专利名称：利用脂质体肉毒杆菌毒素对膀胱功能障碍的治疗的制作方法
技术领域：
本发明主要涉及膀胱功能障碍、特别是顽固性膀胱过动症的治疗的领域。
背景技术：
尿失禁或膀胱功能障碍是对膀胱控制的降低。症状可以从轻度的漏尿到不能控制 的尿湿。上述症状可发生在任何人身上，但是随着年龄的增长变得愈发常见。大部分膀胱 控制问题在肌肉过弱或过于活跃时发生。如果保持膀胱闭合的肌肉过于弱，在打喷嚏、大笑 或提举重物时可能会漏尿。这是压力性尿失禁。如果膀胱肌肉过于活跃，则在膀胱中有极 少量尿液时会产生强烈的如厕欲望。这是急迫性尿失禁或膀胱过动症。尿失禁还有其它原 因，例如前列腺问题和神经损伤。治疗方法取决于问题的种类。该治疗方法可包括单纯的锻炼，医生开具的药物、特 定装置或方法，或手术。多年来，膀胱内疗法一直是主要的治疗方法(Parkin等，Urology 49， 105-7(1997))。膀胱内药物治疗在膀胱内提供了高的局部药物浓度，降低了全身性副作用 的风险，并消除了 口服施用药剂时尿排泄水平低的问题。经测试，患者对30分钟的标准滴 注时间有优异的耐受性。临床上，二甲基亚砜(DMSO) (Rimso-50)是唯一获FDA批准的膀胱 疼痛综合征/间质性膀胱炎(PBS/IC)用膀胱内治疗，据信DMSO具有抗炎性能和肥大细胞 稳定作用(Sun和Chai，BJU Int 90，381-5 (2002))。然而，DMSO的成功率通常不高。膀胱 上皮主要依赖于表面糖胺聚糖(GAG)层的存在和细胞间接触的结构完整性(也就是紧密 连接)，以保持对有毒尿废物的不可渗透性(Parsons等，Science208,605-7 (1980))。在该 屏障受到损坏时，泄漏进入下膀胱层的尿液成分引起了膀胱内的刺激性变化，并导致对感 觉神经纤维的刺激以及疼痛、尿急和尿频症状(Lavelle等，Am J Physiol Renal Physiol 283, F242-53(2002))。尿路上皮和GAG还提供了有效进行膀胱内药物递送用的重要屏障。更为重要的是，膀胱过动症(OAB)困扰了美国17%的男女(年龄越大发病率越 高)，并且据估计产生了 164亿美元的经济负担。许多专家认为25%的OAB患者会寻求医 学治疗。保守估计，口服药物治疗对那些寻求治疗的4百万OAB患者中的25%无效，这部分 患者将寻求用于顽固性OAB的疗法。在最近几年中，出现了几种OAB用新型抗毒蕈碱药物和改良剂型。2008年有6种 获FDA批准的OAB抗毒蕈碱药剂，其全球销售为每年20亿美元。但是，由于功效有限且具 有诸如口干、便秘和认知功能障碍等副作用，有不到20%的患者继续使用抗毒蕈碱治疗。 常用作抗毒蕈碱性顽固性患者用二线治疗的两种方法是获FDA批准的骶神经刺激(SNS) (Interstim, Medtronics Inc.)和BoNT的逼尿肌内注射，所述注射法处于用于顽固性OAB 的FDAII期试验中(Botox，Allergan Inc.，)。现今正在进行施用肉毒杆菌毒素的若干临 床试验。已经表明肉毒杆菌毒素有助于治疗顽固性膀胱过动症(OAB)，但是其需要进行膀胱 镜检查过程，以将该毒素直接注射到膀胱壁中。因为该毒素被注射到膀胱逼尿肌中，并可减 弱膀胱的收缩力，高达43%的患者可能患上尿潴留。
制药工业也显示出对开发与间质性膀胱炎有关的尿急和尿频的治疗有极大的兴 趣。最近，这些疗法已包括卡介苗(BCG)、类辣椒辣素(resiniferatoxin) (RTX)、透明质酸 (Cystistat)、透明质酸钠(SI-7201)，以及骶神经刺激装置。需要能够简单地滴注肉毒杆菌毒素(BoNT)而无需针头注射。此外，需要在低浓度 下将BoNT递送至膀胱上皮内衬和感觉神经末端，这可有助于改善下尿路症状，而不引起潴 留和/或膀胱肌无力。其它泌尿疾病如尿路感染和膀胱癌中也存在对局部膀胱内药物递送和药物在膀 胱内较长时间接触的需求。用于膀胱功能障碍的持续性药物递送系统不能商购获得。其它方法尝试将带有药 物的球囊容器或基体材料置入膀胱中以进行持续性药物释放，但是这些机械性方法引起了 刺激、疼痛，并由于其大小和形状可引起膀胱颈出口堵塞导致的梗阻。使用膀胱内BoNT滴注的有限次临床经验至今为止是不成功的。膀胱内BoNT滴注 缺乏功效的可能原因包括受尿液中蛋白酶类的降解、在尿液中的稀释或从滴注至膀胱内腔 的BoNT溶液进入尿路上皮的摄取不良。因此，本发明的一个目的在于提供通过滴注到膀胱中而递送药物的方法和组合 物，从而治疗OAB和膀胱的其它紊乱。
