，提取，离子交换色谱，凝胶过 滤色谱和结晶来生产结晶B型肉毒杆菌毒素的方法。
[0011] Simpson等人通过重力流色谱，随后通过HPLC，使用亲和树脂、大小排阻色谱，和 包括使用两种不同的离子交换柱的离子（阴离子和阳离子）交换色谱的捕获来纯化肉毒神 经毒素，生产A型肉毒杆菌毒素 （Method in Enzymology, 165:76, 1988)，王等人使用沉淀和 离子色谱来纯化A型肉毒杆菌毒素 （Dermatol Las Faci Cosm Surg. ,2002:58, 2002)。
[0012] 此外，美国专利6818409公开了使用离子交换和乳糖柱纯化肉毒杆菌毒素，和美 国专利号7452697公开了一种通过离子交换色谱和疏水色谱的A型肉毒杆菌毒素。韩国专 利公开号2009-0091501公开了通过酸沉淀和阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素的方法， 以及美国公开号2013-0156756公开了通过阴离子交换色谱和阳离子交换色谱纯化肉毒杆 菌毒素的方法。
[0013] 然而，传统方法的问题在于使用阴离子交换色谱不利地影响肉毒杆菌毒素的凝胶 条带图案（美国专利号7452697)，并且问题还在于这些常规方法由于纯化时间长而难以商 业上应用。另外，由于作为肉毒杆菌毒素生产菌株的肉毒杆菌是一种厌氧细菌，存在着细菌 发酵应在厌氧系统中执行的问题，因此难以大量生产肉毒杆菌毒素。此外，存在着通过上述 纯化方法纯化的活性成分肉毒杆菌毒素并未清楚地分离和鉴定的问题，并因此含有杂质。 此外，生产肉毒杆菌毒素的传统方法存在着必需要进行过滤或透析过程以纯化高纯度的肉 毒杆菌毒素的问题，这表明纯化过程是复杂且困难的。
[0014] 因此，本发明人进行了广泛的努力，以解决现有技术中存在的上述问题，并且结果 发现，当肉毒杆菌毒素生产株的培养物用酸处理以形成肉毒杆菌毒素沉淀物并且通过阴离 子交换色谱纯化所形成的沉淀物时，可以省略过滤、透析和乙醇沉淀步骤，并且生产所述肉 毒杆菌毒素的工艺非常容易，并且通过该生产方法可以生产具有98%或更高纯度的肉毒杆 菌毒素，从而完成了本发明。
【发明内容】
[0015] 本发明的一个目的是提供一种通过简单的工艺来生产高纯度肉毒杆菌毒素的方 法。
[0016] 为了达到上述目的，本发明提供了用于生产肉毒杆菌毒素的方法，该方法包括以 下步骤：(a)用酸处理肉毒杆菌毒素生产株的培养物，以沉淀肉毒杆菌毒素；(b)向沉淀的 肉毒杆菌毒素中加入缓冲液，接着用蛋白酶抑制剂和核酸酶处理，从而提取肉毒杆菌毒素； (c) 用酸处理提取出的肉毒杆菌毒素以沉淀肉毒杆菌毒素并在缓冲液中溶解沉淀物；和 (d) 通过阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素。
【附图说明】
[0017] 图1是示出根据本发明的生产肉毒杆菌毒素的过程的示意图。
[0018] 图2示出测量通过初级阴离子交换色谱对肉毒杆菌毒素进行纯化后的纯度结果。
[0019] 图3示出测量通过二次阴离子交换色谱对肉毒杆菌毒素进行纯化后的纯度结果。
[0020] 图4示出测量用本发明方法生产的肉毒杆菌毒素和BOTOX? (Allergan)处 理所造成的复合肌肉动作电位振幅的增加或减少的结果。N :无注射液；S :盐水注射；B2 : BTX-A-I，两个单位；D2 :BTX-A-2,两个单位；B4 :BTX-A-1，四个单位；D4 :BTX-A-2,四个单 位；B8 :BTX-A-1，八个单位；和D8 :BTX-A-2,八个单位。
[0021] 图5示出测量用本发明方法生产的肉毒杆菌毒素和BOTOSi (Allergan)处 理所造成的传导速度的结果。N :无注射液；S :盐水注射；B2 :BTX-A-1，两个单位；D2 : BTX-A-2,两个单位；B4 :BTX-A-1，四个单位；D4 :BTX-A-2,四个单位；B8 :BTX-A-1，八个单 位；和D8 :BTX-A-2,八个单位。
【具体实施方式】
[0022] 除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语与本发明所属技术领域的普 通技术人员的通常理解具有相同的含义。大体上，将在下面描述的本文中使用的命名法和 实验方法是本领域公知的且通常采用的。
[0023] 在一个方面，本发明涉及一种生产肉毒杆菌毒素方法，该方法包括步骤：(a)用酸 处理肉毒杆菌毒素生产株的培养物，以沉淀肉毒杆菌毒素；(b)向沉淀的肉毒杆菌毒素中 加入缓冲液，接着用蛋白酶抑制剂和核酸酶处理，从而提取肉毒杆菌毒素；（C)用酸处理提 取出的肉毒杆菌毒素以沉淀肉毒杆菌毒素并在缓冲液中溶解沉淀物；和（d)通过阴离子交 换色谱法纯化肉毒杆菌毒素（图1)。
[0024] 通过本发明的方法生产所得的肉毒杆菌毒素可以用各种方法保存，包括冷冻储藏 和冻干储藏。
[0025] 本发明的方法可以在步骤（d)后进一步包括步骤：(e)用硫酸铵处理含有肉毒杆 菌毒素的阴离子交换色谱级分，以形成沉淀物，并将沉淀物在缓冲液中溶解；和（f)通过阴 离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素。
[0026] 在本发明中，肉毒杆菌毒素生产株优选肉毒杆菌（Clostridium botul
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0访客 来自[中国] 2023年10月28日 20:52你好！你可以提取肉毒素菌种吗？可以的话请加MB0301，可以合作科研
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