生产肉毒杆菌毒素的方法_2

inum)，但并 不限于此，对本领域技术人员显而易见的是在本发明中可以使用能够生产肉毒杆菌毒素的 任何菌株。
[0027] 如本文所用的术语"肉毒杆菌毒素"旨在不仅包括由肉毒梭菌菌株生产的神经毒 素，也包括修饰的、重组的、杂合的和嵌合的肉毒杆菌毒素。重组肉毒杆菌毒素可具有由非 梭菌物种以重组方式生产的轻链和/或重链。此外，本文所用术语"肉毒杆菌毒素"旨在包 括肉毒杆菌毒素血清型A、B、C、D、E、F和G，肉毒杆菌毒素复合物（即，300、600和900kDa 复合物），以及纯肉毒杆菌毒素（即，150kDa的神经毒性分子），它们在本发明的实践中都是 有用的。
[0028] 如本文所用的术语"生产的肉毒杆菌毒素"是指纯肉毒杆菌毒素或肉毒杆菌毒素 复合物，其与从培养物或发酵过程中收集肉毒杆菌毒素时，伴随肉毒杆菌毒素的其他蛋白 质或杂质是分离或基本上分离的。因此，生产的肉毒杆菌毒素的纯度为至少90%，优选至少 95%，最优选至少98%。特别是，在本发明中生产的肉毒杆菌毒素可以是具有至少98%的 纯度的A型肉毒毒素蛋白质。
[0029] 用于生产肉毒杆菌毒素的肉毒杆菌菌株可以使用本领域中已知的常规方法进行 培养并且可用常规培养基进行培养。
[0030] 作为非限制性实例，用于肉毒梭菌菌株培养的培养基可包括酪蛋白水解物、酵母 提取物、葡萄糖等，并且培养是在25-40°C的温度进行90-180小时，并且优选100-150小时。
[0031] 步骤（a)的酸沉淀可以通过向菌株的培养物中加入酸，优选硫酸或盐酸来进行， 以使由pH传感器测量的培养物的pH值达到3. 0-4. 5,优选3. 3-4. 0,且最优选3. 4-3. 6。
[0032] 步骤（a)的酸沉淀是基于这样的原则，其中向含有多种蛋白质的培养物中加入酸 降低了培养物的PH，同时杀死了在培养后残留的肉毒杆菌，使得蛋白质达到沉淀的等电点。 它包括广义上的结晶，并且与关注于以高纯度纯化所需物质的结晶不同，沉淀法是以混合 状态大致分离所期望物质的方法。在沉淀法中，与所需物质具有类似结构的杂质也被沉淀。 在此，将pH调节至约3. 0-4.5。肉毒杆菌毒素的回收率随着pH值降低而增加。如果pH为 3. 0或更低，这将影响肉毒杆菌毒素本身，如果pH为4. 5或更高，肉毒杆菌毒素的回收率会 降低。由于这些原因，pH值优选在上述特定范围内。
[0033] 具体地，pH最优选3. 4-3. 6,因为肉毒杆菌毒素的回收率在该pH范围是最高的。当 肉毒菌株培养物的pH在加酸后达到适当的范围时，将酸加入到培养物中直到不再出现pH 变化，然后将培养物在室温静置15-30小时，然后除去上清液。
[0034] 提取肉毒杆菌毒素的步骤（b)包括将从步骤（a)得到的毒素在磷酸盐缓冲液中溶 解，优选磷酸钠缓冲液，并除去沉淀物。这里，磷酸盐缓冲液的PH优选为约4. 0至约7. 0。 可以通过加入碱，优选氢氧化钠将所得的pH调节至4. 5-6. 5,优选5. 0-6. 0,并且可以在上 述规定的PH范围进行毒素的提取。
[0035] 此外，用于步骤（b)的核酸酶可以是DNase和RNase，并且用于步骤（b)的蛋白酶 抑制剂优选苯甲脒盐酸，但并不限于此，本领域中已知的任何能够抑制蛋白酶活性的物质 都可在本发明中使用。通过在提取肉毒杆菌毒素的步骤（b)中用核酸酶处理，可以分解由 在步骤（a)的酸所形成的沉淀物中所含的杂质如DNA和RNA。如果用酶处理的步骤进行1. 5 小时或更少，DNA和RNA的分解可能不充分。出于这个原因，用酶处理的步骤进行1. 5-7小 时，优选3-6小时，并且DNase和RNase优选以0. 05-1. Og/1的浓度添加，优选0. 1-0. 5g/l。