发明内容
脂质体用于膀胱内药物递送，特别是BoNT的递送，以通过降低膀胱刺激和尿频而 帮助改善下尿路症状。与注射相比，该系统使用了较低且更为安全的剂量的BoNT，降低了尿 潴留的风险。以30ml 60ml的常用体积，将作为液体制剂的脂质体-BoNT简单滴注到膀胱中， 达到的功效与现今用膀胱镜针头注射BoNT达到的功效相似。所述剂量可以低于注射所用 剂量，从而尿潴留的风险极小。脂质体-BoNT可保护BoNT免于遭受膀胱和尿液的分解。实施例将证明所述制剂的功效。
具体实施例方式I.脂质体-药物制剂脂质体封装应可解决滴注后吸收不良的问题。BoNT的脂质体封装可防止BoNT在 尿液中降解，并使得从粘附在膀胱表面的脂质体穿过尿路上皮进行无障碍吸收。由于BoNT 包埋在脂质体内，BoNT不易受到尿液的稀释，而且脂质体表面的BoNT的局部浓度可以足够 高，以加快从粘附于膀胱内腔表面的脂质体中滤出的BoNT的进入。A脂质体脂质体(LP)为球形囊泡，并由以水性隔区隔开的同心磷脂双层组成。LP具有 粘附于细胞表面并在细胞表面生成分子膜的特性。脂质体是由同心磷脂双层组成的脂 囊泡，所述磷脂双层封闭了水性内腔(Gregoriadis等，Int J Pharm 300，125-30 2005 ； Gregoriadis 和 Ryman，Biochem J 124，58P (1971))。脂囊泡包含一个或几个由一个(单层) 或多个(多层)磷脂双层描绘的水性隔区(Sapra等，Curr Drug Deliv 2，369-81 (2005))。 临床中脂质体的成功归因于其制剂中所使用的脂质的无毒性质。脂质体的脂质双层和水性内核都可用作治疗目的。脂质体作为较低剂量下提高功效用的毒素载体已得到充分研 % (Alam^, MoI Cell Biochem 1 12,97-1071992 ；Chaim-Matyas φ, Biotechnol Appl Biochem 17(Ptl)，31-61993 ;de Paiva 和 Dolly, FEBS Lett 277,171-4(1990) ；Freitas 禾口 Frezard，Toxicon 35，91—100 (1997) ；Mandal 禾口 Lee，Biochim BiophysActa 1563， 7-17(2002))。脂质体具有在细胞和组织表面形成分子膜的能力，现今已对脂质体作为可能的 治疗剂来促进伤口愈合并作为眼泪替代物促进治愈干眼病进行了测试。临床研究已经 证实了脂质体作为局部愈合剂的功效(Dausch等，Klin Monatsbl Augenheilkd 223， 974-83(2006) ；Lee 等，Klin Monatsbl Augenheilkd 221，825-36 (2004))。脂质体也用于 眼科中，以改善角膜炎、角膜移植排斥反应、葡萄膜炎、眼内炎和增生性玻璃体视网膜病变 (Ebrahim 等，2005 ；Li 等，2007)。脂质体作为多种化学治疗剂用药物载体得到了广泛的研究(该主题约有25，000 篇已公布的科学文章)(Gregoriadis，N Engl J Med 295,765-70(1976) ；Gregoriadis 等， Int J Pharm 300，125-30 (2005))。诸如多柔比星等水溶性抗癌物可在由磷脂双层界定的 脂质体水性隔区内得到保护，而诸如两性霉素和辣椒素等脂溶性物质可整合到磷脂双层中 (Aboul-Fadl, Curr Med Chem 12，2193-214 (2005) ；Tyagi 等，J Urol 171，483-9 (2004))。 使用脂质体可显著地提高环孢霉素的局部和玻璃体递送(Lallemand等，Eur JPharm Biopharm 56，307-182003)。