专利名称：一种从亚麻籽中提取纯化开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的方法
技术领域：
一种从亚麻籽中提取纯化开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的方法，本发明涉及亚麻木酚素的提取纯化方法，属于农产品资源开发和功能性保健食品技术领域。
背景技术：
木酚素是一种存在于植物中的具有雌激素活性的物质。亚麻籽中富含亚麻木酚素，其主要组分是开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷，英文名secoisolariciresinol diglucoside，简称为SDG，它是一种由苯丙素双分子聚合而成的二芳基丁烷类木酚素，具有一种温和的酷似人体雌性激素的功能。它具有抑制人体乳腺癌细胞生长、减小乳腺肿瘤、降低乳腺癌发生率、减轻妇女绝经期症状、预防结肠癌、抑制前列腺癌等活性，还对狼疮性肾炎、I-型糖尿病和II-型糖尿病起到辅助治疗的作用。
亚麻籽是SDG最重要的来源，亚麻籽中SDG含量达到11.7～24.1g/千克脱脂亚麻籽粕，是其他作物中SDG含量的75～800倍。同时，SDG在亚麻籽中的分布主要集中在亚麻籽壳部分，因而选用亚麻籽壳作为SDG的提取原料。
从亚麻籽中提取或者回收SDG的研究始于上世纪90年代。在专利US6,806,356中，丙酮水溶液被用来提取亚麻木酚素，在专利US 6,767,565中，乙醇水溶液则被用来提取，然后采用超滤(MWCO 1000～5000)或树脂吸附进行纯化，产品的纯度可以达到10％～40％之间。US 6,264,853采用乙醇水溶液提取SDG与肉桂酸糖苷和羟甲基戊二酸的复合物，然后采用分离范围30,000～100,000Da的柱色谱进行分离纯化，产品中SDG含量可达到50％。这些方法没有进行进一步的色谱纯化，所得亚麻木酚素产品的纯度较低。
在高纯度亚麻木酚素的制备方面，专利US 5,705,618中采用乙醇或甲醇水溶液进行提取，采用液/液分配或阴离子交换树脂进行富集，然后在C18反相色谱柱上进行纯化，产品纯度达到90％以上。专利CN01120199.1和CN02803980.7也分别采用硅胶吸附和C18反相色谱分离的方法制备得到纯度90％以上的亚麻木酚素产品。
由于受到分离纯化阶段的限制，这种制备SDG的方法成本较高，规模受到较大限制。同时在采用硅胶吸附时，所用溶剂包含甲醇、氯仿和二氯甲烷等有毒溶剂，所以应用空间受到较大限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种从亚麻籽中提取纯化开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的方法，为亚麻籽的综合利用提供一种新的方法，同时也提供一种功能性食品配料和保健食品。
本发明的技术方案以粉碎的亚麻籽壳和/或亚麻籽粕为原料，采用低极性有机溶剂低温浸提脱脂，然后采用乙醇溶液提取，提取液中加入碱进行水解，中和并调pH，抽滤，减压浓缩，以无水乙醇复溶并微滤得到清液，滤液上凝胶柱进行分离纯化。
(1)粉碎亚麻籽壳和/或亚麻籽粕粉碎到粒度为30～100目。
(2)脱脂按10～20mL/g亚麻籽粉加入低极性有机溶剂，在室温下搅拌1～2h，然后离心，上清液回收溶剂和亚麻籽油，残渣再次按5～10mL/g亚麻籽粉加入低极性有机溶剂在相同条件下脱脂。脱脂所用的低极性有机溶剂为正己烷或6号溶剂油。这种脱脂方法对亚麻木酚素无不良影响，同时也去除了乙醇溶液提取时的大量杂质。
(3)提取按5～30mL/g脱脂亚麻籽粉加入体积浓度40％～70％的乙醇溶液，在25～65℃搅拌提取2～4h，离心，残渣按5mL/g脱脂亚麻籽粉加入体积浓度40％～70％的乙醇溶液在25～65℃再次搅拌提取1h，然后离心。提取时最佳的乙醇用量为15～20mL/g脱脂亚麻籽粉，乙醇体积浓度为50％～60％，温度为50～60℃。选择50～60℃的温度，一方面对SDG无明显不良影响，另一方面大大缩短了提取时间，提取时间与温度负相关。
(4)水解合并两次提取得到的清液，加入碱溶液使得最终碱液浓度在0.25～0.5M，在30℃下震荡或搅拌2h进行水解。水解所用的碱溶液为氢氧化钠溶液。
(5)调节pH水解结束后，水解液用酸中和碱并调节pH 4～6，所用的酸溶液为盐酸。
(6)抽滤、减压浓缩、复溶与微滤采用孔径30μm中速滤纸抽滤中和后的悬浊液，然后以适量的体积浓度40％～70％的乙醇溶液洗涤残渣并合并滤液，将滤液在减压条件下浓缩至浓稠浆料状，减压浓缩时，温度控制在70℃以下。加入适量无水乙醇复溶，然后用微滤膜进行微滤，微滤所用滤膜为孔径0.45μm的微滤膜。
