可用于靶向、检测、成像和治疗的组合物以及其生产和使用方法

可用于靶向、检测、成像和治疗的组合物以及其生产和使用方法
【专利摘要】本文公开了可用于靶向检测、成像和治疗的组合物，以及其生产和使用方法。
【专利说明】可用于靶向、检测、成像和治疗的组合物以及其生产和使用方法
[0001]相关申请的交叉引用
按照35 U.S.C.119(e)，本申请要求2010年9月28日提交的US序列号61/387，137的权益。上述申请的全部内容明确地通过引用并入本文。
[0002]关于由联邦政府赞助的研究或开发的声明 不适用。
[0003]发明构思背景 1.发明构思领域 此公开并要求权益的发明构思一般涉及可用于靶向检测和/或治疗的组合物，以及其生产和使用方法。
[0004]2.【背景技术】描述
靶向的微气泡(miciObubble)是重要的且新出现的超声分子成像和治疗工具。许多疾病状态诸如(但不限于)癌、炎症和血栓形成具有独特的血管腔表面上的蛋白的表达。
[0005]Lanza等人(1996)描述了生物素化的生物标志物、抗生物素蛋白和全氟化碳乳液的序贯递送。在US专利7，186，399中，Lanza等人描述了活体内或活体外基于配体进行的脂质包封粒子与表面上分子表位结合方法。这是通过用生物素活化试剂活化的位点特异性配体、抗生物素蛋白活化试剂和用生物素活化试剂活化的脂质包封粒子的序贯递送来完成的。
[0006]文献中还描述了靶向的造影剂的更高阶聚集体的同时递送。这些更高阶聚集体采用不同组合形式的微气泡、脂质体、纳米粒、泡泡脂质体、脂质体微泡、纳米结构材料、超分子聚集体、量子点、纳米管和胶束。这些粒子中有许多是多模态的并具有治疗特性。例如参见，Lentacker 等人(2010) ；Suzuki 等人(2007 和 2008) ；Myhr 等人(2006) ；Tinkov 等人(2009) ;Kheirolomoom 等人(2007) ；Huang (2008) ;Kim 等人(2009) ；Cai 等人(2008)；Accardo 等人(2009) ；Ghaleb 等人(2008) ；Husseini 等人(2008) ；Schroeder 等人(2009)；McCarthy等人(2008);US专利7，078，015。上面引用的每一专利和公开文件的全部内容据此明确地通过引用并入本文。
[0007]令人遗憾的是，靶位点处所保留的微气泡的典型粘着率低(数量级为10个微气泡/微升组织(Dayton,2009)),即使在加了听福射力的情况下。特别是，Dayton (2009)列出了靶向的造影剂技术的以下限制:(1)粘着于靶位点的造影剂数量少；(2)缺乏对少量造影剂的灵敏度；和(3)来自循环性未靶向的造影剂的高背景。这些限制在下文中进行更详细的讨论。
[0008]尽管靶向的超声造影剂表现出良好的疾病特异性，但是疾病状态的诊断受限于成像技术可达到的灵敏度。当造影剂靶向特异性位点时，它们限于腔内皮表面上可用的结合位点数目，因此一个结合位点仅容许单个微气泡的结合。此外，微气泡与内皮表面上位点的相互作用受限于穿经腔的血流所产生的剪切力；因此，微气泡不能与它不“触及”(即，与之接触)的表面结合。因此，现有技术方法导致约10个微气泡/微升的典型结合水平。[0009]现有技术的进一步技术限制在于成像设备:对于超声，可见到深度和频率依赖性衰减，并且在高功率(high power)成像下,高峰值负压导致微气泡爆裂。此外,采用其它成像模式诸如但不限于MRI和PET时，可见到类似的深度限制。
[0010]因此，在本领域中需要可用于靶向成像和/或治疗的新的和改良的试剂。此公开并要求权益的发明构思涉及这样的组合物以及其生产和使用方法。
【专利附图】

【附图说明】
[0011]图1描绘此公开并要求权益的发明构思的通用多模态靶向和治疗系统。
[0012]图2阐释此公开并要求权益的发明构思的可序贯递送的可组合制剂。
[0013]图3以图形描绘扩增(amplification)改善造影剂成像穿透度。
[0014]图4以图形描绘随频率的I mm3组织中功率耗散(power dissipation)的变化。
[0015]图5以图形描绘随频率的加热时间的变化。
[0016]图6A以图形描绘单个靶向脂质体的单阶段扩增。靶向脂质体(I阶段试剂)以黑色显示。[0017]图6B以图形描绘单个靶向脂质体的第二阶段扩增。单个靶向脂质体以黑色显示，九个粘着性扩增脂质体(II阶段试剂)以灰色显示。形成最终粘着性簇的二十八个成像脂质体(III阶段试剂)以空心圆显示。
[0018]图7a阐释确立信号幅度和微气泡结合之间关系的剂量反应曲线。图7b中表格总结利用BIACORE ? XlOO光学生物传感器(BIACORE? XlOO Optical Biosensor)进行的微气泡多阶段扩增。
[0019]图8-10含暗相(dark phase)共焦显微术的显微照片,它们阐释多阶段复合体的活体外原位组装。图8阐释I阶段结合(即，靶向试剂的结合)，图9阐释II阶段结合(即，扩增试剂的结合)，图10阐释III阶段结合(即，成像试剂的结合)。
[0020]图11含显微照片，它们阐释I阶段靶向和II阶段扩增的活体外组装。
[0021]发明构思的详细说明