化学治疗剂的递送使药物动力学得以提高，并使毒性得以降低 (Gregoriadis, Trends Biotechnol 13, 527-37 (1995) ；Gregoriadis禾口 Allison, FEBS Lett 45,71-41974 ;Sapra 等，Curr Drug Deliv 2，369-81 (2005))。已有多于 10 种脂质体和脂类 制剂获监管机构的批准，并且许多种脂质体药物正处于临床前开发或临床试验中(Barnes， Expert Opin Pharmacother 7,607-15(2006) ；Minko 等，Anticancer AgentsMed Chem 6, 537-52(2006))。Fraser等在Urology，2003 ；61 :656_663中证明，脂质体的膀胱内滴注提 高了有功能障碍的尿路上皮的屏障性能，并在有膀胱过动症的大鼠模型中部分逆转了高排 尿频率，所述大鼠的膀胱过动症是通过用硫酸鱼精蛋白破坏尿路上皮并随后用KCl刺激膀 胱而诱导。Tyagi等在J Urol, 2004 ；171 ；483-489中报道，脂质体是辣椒素的膀胱内施用 的优质载体，与30%乙醇相比，有较少的载体诱导性炎症。从在数以千计患者的临床中使用 脂质体的大量临床经验中，已经充分了解了关于脂质体的急性毒性、亚慢性毒性和慢性毒 性优选的安全性数据。目标临床途径用脂质体的安全使用也得到了其在患者中作为抗癌药 载体的广泛应用的支持。B用于滴注的肉毒杆菌毒素(BoNT)和其它药物由肉毒梭菌(Clostridium botulinum)产生的肉毒杆菌神经毒素被认为是已知的 对人最强的生物毒素(Smith & Chancellor, J Urol, 171 =2128(2004) BoNT 已经有效用 于与肌肉过度收缩有关的不同疾病。在7种免疫学上不同的神经毒素(A型 G型)中， BoNT-A是临床上最为常用的肉毒杆菌毒素。在最近几年中，BoNT-A和BoNT-B已经成功地 通过在多个位置进行逼尿肌内BoNT-A注射而用于治疗患有神经原性膀胱过动症的脊髓损 伤患者(Schurch 等，2000)。肾上腺皮质激素(ACh)和去甲肾上腺素释放抑制的作用已知BoNT通过抑制 ACh在神经肌肉接点处的释放和自主神经传递而发挥作用。在肌肉内注射BoNT后，在骨骼肌和平滑肌中可产生暂时的化学去神经作用和肌肉松弛(Chuang和Chancellor，J Urol. 176(6Ptl) :2375-82 (2006))。Smith 等(J Urol, 169 :1896(2003))发现，将 BoNT 注 射到大鼠近端尿道括约肌中使标记的去甲肾上腺素在高电场刺激而不在低电场刺激下发 生显著的下降，这表明BoNT抑制了自主神经末端处的去甲肾上腺素释放。感觉机制抑制的作用越来越多的证据支持BoNT还抑制膀胱内的传入神经 传递的观点(Chuang 等，J Urol 172,1529-32(2004) ；Khera 等，Neurochem Int,45 987(2004))。已经表明，BoNT抑制神经肽、谷氨酸盐和三磷酸腺苷的释放，这些物质是疼痛 感的介体(Cui等，Pain, 107 :125(2004)) 0在乙酸诱导的膀胱过动模型中观察到了相似的 作用。在人类逼尿肌过动中发现，与逼尿肌内注射BoNT后的尿急程度降低有关的感觉受体 P2X3和瞬时受体电位香草酸(Vanilloid)I型受体(TRPVl)在尿路上皮下的神经纤维中水 平的降低(Apostolidis 等，J Urol, 174 :9772005)。BoNT的靶蛋白是处于脂质环境中的整合膜蛋白。脂质体可以通过使与尿路上皮的 粘附更强而提高诸如BoNT等金属蛋白酶的活性。膀胱镜引导的注射是目前在临床中对膀 胱施用BoNT的标准做法。近年来，有研究评估了在膀胱刺激的动物模型中进行BoNT的膀 胱内滴注的可能(Khera等，toology 66，208-12 (2005))。文献中先前的报道表明，对VAMP 有特异性的BoNT的金属蛋白酶活性因脂质膜的存在而显著提高。这种作用提供了对以下 事实的解释这些神经毒素对插入至脂质囊泡中和神经元中的VAMP比对分离的VAMP分子 具有更强的活性。这种脂质增高作用是由脂质带来的。