(7)凝胶柱分离纯化微滤液直接上柱，凝胶介质为Sephadex LH-20，柱长径比控制为70∶1，上样后以去离子水洗脱，线性流速在0.5～0.7cm/min，采用紫外检测仪在280nm下检测，洗脱液在280nm下无吸收峰时作为洗脱结束；样品洗脱后的凝胶柱介质以乙醇溶液清洗，供下一次凝胶柱分离纯化使用。
(8)冷冻干燥及产物验证凝胶柱分离得到的开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷组分，减压浓缩后经过冷冻干燥得到冻干粉，该冻干粉经过HPLC-MS、UV及NMR验证，确定开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷为产物的主要成分，含量在90％以上。
凝胶柱介质的清洗目标物开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷洗脱后的凝胶柱介质，以体积浓度50％～95％的乙醇溶液逐步清洗介质，采用95％乙醇洗涤2个柱体积后再逐步降低乙醇浓度直至去离子水进行清洗，清洗后的介质供下一次凝胶柱分离纯化使用；清洗介质所用的乙醇回收利用。
本发明的有益效果本发明采用有机溶剂提取、Sephadex LH-20凝胶柱分离纯化SDG的方法具有以下特点(1)克服了现有技术制备色谱中存在的批量小、成本高的不足，代之以便于放大的Sephadex LH-20凝胶柱色谱来分离纯化；(2)工艺流程简单，产品纯度高，便于推广应用；(3)采用乙醇为提取和洗脱溶剂，提高了生产过程与产品的安全性，同时容易回收，克服了硅胶吸附解吸时使用毒性较大的有机溶剂的问题。
利用本发明提供的提取纯化SDG的方法，可以在安全性、经济性、制备规模和产品纯度上体现其优势。SDG的用途是功能性食品配料或保健食品。
图1提取和纯化SDG的工艺流程。
图2纯化所得SDG产品的HPLC图谱及其紫外吸收图谱。
图3SDG的1H-NMR谱图。
图4SDG的13C-NMR谱图。
具体实施例方式
本发明的方法并非限定于此实施例。
实施例1称取亚麻籽壳50g，粉碎至30目，加入体积500mL正己烷，在室温下搅拌1h，然后离心(3000rpm，20min)。残渣再次采用500mL正己烷脱脂。向脱脂亚麻籽壳中加入1000mL 50％的乙醇溶液，在25℃下搅拌提取4h。然后离心(3000rpm，20min)，残渣中加入250mL 50％的乙醇溶液搅拌提取1h，然后离心。合并提取液，加入60mL 6M NaOH溶液，在30℃下搅拌2h，然后加入6M盐酸，调节pH至4。然后抽滤并以适量乙醇洗涤残渣，合并滤液。将滤液在减压条件下浓缩至浓稠浆料状，加入适量无水乙醇复溶，然后微滤(0.45μm)。然后在Sephadex LH-20柱上上样洗脱，柱长100cm，柱直径1.60cm。上样后以去离子水洗脱，线性流速在0.5cm/min，紫外检测波长280nm。凝胶柱分离得到的SDG组分，采用HPLC-MS、UV和NMR验证，确定SDG为主要成分，含量为94％。SDG产品的HPLC图谱及其紫外吸收图谱、1H-NMR谱图和13C-NMR谱图如附图2、3、4所示。
目标物开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷洗脱后的凝胶柱介质，以体积浓度50％～95％的乙醇溶液逐步清洗，采用95％乙醇洗涤2个柱体积后再逐步降低乙醇浓度直至去离子水进行清洗，清洗后的介质供下一次凝胶柱分离纯化使用。清洗介质所用的乙醇回收利用。
实施例2称取亚麻籽50g，粉碎至100目，加入体积1000mL 6号溶剂油，在室温下搅拌2h，然后离心(3000rpm，20min)。残渣再次采用250mL 6号溶剂油脱脂。向脱脂亚麻籽壳中加入500mL 60％的乙醇溶液，在60℃下搅拌提取2h。然后离心(3000rpm，20min)，残渣中加入250mL 60％的乙醇溶液搅拌提取1h，然后离心。合并提取液，加入75mL 6M NaOH溶液，在30℃下搅拌2h，然后加入6M盐酸，调节pH至6。然后抽滤并以适量乙醇洗涤残渣，合并滤液。将滤液在减压条件下浓缩至浓稠浆料状，加入适量无水乙醇复溶，然后微滤(0.45μm)。然后在Sephadex LH-20柱上上样洗脱，柱长100cm，柱直径1.60cm。上样后以去离子水洗脱，线性流速在0.7cm/min，紫外检测波长280nm。凝胶柱分离得到的SDG组分，采用HPLC-MS、UV和NMR验证，确定SDG为主要成分，含量为96％。
目标物开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷洗脱后的凝胶柱介质，以体积浓度50％～95％的乙醇溶液逐步清洗，采用95％乙醇洗涤2个柱体积后再逐步降低乙醇浓度直至去离子水进行清洗，清洗后的介质供下一次凝胶柱分离纯化使用。清洗介质所用的乙醇回收利用。
