用于癌症免疫治疗的靶向肾母细胞瘤基因wt-1的基于沙门菌的载体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及含有编码肾母细胞瘤（Wilms' tumor)蛋白1的重组DNA分子的减毒 沙门菌突变株。具体地，本发明涉及所述减毒沙门菌突变株在肿瘤免疫治疗中的用途。
【背景技术】
[0002] 肾母细胞瘤基因1 (WT1)编码锌指蛋白转录因子，参与细胞增殖和分化。其在许多 恶性肿瘤包括若干类型的血液肿瘤和多种实体瘤中高表达。相反地，成年个体的正常组织 中WT1表达限于生殖腺、子宫、肾、间皮以及多种类型组织中的⑶34+祖细胞。WT1原来被认 为是肿瘤抑制基因。但是，近来的证据显示该转录因子的致瘤作用；Wt-Ι负调控祖细胞的 分化并且促进祖细胞的增殖。此外，过表达WT1产生免疫原性；在癌患者中检测到WT1特异 性T细胞以及IgG抗WT1抗体。因此，WT-1是开发癌症疫苗的一种有希望的候选。
[0003] 使用基于HLA(人白细胞抗原）_限制性的WT1肽片段的WT1疫苗的人体临床试验 已有报道。Osada et al.，Clin Cancer Res 2009;15:2789-2796,公开了编码 WT1 的腺病 毒疫苗。
[0004] 就发明人所知，尚没有靶向WT1的活细菌肿瘤疫苗的报道。此外，尚没有靶向WT1 的口服肿瘤疫苗的报道。
[0005] 肠炎沙门菌的减毒衍生物是可用于递送异种抗原到哺乳动物免疫系统的有吸引 力的载体，由于肠炎沙门菌可被通过黏膜免疫途径即经口或鼻递送，这与肠胃外给药相比 提供了简单和安全的便利。此外，沙门菌菌株可在全身和黏膜腔的水平激发强的体液和细 胞免疫应答。批量制备的成本相对较低，并且活细菌疫苗制剂非常稳定。通过缺失多种基 因包括毒性基因、调苄基因和代谢基因可实现减毒。
[0006] 通过aro突变减毒的数种鼠伤寒沙门菌已在动物模型中显示出是异种抗原的安 全且有效的递送载体。
[0007] 通过活性减毒鼠伤寒沙门菌菌株将编码抗原特别是VFGE受体蛋白的DNA构建体 递送进入小鼠革巴细胞的方法见W0 03/073995中所述。Niethammer等人（Nature Medicine 2002, 8 (12)，1369)证明含有编码鼠血管内皮生长因子受体2 (VEGFR-2或FLK-1，其是肿瘤 血管形成所必需的）表达载体的减毒鼠伤寒沙门菌aroA菌株SL7207具有肿瘤疫苗功能。
[0008] 但是只有一种减毒肠炎沙门菌血清型菌株，称为伤寒沙门菌Ty21a(缩写为： S.typhi Ty21a)，被接受用于人体并且以商品名称Viv〇tifk (Berna Biotech Ltd·, a Crucell Company,瑞士；1996年12月16日公开的销售许可号PL 15747/0001)销售。
[0009] 所述针对伤寒的耐受性好的活口服疫苗是通过野生型致命细菌分离株S. typhi Ty2经化学诱变获得的，并且包含galE基因功能缺失突变以及其他未经确定的突变。其在 经过现场试验显示为有效并且安全后已在许多国家被许可为伤寒疫苗。
[0010] WT1是可用于开发癌症疫苗的有希望的肿瘤抗原。以前获得WT1肽疫苗的主要限 制是HLA-限制和肠胃外给药。非常需要改良基于靶向WT1的癌症治疗方法，迄今尚未实现。
【发明内容】
[0011] 考虑到现有技术，本发明的一个目标是提供新的口服的靶向WT1的癌症疫苗。所 述靶向WT1的癌症疫苗的主要优势为可优化癌症患者的治疗选择。
[0012] -方面，本发明涉及沙门菌的减毒突变株，其包含至少一个拷贝的含有编码肾母 细胞瘤蛋白1(WT1)表达盒的重组DNA分子。
[0013] 本发明的减毒沙门菌株在接种鼠白血病细胞的小鼠模型体内显示出抗肿瘤活性。 据发明人所知，该新的减毒沙门菌菌株是第一个靶向WT1的活细菌癌症疫苗。此外，本发明 的减毒沙门菌菌株是第一个靶向WT1的口服癌症疫苗。由于WT1在多种血液肿瘤和实体瘤 中过表达，本发明的减毒沙门菌菌株具有很大潜力作为通用癌症疫苗。
[0014] 首次研究中，本发明的疫苗（VXM06)经验证可有效延长腹膜内植入白血病细胞的 小鼠的存活。结果表明，接种VXM06疫苗可引起免疫应答并且产生针对过表达WT1肿瘤细胞 的免疫记忆。值得注意且令人惊讶的是，新疫苗VXM06在相对低剂量时是有效的。本发明 的减毒沙门菌突变菌株可以单一疗法应用或者与另外的含有编码其他肿瘤抗原的DNA分 子的沙门菌减毒突变株组合应用。此外，本发明的减毒突变株可与化学疗法、放射疗法或生 物学癌症疗法组合施用。使用VXM06治疗也可能是有效的，如果患者对化学疗法产生抗性 (化疗耐受性患者）。本发明的新的减毒沙门菌菌株因此可用于新的、极大改进的癌症治疗 方法中。