该研究对将脂质体用作BoNT滴注 用递送载体的合理性有很强的支持。可滴注到膀胱中的其它药物也可使用脂质体递送系统进行递送，特别是具有可由 局部递送避免的全身副作用的那些药物。可以使用所述脂质体递送系统递送的合适的药物或活性剂包括但不限于，癌症治 疗药、免疫调节药、镇痛药、消炎剂、抗组胺药、内啡肽、前列腺素、大麻类(Canaboid)TRP受 体、肽、蛋白，以及抗体、质粒、裸DNA、病毒载体、RNA、siRNA、氨基酸；透明质酸；戊聚糖多硫 酸钠、β "3受体激动剂和拮抗剂、Ghrelin受体激动剂和拮抗剂以及诸如利多卡因等局部 麻醉剂。示例性癌症治疗药包括顺钼、卡钼、丝裂霉素、奥沙利钼、氮芥、环磷酰胺、苯丁酸 氮芥、长春新碱、太平洋紫杉醇(paclitaxel)、长春碱、多柔比星、甲氨蝶呤、长春瑞滨、长 春地辛、紫杉醇(taxol)及其衍生物、伊立替康、托泊替康、安吖啶、足叶乙甙、磷酸足叶 乙甙、替尼泊苷、表鬼白毒素、曲妥珠单抗(HERCEPTIN )、西妥昔单抗、和利妥昔单抗 (RITUXAN 或MABTHERA )、贝伐单抗(AVASTIN )和它们的组合。示例性的免疫调节药包括干扰素和卡介苗。所述药物递送组合物也可用于递送合适的药物，从而治疗间质性膀胱炎、膀胱疼 痛综合征、膀胱过动症、膀胱癌、前列腺癌和由细菌、真菌或病毒引起的尿路感染。II.制造方法脂质体的制造脂质体的制造方法描述于上述文献中并且是众所周知的。在一个实施方式中，水性脂质体悬浮液通过微流化制成。最终产物可能遭 受一系列的稳定性问题，如聚集、融合和磷脂水解(Nounou等，Acta Pol Pharm 62,381-91(2005))。在能够实现脂质体产物的临床益处之前，脂质体产物必须具备足够的化学和物理 稳定性(Torchilin，Adv Drug Deliv Rev 58，1532-55 (2006))。在一个优选的实施方式中， 脱水脂质体由磷脂在叔丁醇(TBA)/水共溶剂系统中的均质分散液形成。对脂质体的各向 同性的单相溶液进行冷冻干燥，以在无菌小瓶中生成脱水脂质体粉末。在从小瓶中除去水 和TBA后，冷冻干燥步骤留下了空心脂质囊泡或脱水脂质体。加入生理盐水时，该冻干产物 自发形成均质脂质体制剂(Amselem 等，J Pharm Sci 79，1045-52 (1990) ；Ozturk 等，Adv Exp Med Biol 553，231-42 (2004))。低浓度的脂质可理想地用于本方法，因为脂质和TBA 的比例是影响所得脂质体制剂的尺寸和多分散性的关键因素。脂质体BoNT的制备在一个优选的实施方式中，通过稍作修改的脱水-复水法制备脂质体 BoNT ( “LPA-08”)。在37°C下用BoNT在注射用水中的溶液(50单位/ml)对先前步骤中制 得的脂质体进行水化。然后在37°C的温度下使用水浴对所述混合物进行2小时的温育以形 成寡层(oligolamellar)水化脂质体。分别以0. 5%、1 %、2. 5%和5%浓度(重量/体积， w/v)的甘露醇向最终混合物中加入甘露醇，然后在丙酮-干冰浴中进行冷冻。甘露醇在冷 冻干燥过程中作为冷冻保护剂。冷冻混合物在-40°C和5毫巴下进行冻干过夜。用盐水对 冻干块进行再悬浮至所需的BoNT终浓度。通过在12，OOOXg下使用超速离心机进行离心 30分钟而从包埋的BoNT中除去游离BoNT。洗涤3次之后，使沉淀再次重悬浮于盐水中。将烈性细菌毒素配制到脂质体中需要谨慎的对待。BoNT不能暴露于制造脂质体中 常用的有机溶剂。使用薄膜水化法和脂质二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)完成实施例。简言 之，首先在氮气细流下于圆底烧瓶中对DPPC的氯仿溶液进行蒸发。在真空下对脂质膜进行 干燥过夜。然后用BoNT水溶液对干燥脂质进行水化。如下文实施例2所证明，通过仔细地控制BoNT和脂质的比例获得了最佳结果。如 本研究所证明，利用常规实验可以确定最佳比例和脂质组分。III.脂质体BoNT的递送脂质体-BoNT滴注对患者而言更为舒适，且与原本限于对膀胱镜BoNT注射熟练且 经认证的医生中的治疗形式不同，脂质体-BoNT滴注可使更多的医生诊所提供这种治疗形 式。