权利要求
1.一种从亚麻籽中提取纯化开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的方法，其特征在于以粉碎的亚麻籽壳和/或亚麻籽粕为原料，采用低极性有机溶剂低温浸提脱脂，然后采用乙醇溶液提取，提取液中加入碱进行水解，中和并调pH，抽滤，减压浓缩，以无水乙醇复溶并微滤得到清液，滤液上凝胶柱进行分离纯化；(1)粉碎亚麻籽壳和/或亚麻籽粕粉碎到粒度为30～100目；(2)脱脂按10～20mL/g亚麻籽粉加入低极性有机溶剂，在室温下搅拌1～2h，然后离心，上清液回收溶剂和亚麻籽油，残渣再次按5～10mL/g亚麻籽粉加入低极性有机溶剂在相同条件下脱脂；(3)提取按5～30mL/g脱脂亚麻籽粉加入体积浓度40％～70％的乙醇溶液，在25～65℃搅拌提取2～4h，离心，残渣按5mL/g脱脂亚麻籽粉加入体积浓度40％～70％的乙醇溶液在25～65℃再次搅拌提取1h，然后离心；(4)水解合并两次提取得到的清液，加入碱溶液使得最终碱液浓度在0.25～0.5M，在30℃下震荡或搅拌2h进行水解；(5)调节pH水解结束后，水解液用酸中和碱并调节pH4～6；(6)抽滤、减压浓缩、复溶与微滤采用孔径30μm中速滤纸抽滤中和后的悬浊液，然后以适量的体积浓度40％～70％的乙醇溶液洗涤残渣并合并滤液，将滤液在减压条件下浓缩至浓稠浆料状，加入适量无水乙醇复溶，然后用微滤膜进行微滤；(7)凝胶柱分离纯化微滤液直接上柱，凝胶介质为Sephadex LH-20，柱长径比控制为70∶1，上样后以去离子水洗脱，线性流速在0.5～0.7cm/min，采用紫外检测仪在280nm下检测，洗脱液在280nm下无吸收峰时作为洗脱结束；样品洗脱后的凝胶柱介质以乙醇溶液清洗，供下一次凝胶柱分离纯化使用；(8)冷冻干燥及产物验证凝胶柱分离得到的开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷组分，减压浓缩后经过冷冻干燥得到冻干粉，该冻干粉经过HPLC-MS、UV及NMR验证，确定开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷为产物的主要成分，含量在90％以上。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征是脱脂所用的低极性有机溶剂为正己烷或6号溶剂油。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征是提取时最佳的乙醇用量为15～20mL/g脱脂亚麻籽粉，乙醇体积浓度为50％～60％，温度为50～60℃。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征是水解所用的碱溶液为氢氧化钠溶液。
5.按照权利要求1所述的方法，其特征是调节pH所用的酸溶液为盐酸。
6.按照权利要求1所述的方法，其特征是微滤所用滤膜为孔径0.45μm的微滤膜。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征是减压浓缩时，温度控制在70℃以下。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征是凝胶柱介质的清洗目标物开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷洗脱后的凝胶柱介质，以体积浓度50％～95％的乙醇溶液逐步清洗，采用95％乙醇洗涤2个柱体积后再逐步降低乙醇浓度直至去离子水进行清洗，清洗后的介质供下一次凝胶柱分离纯化使用；清洗介质所用的乙醇回收利用。
全文摘要
一种从亚麻籽中提取纯化开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷的方法，属于农产品资源开发和功能性保健食品技术领域。本发明以粉碎的亚麻籽壳和/或亚麻籽粕为原料，采用低极性有机溶剂低温浸提脱脂，然后采用乙醇溶液提取，提取液中加入碱进行水解，中和并调pH，抽滤，减压浓缩，以无水乙醇复溶并微滤得到清液，滤液上凝胶柱进行分离纯化，得到开环异落叶松树脂酚二葡萄糖苷(SDG)产品。本发明克服了硅胶柱吸附分离时所用溶剂包含甲醇、氯仿和二氯甲烷等有毒溶剂的限制，本方法在安全性、经济性、制备规模和产品纯度上体现其优势，产品SDG的用途是功能性食品配料或保健食品。
文档编号C07H15/203GK1814608SQ20061003863
公开日2006年8月9日 申请日期2006年3月2日 优先权日2006年3月2日
发明者许时婴, 王璋, 张文斌, 张晓鸣, 钟芳 申请人:江南大学