[0015] 在具体的实施方案中，所述沙门菌减毒突变株属于肠炎沙门菌种。在具体的实施 方案中，所述沙门菌减毒突变株是伤寒沙门菌Ty2la。
[0016] 在具体的实施方案中，表达盒是真核表达盒。
[0017] 在具体的实施方案中，WT1选自包含人WT1和与其具有至少约80%序列同一度的 蛋白的组。
[0018] 在具体的实施方案中，WT1是截短的。在具体的实施方案中，WT1的锌指蛋白结构 域缺失。在具体的实施方案中，截短的WT1氨基酸序列如SEQ ID N01所示。
[0019] 在具体的实施方案中，重组DNA分子包含卡那霉素抗生素抗性基因、pMBlori和受 CMV启动子控制的编码人WT1或与其具有至少80%序列同一度的蛋白尤其是截短的人WT1 的真核表达盒。在具体的实施方案中，重组DNA分子是pVAXIO. hWTl质粒并且含有SEQ ID NO 2所示的核酸序列。
[0020] 在具体的实施方案中，所述沙门菌减毒突变株可用作药剂。
[0021] 在具体的实施方案中，所述沙门菌减毒突变株可用作疫苗。
[0022] 在具体的实施方案中，所述沙门菌减毒突变株可用于癌症免疫治疗。
[0023] 在具体的实施方案中，癌症免疫治疗还包括施用包含至少一个拷贝的含有编码肿 瘤抗原和/或肿瘤间质抗原的表达盒的重组DNA分子的一种或多种另外的沙门菌减毒突变 株。在具体的实施方案中，所述一种或多种另外的沙门菌减毒突变株是包含真核表达盒的 伤寒沙门菌Ty21a。在具体的实施方案中，所述一种或多种另外的沙门菌菌株包含编码人 VEGFR-2的沙门菌减毒突变株。
[0024] 在具体的实施方案中，将所述沙门菌减毒突变株与所述一种或多种另外的沙门菌 减毒突变株共同施用。
[0025] 在具体的实施方案中，癌症免疫治疗伴随化学疗法、放射疗法或生物学癌症疗法。
[0026] 在具体的实施方案中，所述沙门菌减毒突变株是在化学疗法或放射疗法治疗周期 中或者生物学癌症疗法过程中施用的。
[0027] 在具体的实施方案中，所述沙门菌减毒突变株是在化学疗法或放射疗法治疗周期 之前或者生物学癌症疗法之前施用的。
[0028] 在具体的实施方案中，所述沙门菌减毒突变株是在化学疗法或放射疗法治疗周期 之后或者生物学癌症疗法之后施用的。
[0029] 在另外的实施方案中，所述沙门菌减毒突变株是在化学疗法、放射疗法治疗周期 或者生物学癌症疗法至少一种之前或过程中施用的。如果实施化学疗法、放射疗法或者生 物学癌症疗法中的多于一种，则所述沙门菌减毒突变株可在所述疗法的至少一种之前或过 程中或者之前和过程中施用，特别地在所述疗法的至少2种的过程中施用。
[0030] 在具体的实施方案中，所述沙门菌减毒突变株经口腔施用。
[0031] 在具体的实施方案中，所述癌症选自白血病，具体地选自急性髓样白血病（AML) 和急性淋巴样白血病（ALL)，和实体瘤，具体地选自肺癌、乳癌、食管癌、结肠癌、结肠直肠 癌、胃癌、胆管导管癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤、头颈部癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状 腺癌、宫颈癌、子宫内膜癌、卵巢癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、前列腺癌。
[0032] 在具体的实施方案中，单剂量从约105到约10 n，具体地从约106到约10 '更具体 地从约1〇6到约10 9,更具体地从约1〇6到约10 8,最具体地从约1〇6到约10 7菌落形成单位 (CFU)〇
[0033] 在具体的实施方案中，将所述沙门菌减毒突变株用于个体化癌症免疫治疗，其包 括评估患者的肿瘤抗原表达模式和/或间质抗原表达模式的步骤。
【具体实施方式】
[0034] 通过参考以下对本发明的具体描述以及其中所包含的实施例，可更容易地理解本 发明。
[0035] 在一个方面，本发明涉及包含至少一个拷贝的含有编码肾母细胞瘤蛋白（WT1)表 达盒的重组DNA分子的沙门菌减毒突变株。
[0036] 本发明中，所述沙门菌减毒突变株可作为含有编码肾母细胞瘤蛋白（WT1)表达盒 的重组DNA分子的细菌载体，用于将所述重组DNA分子递送到靶细胞中。
[0037] 本发明中，术语"减毒的"是指与不含减毒突变的亲代细菌菌株相比减低毒性的细 菌菌株。减毒的细菌菌株优选地丧失其毒性但保留其诱导保护性免疫的能力。减毒可通过 缺失多种基因包括毒性基因、调苄基因和代谢基因实现。减毒的细菌可存在于自然界或者 可在实验室中人工产生，例如通过适应新的培养基或细胞