BoNT是大分子且不会穿过细胞层到达肌肉和神经末端。不使用脂质体进行的BoNT滴 注需要会损伤膀胱内衬的腐蚀剂，如鱼精蛋白。这种方法没有获得FDA的批准并可引起膀 胱疼痛和损伤。BoNT的滴注可降低患顽固性膀胱过动症的患者的治疗成本。不同实验室 报道的多种研究对在膀胱刺激的动物模型中进行BoNT的膀胱内滴注的可能性进行了评估 (Chuang等，2004 ；Khera等，2005)。但是，关于BoNT的膀胱内滴注的有限临床经验是不成 功的。脂质体封装解决了滴注后吸收不良的问题。因为BoNT包埋在脂质体的内部，则不易 受到尿液的稀释，且脂质体表面处BoNT的局部浓度足够高，从而加快从粘附于膀胱表面的 脂质体中滤出的BoNT的被动扩散。脂质体的脂质屏障也可在脂质体被膀胱吸收之前防止 尿中蛋白酶和蛋白水解酶的接近从而防止对BoNT进行切割。滴注方法是已知的。例如，参见Lawrencia 等，Gene Ther 8，760-8 (2001) ；Nogawa 等，J Clin Invest 115，978-85 (2005) ；Ng 等，Methods Enzymol 391,304-132005 ；Tyagi 等，J Urol 171，483-9 (2004) ；Trevisani等，J Pharmacol Exp Ther 309，1167-73(2004)；Trevisani 等，Nat Neurosci 5，546-51 (2002)) ； (Segal 等，1975). (Dyson 等，2005). (Batista 等，2005 ；Dyson 等，2005)。如下文实施例1所证明，脂质体-BoNT的体积在递送功效中是至关重要的。可利 常规实验来优化递送体积。所公开的脂质体也可用于将治疗剂滴注至其它位置，例如泌尿道，包括尿道、膀 胱、输尿管和肾内收集系统；妇科位置，如阴道、子宫、输卵管；胃肠位置，包括口腔、食道、 胃、小肠、结肠、直肠、肛门；以及外耳或内耳；皮肤和鼻子。通过参照以下非限制性实施例，可进一步理解本发明。实施例1 膀胱膨胀对滴注后脂质体BoNT吸收的影响材料和方法通过以递增的体积滴注同样剂量的脂质体BoNT来确定膀胱膨胀对滴注后脂质体 BoNT吸收的影响。用不同体积滴注液(0. 5ml,0. 55ml,0. 6ml)中相同组成的脂质和BoNT(每 一单位的BoNT为0. 5mg脂质)制成的脂质体滴注大鼠。将脂质体滴注至氟烷麻醉下的大 鼠膀胱中，停留时间为30分钟；然后允许动物在给予食物和水并装于笼中的条件下进行恢 复。M小时后在尿烷麻醉下(剂量1. Og/kg体重)，通过以0. 04ml/分钟的速率灌输盐水 而对经处理的大鼠进行经尿道开放性膀胱测压(transurethral opencystometry)。在获得 1小时的正常基准后，灌输乙酸的盐水溶液(0.25%)以诱导膀胱刺激。在用不同体积的滴 注液进行BoNT治疗7天后，通过在尿烷麻醉下进行连续的经尿道膀胱测压来评估膀胱膨胀 作用。MM用0. 5ml标准体积滴注的大鼠显示了通过以0. 08ml/分钟的速率持续灌输盐水而 诱导的反射性排尿时的正常CMG。但是，用高出10% 20%体积的滴注液(0. 55ml或0. 6ml 体积的滴注液)中同样剂量的脂质体BoNT灌输的大鼠显示了盐水膀胱测压下的充溢性尿 失禁(overflow continence)。小体积滴注限制了 BoNT只对尿路上皮作用，而滴注体积10% 20%的增加却显 著地降低了吸收屏障，并允许BoNT在滴注后到达逼尿肌。以大体积的脂质体BoNT滴注的 大鼠在清醒状态下显示出尿潴留，而在麻醉状态下显示出充溢性尿失禁，从而表明了对反 射性排尿的强烈抑制。有趣的是注意到，麻醉状态下的充溢性尿失禁反映了药物对排尿反 射的传入支(afferent arm)作用的理想特征。麻醉状态下的充溢性尿失禁转化成清醒状 态下传入输入的降低。BoNT是分子量为150kD的大分子，因此作为吸收机制在很大程度上可排除扩散。 胞吞作用是膀胱吸收中更为可能的机制。先前的研究显示，尿路上皮的伞细胞中的内吞随 如静水压等外部刺激而增加。