从亚麻籽中提取中性低聚糖混合物的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及从植物中提取的低聚糖，尤其是该类低聚糖在化妆品或皮肤病学领域 的应用。
[0002] 本发明具体涉及从亚麻籽中提取的中性低聚糖在化妆品或皮肤病领域的应用，以 及该类低聚糖的生产方法，例如亚麻籽粘胶的水解分离法。
[0003] 具体来说，亚麻籽中提取的中性低聚糖可以用于促进皮肤组织修复和防止皮肤衰 老。
[0004] 皮肤修复包含一系列具体实施步骤，以期达到修复遭受损伤的皮肤以及重塑接近 于原先未被损伤组织的目的。
[0005] 相反，皮肤衰老则是导致解剖学和组织学结构改变以及细胞功能改变的原因。
[0006] 皮肤衰老存在几个诱因，例如氧化应激导致的细胞的改变，此外还包括外部因素， 如污染，吸烟，饮酒，阳光暴晒等。
[0007] 皮肤衰老导致皱纹和色斑（常为棕色）的出现，以及皮肤张力下降。
【背景技术】
[0008] 现有技术中有一些措施可以去除可见的皮肤衰老痕迹。在这方面，涉及以下技 术：
[0009] -激光治疗，用于改善(棕忾）忾斑和细纹等问题;
[0010] -注射肉毒杆菌毒素，透明质酸或胶原；
[0011] _剥尚，主要包括明显去除一层表皮；
[0012] -面部整形手术（拉皮手术）；等。
[0013] 然而，现有技术存在一些有害的副作用，常常不能获得令人满意的结果。
[0014] 因此，近年来实验室研究已经开始采用一些其他措施以期达到更有效、更自然地 对抗皮肤衰老，以及延缓这一进程的目的。找到促进创伤后的皮肤组织修复的方法也十分 必要。
[0015] 具体来说，近年来已有化妆品成分中使用低聚糖以减少皮肤衰老痕迹的研究开展 起来。事实上，由于其具有保湿性能，糖基分子也引起了特别的关注。
[0016] 因此，一些涉及低聚糖化妆品成分的专利申请，特别是，专利申请国际公布W0 99/24009号公开了使用含木糖的低聚糖来提高一些化合物（如蛋白聚糖和氨基葡聚糖）的 合成量的用途。然而，在本方案中，木糖是一种商品，而不是植物中的天然产物。
[0017] 专利文献US 2007/0293433号公开了一种抗衰老成分，其中含有由果胶通过酶水 解得到的多种低聚糖，该成分也制成商品。
[0018] 从美国专利申请US2004/0097464号亦可获知一种含有低聚糖混合物的成分，即 岩藻糖，后者通过微生物进行水解得到。本方案所述低聚糖混合物，需要采用多步骤的复杂 实施方法得到，其中一些步骤需要利用病原微生物参与作用，而在化妆品的实际应用中这 些病原微生物则必须从该混合物中除去。
[0019] 此外，上述文献中所述的成分并没有起到足够有效的作用，即在刺激皮肤修复的 现有技术中并没有有效的解决方案。
[0020] 亦已公知，可以使用从亚麻科植物，即亚麻（Linum usitatissimum)中提取的活性 物质对抗衰老痕迹。
[0021] 国际专利申请W02008/043944号已公开：亚麻中提取的活性物质可以用于制备抗 皮肤衰老的化妆品的用途，以及其生产方法。
[0022] 然而，通过该专利申请所述方法获得的活性物质包括多种成分：单体糖，糖醛酸， 碳水化合物、高浓度的蛋白质等，且其中大多数蛋白质的分子量小于5000Da(道尔顿）。
[0023] 因此，组分的多样性不允许靶向性和特异性的反应发生，即所述的有差异的成分 无法有效地促进损伤的皮肤进行修复。
【发明内容】
[0024] 在本发明的框架中，申请人发现亚麻籽提取物中一些特定的低聚糖可以确保对所 需实施的现象（即皮肤组织修复过程）进行有效地刺激，并且已经开发出一种用于提取这 些低聚糖的方法。
[0025] 具体来说，这些都是通过超滤分离法得到的具有高分子量的中性低聚糖，其截留 分子量分别位于5, 000至15, OOODa之间，以及15, 000至50, OOODa之间。
[0026] 因此，本发明提供了一种从亚麻籽中提取中性低聚糖混合物的方法，所述低聚糖 具有高分子量，所述方法包括以下步骤：
[0027] -亚麻粘胶溶液进行酸性pH条件下的水解反应，所述亚麻粘胶溶液由亚麻籽经溶 剂萃取而得；
[0028] -所述溶液通过加入足量的碱进行中和；
[0029] -所述溶液通过孔径为50, OOODa的滤膜进行第一次超滤，以获得首次回流液和首 次透过液；
[0030] -所述首次透过液通过孔径为15, OOODa的滤膜进行第二次超滤，以获得二次回流 液和二次透过液；