[0036] 因为通过酶处理得到的提取物中含有肉毒杆菌毒素和与肉毒杆菌毒素具有类似 极性的蛋白质，应该进行用盐酸沉淀蛋白质的步骤。具体地，步骤（c)用盐酸沉淀优选通过 离心经酶处理过的提取物来进行，通过加入盐酸（HCl)调节上清液pH至pH为2. 5至4. 5， 优选为3. 0-4. 0,然后于4°C在冰箱中用盐酸沉淀上清液中的蛋白质。特别是，在用盐酸沉 淀的步骤中的PH最优选调节至3. 3-3. 8,以保持毒素的活性和回收率在高水平。如果用盐 酸沉淀的步骤是在上述PH范围进行，肉毒杆菌毒素的效价会高达90%以上，并且将显著降 低蛋白质的凝固。接着，用盐酸的沉淀物可以在缓冲液中溶解，并可执行随后的步骤。
[0037] 作为最重要步骤的步骤（d)是在用盐酸沉淀的步骤完成后通过使用阴离子交换 树脂的色谱法来进行的，以除去A型肉毒杆菌毒素以外的大多数主要杂质。用于步骤（d) 的阴离子交换树脂可以是用二乙氨基乙基（DEAE)或季铵（Q)基团取代的树脂，但不限于 此。例如，阴离子交换树脂可以是DEA-Sephadex，如美国专利号5, 696, 077、国际专利公开 号W096/05222和美国专利号5, 846, 929描述的。优选地，它是具有强碱性的季铵基团或弱 碱性二乙氨基乙基（DEAE)基团的阴离子交换树脂中的任何一种。
[0038] 可以在本发明中使用的强碱性阴离子交换基团的例子可包括Q Sepharose Fast Flow, Q Sepharose High Performance, Resource Q， Sourcel5Q， Source 30Q， Mono Q, Mini Q, Capto Q, Capto Q ImpRes, Q HyperCel, Q Cermic HyperD F, Nuvia Q, UNOsphere Q, Macro-Prep High Q, Macro-Prep 25Q, Fractogel EMD TMAE (S), Fractogel EMD TMAE Hicap(M), Fractogel EMD TMAE (M), Eshmono Q, Toyopearl QAE-550C, Toyopearl SuperQ-650C, Toyopearl GigaCap Q-650M, Toyopearl Q-600C AR, Toyopearl SuperQ-650M,Toyopearl SuperQ-650S, TSKgel SuperQ-5Pff(30), TSKgel SuperQ-5Pff(20) 或TSKgel SuperQ-5PW，但不限于此，也可以使用本领域中已知的阴离子交换树脂。
[0039] 用于步骤（d)的柱缓冲液可以是磷酸钠缓冲液或柠檬酸盐缓冲液。优选使用磷酸 钠缓冲液。柱缓冲液的浓度控制在30-70mM，优选约40-60mM。柱的pH控制为约3. 5-7. 5， 并且流动相的流速控制为0. 5-5. Oml/min，优选I. 0-3. Oml/min。另外，缓冲液的电导率调 节至3-30mS/cm，并在完成柱平衡后注入样品。将毒素作为流过物洗脱，而吸附最主要的杂 质。具体地，在通过阴离子交换色谱纯化的步骤（d)中，A型肉毒杆菌毒素不吸附于阴离子 交换树脂，而最主要的杂质通过吸附被除去。