膀胱填充过程中胞吞和胞吐的速率使得净效应为添加隔膜并 增加尿路上皮的表面积，从而适应膀胱的伸展。因此，在膀胱伸展后有可能存在更多的胞吞 活动，从而引起膀胱对BoNT更高的摄取。实施例2 脂质与BoNT的比例的影响为了优化BoNT的功效，脂质和毒素应处于最佳的比例。材料和方法用不同比例的脂质制备脂质体BoNT，其中保持BoNT的比例不变。例如，以25IU的BoNT开始，在氟烷麻醉下以不同体积中的相同组成的脂质和BoNT(每一单位的BoNT为 0. 5mg脂质)制成的脂质体对大鼠进行滴注。BoNT的膀胱内剂量保持恒定且脂质浓度不同， 以确定最佳化的毒素脂质比。将脂质体BoNT的功效与盐水溶液中的游离BoNT进行比较。 滴注7天后，在氟烷麻醉过的大鼠中对减弱乙酸诱导的膀胱刺激的能力进行测试。根据已 出版的研究(Chuang等，2004)将滴注和功效评价之间的间隔期选择为7天。MM毒素与脂质的最佳比例1 0.5对在膀胱内滴注后提高BoNT的功效是有效的。较 高脂质比下功效降低可能是由于BoNT从多层脂质体中的释放很慢，从而使BoNT进入膀胱 的摄取效率低。实施例3 大鼠内乙酸诱导的膀胱过动症中膀胱内BoNT-A脂质体递送的尿动力效 应和免疫组织化学效应的评估材料和方法脂质体(LP)、肉毒杆菌毒素A (BoNT-A)和脂质毒素(Lipotoxin) (LP+BoNT-A)的制 备将LP(10mg，类脂)分散于生理盐水(Iml)中，其中所述分散液为脂质体形式。将BoNT-A 溶解于生理盐水(lml，20u/ml的盐水溶液，Allergan，Irvine，CA)中。通过改进的脱水-复 水囊泡法(Gregoriadis等，Methods 19，156-621999)制备包埋BoNT-A的LP (称作脂质毒 素)，所述方法中将20单位的BoNT-A载入IOmg的LP分散液(Iml)中。在不同的动物组中 保持相同剂量的BoNT-A。膀胱内压测量图(CMG)所有实验步骤均在雌性史-道二氏大鼠 (Sprague-Dawleyrat) (220gm 280gm)上进行，并在研究开始前得到了机构动物管理和使 用委员会(Institutional animal care and use committee)的检查禾口批准。通过皮下注 射尿烷(1.2g/kg)来麻醉动物。将PE-50管通过尿道插入膀胱中，并使其经由三通旋塞连 接至压力传感器和注射泵，以用于记录膀胱内压和将溶液灌输到膀胱中。第一天时，通过用 盐水(0.08ml/分钟)填充膀胱以引起重复排尿而进行对照CMG。对反射性膀胱收缩的幅 度、压力阈值(PT)、压力基准(PB)和收缩间隔(ICI)进行了记录。每一动物的测量值表示 3至5次膀胱收缩的平均值。第8天时，在盐水灌输过程中确定基准测量值后，我们将0.3%的乙酸(AA)以 0. 08ml/分钟灌输至膀胱中，以强烈地促使膀胱过动。灌输30分钟后测量3至5次膀胱收缩。药物的滴注在获得基准CMG后第1天，在氟烷麻醉下用绷带将PE-50管 (Clay-Adams, Parsippany, NJ)围绕尿道口原位绑定。使膀胱清空尿液，并通过导管填充 LP、BoNT-A或脂质毒素1小时。心脏灌注CMG研究后第8天，对一些动物(对每一组而言，N = 6)进行深度麻醉， 并经由心脏灌注处死，所述心脏灌注首先使用Krebs缓冲液随后用4%低聚甲醛固定剂。然 后对所述动物进行解剖以获得膀胱。组织学将组织学用膀胱组织固定于4%低聚甲醛的磷酸盐缓冲盐水(PBS)中 4小时，然后在30%蔗糖的PBS溶液中放置过夜。将组织学用样品包埋在石蜡中，切割成 IOym厚的片并用H&E染色。由AA诱导的炎症反应按以下O 3的分数分级0 没有炎性 细胞浸润或间质性水肿的迹象；1 轻度(少量炎性细胞浸润和少量间质水肿)；2 中度(中等量炎性细胞浸润和中度间质水肿)；3:严重(弥散存在大量炎性细胞浸润和严重的间质 水肿)。用于CGRP和SNAP-25的免疫荧光显微法作为选择，对样品进行冷冻并固定在 Tissue-Tek OCT 固定介质(Sakura Finetek, Torrance, CA, USA)中；在低温恒温器上切割 10 μ m厚的纵切片，并固定到SuperFrost载玻片上。