[0031] -所述二次透过液通过孔径为5, OOODa的滤膜进行第三次超滤，以获得三次回流 液和三次透过液；
[0032] -将所述二次和三次回流液混合，以获得上文所述的低聚糖混合物，所述二次回流 液含有通过超滤分离方法得到的截留分子量位于15, 000至50, OOODa处的低聚糖，所述三 次回流液含有通过超滤分离方法得到的截留分子量位于5, 000至15, OOODa处的低聚糖。
[0033] 根据上述方法的进一步的特征：
[0034] -从亚麻轩中提取的过程最好在水溶剂中进行；
[0035] -所述粘胶溶液的水解过程优选于pH 2,反应温度为80°C，反应时间为24小时的 条件下进行；
[0036] -优选的实施方式是：所述粘胶溶液通过加入足量的强碱进行中和，可选的强碱 溶液至少包括氢氧化钡和氢氧化钠。
[0037] 本发明还涉及实施上述方法从亚麻籽中提取出的中性低聚糖混合物，所述由超滤 分离方法得到的混合物包含两类截留分子量的低聚糖，其中一类的截留分子量位于15, 000 至50, OOODa之间，另一类的截留分子量位于5, 000至15, OOODa之间。
[0038] 在一个具体的实施例中，所述混合物中含有的低聚糖，其糖链组成中至少包括岩 藻糖和/或果胶糖和/或半乳糖和/或葡萄糖和/或木糖。
[0039] 优选的方案是，所述混合物包含一类低比例的低聚糖，该低聚糖的糖链组成中含 有鼠李糖和低比例的糖醛酸。
[0040] 在皮肤美容或化妆品的应用过程中，亚麻籽中提取的中性低聚糖混合物可以有效 地用于对抗皮肤衰老问题或促进皮肤组织修复。
[0041] 所述混合物也可进一步用于刺激：
[0042] -成纤维细胞的增殖；
[0043] -成纤维细胞的趋化；
[0044] -成纤维细胞的细胞迀移；
[0045] -成纤维细胞合成III型和/或IV型胶原。
[0046] 亚麻籽中提取的中性低聚糖混合物也有利于促进成纤维细胞合成基膜聚糖以及 抑制成纤维细胞合成核心蛋白聚糖。
[0047] 所述混合物还可用于诱导角质形成细胞的分化。
[0048] 亚麻籽中提取的中性低聚糖混合物也可用于促进伤口愈合。
[0049] 本发明还涉及根据本方法得到的中性低聚糖混合物而制成的皮肤科用药或化妆 品成分，其包含至少一种可用于化妆品或皮肤科用药的赋形剂。
[0050] 该组成成分中中性低聚糖的优选浓度在0. 1至5mg/mL之间。
[0051] 根据一个具体实施例，利用本发明方法从亚麻籽中提取的中性低聚糖混合物也可 以具体用作促进组织愈合的药物，即慢性溃疡或手术后用药。
[0052] 本发明的其他特点和优势，将从以下参照附图对本发明的非限制性实施例的详细 说明中呈现得更加清晰。
【附图说明】
[0053] 图1所示表格中总结了从亚麻籽粘胶中获得的样本E1至E7的表征结果，其中E4 和E6为所需成分，在表中圈出。
[0054] 图2A，B和C的柱状图为利用比色法对活细胞数量进行检测的结果，如图所示：从 亚麻籽中提取的中性低聚糖对成纤维细胞没有细胞毒性，不同浓度低聚糖处理均未见细胞 毒性。
[0055] 图3显示了从亚麻籽中提取的中性低聚糖经不同时间（24,48和72小时）孵育后 对成纤维细胞增殖的影响。
[0056] 图4的柱状图显示，细胞迀移的数量取决于其是否经亚麻籽中提取的中性低聚糖 暴露。
[0057] 图5显示出成纤维细胞的迀移取决于亚麻籽中提取的中性低聚糖的处理浓度。
[0058] 图6为经低聚糖组分处理或未处理时的成纤维细胞的不同路径示意图。
[0059] 图7A和7B的柱状图显示了低聚糖处理24小时（图7A)或48小时（图7B)后 III型胶原的合成情况。
[0060] 图8的免疫印迹膜照片显示了经亚麻籽中低聚糖处理或未处理的成纤维细胞中 IV型胶原的表达情况。
[0061] 图9的琼脂糖凝胶电泳照片显示了经亚麻籽中低聚糖处理或未处理的成纤维细 胞中核心蛋白聚糖和基膜聚糖的基因表达情况；以GAPDH基因作为内参对照。
【具体实施方式】
[0062] 本发明涉及一种从亚麻籽（即亚麻Linun usitatissimum)中获得中性低聚糖混 合物的方法。所述混合物通过可控的水解反应获得，然后从亚麻籽粘胶溶液中分离，而亚麻 籽粘胶则可从所述种子中经溶剂萃取而得。
[0063] 在下文说明中，"低聚糖"是指由粘胶经热酸水解产生的糖的低聚物或聚合物，包 括所有分子量可以通过50