[0040] 在本发明中，步骤（d)的阴离子交换色谱优选在pH为3. 5-7. 5,优选4. 5-7. 0,和 电导率为3-30mS/cm，优选5-20mS/cm时进行。
[0041] 为了完全除去步骤（d)的阴离子交换色谱后残留的杂质，如果有必要，根据本发 明生产肉毒杆菌毒素的方法还包括以下步骤：（e)用硫酸铵处理含有肉毒杆菌毒素的阴离 子交换色谱级分，以形成沉淀物，并在缓冲液中溶解沉淀物；和（f)通过阴离子交换色谱纯 化肉毒杆菌毒素。
[0042] 在步骤（e)中，用硫酸铵处理含有肉毒杆菌毒素的阴离子交换色谱级分以形成沉 淀物，将形成的沉淀物在缓冲液中溶解。用硫酸铵沉淀的步骤对应于盐析过程，其中将易于 溶解在水中的盐（硫酸铵等）加入到蛋白质混合物中以提高离子强度，从而形成蛋白质沉 淀物。如果所需蛋白质主要在用30% (w/v)硫酸铵饱和时沉淀，那么所需蛋白质可以通过 在30%或更低的硫酸铵饱和浓度下析出除了所需蛋白以外的蛋白来沉淀，然后添加硫酸铵 至30%的饱和浓度（w/v)，并可以通过离心收集。盐析操作经常被用作初始手段。用于步 骤（e)的硫酸铵溶液可具有10-50 %的硫酸铵浓度（w/v)，优选20-40% (w/v)。
[0043] 接着，在步骤（f)中，可以通过阴离子交换色谱纯化肉毒杆菌毒素。根据本发明的 高纯度肉毒杆菌毒素的纯化主要由步骤（d)的阴离子交换色谱（初级阴离子交换色谱）来 执行，并且执行步骤（f)的阴离子交换色谱（二次阴离子交换色谱）以除去残留的杂质，并 且步骤（f)的阴离子交换色谱可以以与步骤（d)的阴离子交换色谱相同的方式进行。
[0044] 可以对通过上述纯化方法获得的所得含有A型肉毒杆菌毒素的级分灭菌和过滤， 以制备粗液。制得的粗液可以冷冻保存直至使用。
[0045] 在另一个方面，本发明涉及通过本发明方法生产的肉毒杆菌毒素。分析经HPLC纯 化的肉毒杆菌毒素的纯度，结果可以看出，经过初级阴离子交换色谱后肉毒杆菌毒素的纯 度为98. 38% (图2)，这比购自Allergan Inc.的BOTOX⑧的纯度（约95% )更高，这 表明在初级阴离子交换色谱步骤中除去了大多数杂质。另外也示出了二次阴离子交换色谱 后的肉毒杆菌毒素的纯度为98. 99% (图3)。
[0046] 此外，根据本发明的生产肉毒杆菌毒素的方法具有的优点在于可省略过滤、透析 和乙醇沉淀的步骤，因此生产肉毒杆菌毒素的方法容易简单。特别是，本发明的方法的优点 在于，可以省略在用于生产Allergan Inc.的BOTOX?的方法中的过滤和乙醇沉淀的步 骤（美国专利公开号2012-0156756 ;非APF方法），因而可以减少纯化步骤的数目（从五个 步骤到三个步骤），以减少生产肉毒杆菌毒素的粗液的周期（从4周至2周）。
[0047] 在本发明的另一实例中，为了确认由本发明方法生产的A型肉毒杆菌毒素蛋白 (DWP450)的安全性，进行了与BOTOX⑨（Allergan)的安全性比较的实验。结果表明，由 本发明方法生产的肉毒杆菌毒素（DWP450)对于雌性显示出60U/kg的NOAEL值，这表明它 比显示出30U/kg的NOAEL值的BOTOX? (Allergan)安全多一倍。通过本发明方法生产 的肉毒杆菌毒素的安全性多一倍被认为是因为本发明的肉毒杆菌毒素具有高纯度，因而在 局部作用时具有增加的能力，使得会导致副作用的肉毒杆菌毒素的