通过在丙酮中浸渍15分钟固定切片， 然后在磷酸盐缓冲盐水(PBQ中洗涤，并通过在0. 3% H2O2的PBS溶液中温育切片10分钟 而封闭内源性过氧化物酶的活性。在PBS中进行进一步洗涤后，将切片在Image-iT 固定 信号增强剂(Molecular Probes, Invitrogen)中进行温育1小时。对于CGRP免疫染色，然 后用山羊抗CGRP多克隆抗体(Santa Cruz, 1 50稀释)在+4°C对载玻片进行染色48小 时。第二天然后在PBS中洗涤切片，并用驴抗山羊IgGFITC(Santa Cruz,l 2000稀释) 温育1小时。洗涤切片并固定在SlowFade抗褪色金试剂(Molecular Probes, Invitrogen) 中。对于SNAP-25免疫染色，然后用小鼠抗SNAP-25单克隆抗体(AbD，NC，USA，1 2000稀 释)在+4°C对载玻片进行染色过夜。第二天然后在PBS中洗涤切片，并用山羊抗小鼠IgG Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Invitrogen, 1 2000 稀释)温育 1 小时。为 了检测 肌肉纤维，用四甲基异硫氰酸罗达明(TRITC)标记的鬼笔环肽(Sigma，l 2000稀释)对 切片进行复染色，洗涤并固定在SlowFade抗褪色金试剂(Molecular Probes, Invitrogen) 中。用荧光显微镜检查载玻片，以记录图像。SNAP-25表达的蛋白质印迹分析对一些动物(对每一组而言，N = 6)进行深度麻 醉且不经心脏灌注处死。移出膀胱以根据标准方案(Amersham Biosciences)进行SNAP-25 表达的蛋白质印迹分析。超声处理和纯化之前，使样品在蛋白提取液(T-PER fierce Biotechnology)中进行均质处理。用 Bradford 蛋白测定法(Bio-feid Laboratories, Hercules, CA)测量总蛋白的量。使用Laemmli缓冲液系统进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电 泳(PAGE)。简言之，将相当于30yg蛋白质的一等分试样提取物加载到8%聚丙烯酰胺 凝胶上，在100V的恒定电压下进行电泳1小时，并转印至Hybond-P PVDF膜(Amersham Biosciences)。所述膜用封闭剂进行封闭，然后于+4°C用小鼠抗SNAP-25单克隆抗体(AbD， NC,USA, 1 500稀释)和小鼠抗β肌动蛋白单克隆抗体(Rockland,Gilbertsville,USA, 1 2000稀释)进行免疫印迹过夜。洗涤后，使用辣根过氧化物酶连接的抗兔或抗小鼠免 疫球蛋白G在室温下使用5%脱脂奶粉的TBS溶液对所述膜和二抗进行温育2小时。通过 增强型化学发光(ECL)检测系统(Amersham Biosciences)使蛋白质印迹可视化。还检测 了 β肌动蛋白的量作为内标。使用Lab Works ImageAcquisition and Analysis软件完 成定量分析。统计分析将定量数据表示为平均值加减平均值的标准误差。使用单向方差分析 和Bonferroni事后检验或者在适用时使用Kruskal-Wallis和Durm的事后检验进行统计 分析，并认为P < 0. 05有显著性。MM针对LP、BoNT-A和脂质毒素预处理的CMG响应在第1天膀胱内盐水滴注期间LP组(对照组),BoNT-A组和脂质毒素组的CMG参 数与第8天的上述参数没有显著不同。这些结果表明第8天时正常状况下的膀胱功能没有 受到LP、BoNT-A和脂质毒素的预处理的影响。第8天时，开始灌输后20分钟 30分钟，乙酸的刺激作用明显。在LP和BoNT-A预处理组中，膀胱内滴注AA后的收缩间隔(ICI)分别 明显地下降了 57. 2%和56.0%。但是，接受了预先脂质毒素处理的大鼠显示出对AA滴注 的响应明显降低(ICI降了 21. )。这些结果表明脂质毒素预处理抑制了 AA诱导的膀胱 过动症，在相同剂量的BoNT-A预处理组中没有观察到这种效应。对LP、BoNT-A和脂质毒素预处理的组织学响应如对用苏木精(hamatoxylin)和 曙红染色的组织切片的组织病理评估所确定的，AA滴注在LP和BoNT-A预处理组中诱导了 中度炎症反应。但是，AA诱导的炎症反应在脂质毒素预处理组中得到了明显的降低(与LP 和BoNT-A预处理组相比总炎症分数分别降低了 48. 9%和33. 3% )。这些结果表明脂质毒 素预处理抑制了 AA诱导的膀胱炎症。LP.BoNT-A和脂质毒素预处理的CGRP免疫染色脂质毒素预处理组中在膀胱粘膜 层处确认了 CGRP免疫染色，而在LP或BoNT-A预处理组中没有观察到这种情况。这些结果 表明脂质毒素预处理抑制了 CGRP释放。LP、BoNT-A和脂质毒素预处理的SNAP-25表达在LP和BoNT-A预处理动物的膀 胱样品中检测到SNAP-25阳性神经纤维。但是，在脂质毒素预处理动物中几乎不能观察 到SNAP-25阳性神经纤维。蛋白质印迹证明，相比于LP和BoNT-A预处理组，平均SNAP-25 蛋白水平分别有66. 4%的下降和58. 的下降。这些结果表明了脂质毒素预处理降低了 SNAP-25 表达。结论在LP和BoNT-A预处理大鼠中，在膀胱内滴注AA后收缩间隔(ICI)分别降低了 57. 2%和56.0%。但是，接受脂质毒素的大鼠显示出对AA滴注的响应有明显降低(ICI降 低了 21. 1% )。另外，与用LP或BoNT-A预处理的大鼠相比，脂质毒素预处理的大鼠在炎症 反应、SNAP-25表达上有明显的降低，在CGRP免疫反应性上增力Π。膀胱内脂质毒素的施用切 割SNAP-25并抑制了 CGRP从传入神经末端的释放，而且封闭了 AA诱导的膀胱过动症。这 些结果支持了 LP可作为递送BoNT-A的高效载体而无需进行注射，和避免了对逼尿肌的影 响。本研究的主要发现在于膀胱内脂质毒素预处理抑制了 AA诱导的膀胱过动症和炎 症反应，而在本动物模型中的LP和BoNT-A预处理组中没有观察到这种效果。没有观察到 尿潴留。另外，与该模型中的LP和BoNT-A预处理组相比，脂质毒素预处理组中的SNAP-25 的表达显著降低且CGRP显著增加。膀胱内脂质毒素滴注为递送BoNT-A提供更为简单且有 效的方法，而无需进行可能引发尿潴留的注射。
权利要求
1.一种用于滴注到膀胱中的脂质体制剂，所述制剂包含在药学上可接受的载体中的肉毒杆菌毒素。
2.如权利要求1所述的制剂，其中，将所述脂质与肉毒杆菌毒素的比例调节为使递送 最优化。
3.一种治疗膀胱过动症和下尿路症状的方法，所述方法包括将在脂质体载体中的肉毒 杆菌毒素滴注到膀胱中。
4.如权利要求1所述的制剂或如权利要求3所述的方法，其中，所述肉毒杆菌毒素是7 种血清型的一种或多种，而且是双链或单链。
5.如权利要求1所述的制剂或如权利要求3所述的方法，其中，所述肉毒杆菌毒素的剂 量小于为对膀胱过动症和下尿路症状获得相同效果而通过注射施用的剂量。
6.如权利要求1所述的制剂或如权利要求3所述的方法，其中，对进行滴注的制剂的体 积进行优化，以使摄取最优化。
7.如权利要求1所述的制剂，其中，将所述制剂滴注到其它体腔和体表，所述体腔和体 表包括阴道、肛门、直肠、皮肤、咽喉、口腔、鼻腔和气道。
全文摘要
本发明涉及一种脂质体，所述脂质体用于膀胱内药物递送，特别是肉毒杆菌毒素(BoNT)的递送，以通过减少膀胱刺激和尿频而帮助改善下尿路症状。本系统使用了较低且更为安全剂量的BoNT，降低了尿潴留的风险。以30ml～60ml的常用体积将作为液体制剂的脂质体-BoNT简单滴注到膀胱中，达到的功效与现今用膀胱镜针头注射BoNT达到的功效相似。所述剂量可以低于注射用量，从而使尿潴留风险显著减少。脂质体-BoNT可保护BoNT免受膀胱和尿液的破坏。脂质体-BoNT滴注对患者而言更为舒适，且与原本限于对膀胱镜BoNT注射熟练且经认证的医生中的治疗形式不同，脂质体-BoNT滴注可使更多的医生诊所提供这种治疗形式。
文档编号A61P13/10GK102065841SQ200980120455
公开日2011年5月18日 申请日期2009年4月3日 优先权日2008年4月4日
发明者乔纳森·H·考夫曼, 迈克尔·B·钱塞勒 申请人:里培拉药品公司