在经示例性的附图、试验、结果和实验室程序来详细地阐明本发明构思的至少一个实施方案之前，应理解，本发明构思并不将其应用限于下文中所阐述的或者附图、试验和/或结果中所阐释的构造细节和组分安排。本发明构思能有其它实施方案，或者能以多个不同方式来实践或执行。因而，本文中所用语言意在以最宽的可能范围和含义给出；且实施方案意在是示例性的而非穷举性的。同样，应理解，本文中所用措辞和术语是用于说明目的，不应被视为是限制性的。
[0022]除本文中另有定义外，此公开并要求权益的发明构思方面所用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除上下文另有要求外，单数术语应包括复数对象，复数术语应包括单数对象。一般，本文中所述细胞和组织培养、分子生物学和蛋白质以及寡或多核苷酸化学和杂交方面所用的命名法和技术是众所周知和本领域通常使用的那些。对于重组DNA、寡核苷酸合成以及组织培养和转化(例如，电穿孔、脂质转染)，使用标准技术。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书进行，或如本领域通常实行的或如本文所述的那样来进行。前述技术和程序一般根据在本领域众所周知的常规方法进行，以及如本说明书各处所提及和讨论的各个一般和更具体参考文献所述的那样来进行。参见，例如，Sambrook 等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual (第 2 版，Cold SpringHarbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(1989),和Coligan等人，CurrentProtocols in Immunology (Current Protocols, Wiley Interscience (1994)),所述文献通过引用并入本文。本文中所述分析化学、合成有机化学以及药物和制药化学方面所用的命名法以及实验室程序和技术是众所周知和本领域通常使用的那些。对于化学合成、化学分析、药物制备、制剂和递送、以及患者的治疗，使用标准技术。
[0023]本说明书中提及的所有公开文件和专利申请反映本发明所属领域技术人员的技术水平。所有公开文件和专利申请通过引用并入本文，其程度就如同每一件公开文件或专利申请被专门和逐一指出通过引用并入一样。
[0024]借鉴于本公开，不经过度的试验即可制造和执行所有在此公开并要求权益的组合物和/或方法。尽管利用优选实施方案对本发明组合物和方法进行描述，但对本领域技术人员显而易见的是，在不背离本发明构思、精神和范围的情况下，可以对本文中所述组合物和/或方法以及方法步骤或方法步骤次序施加变化。所有此类对本领域技术人员显而易见的类似置换和改进视为处于如所附权利要求所定义的发明构思的精神、范围和构思之内。
[0025]除另有指示外，依照本公开所使用的以下术语应理解为具有以下含义:
当和权利要求和/或说明书中的术语“包含”一起使用时，措词“一”的使用可能意指“一个”，但它也符合“一或多个”、“至少一个”和“一或多于一个”的含义。权利要求中术语“或”的使用是用于意指“和/或”，除非明确地指出仅指备选方案或者备选方案是互斥的(尽管公开内容支持仅指备选方案以及“和/或”的定义)。在本申请各处，术语“约”是用于表明，一个值包括用于测定该值的装置、方法的固有误差变化，或者在那些研究受试者之间存在的变化。术语“至少一个”的使用应理解为包括一个，以及多于一个的任何数量，包括但不限于，2、3、4、5、10、15、20、30、40、50、100个等。术语“至少一个”可延伸至100或1000个或更多，这取决于其所关联的术语；此外，100/1000的数量不应理解为是限制性的，因为更高的边界点也可能产生令人满意的结果。
[0026]术语“约”是用于表明，一个值包括用于测定该值的装置、方法的固有误差变化，和/或在研究受试者之间存在的变化。
[0027]本说明书和权利要求中所用的措词“包含”、“具有”、“包括”或“含”是非遍举的或开放式的，并且不排除附加的未述及要素或方法步骤。
[0028]本文所用的术语“或它们的组合”指在该术语前所列项目的所有排列和组合。例如，“A、B、C或它们的组合”意在包括下列中的至少一种:A、B、C、AB、AC、BC或ABC，以及若在特定情况下次序很重要则还包括BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。进一步地，该例中还明确地包括含一或多个项目或术语重复出现的组合，诸如BB、AAA、MB、BBC、AAABCCCC、CBBAAAXABABB等等。本领域技术人员会理解，典型情况下，对于任何组合中项目或术语的数目没有限制，除非从上下文中明显看出并非如此。
[0029]本文所用的术语“可组合制剂”应理解为指根据具体程序制备并可用于一或多个特定应用的组分混合物。在此公开并要求权益的发明构思的某些实施方案中，可组合制剂的组分在给药之前没有组合在一起；相反地，组分是经单独提供和连续或序贯递送，从而原位形成制剂/复合体。
[0030]本文所用的术语“试剂”或“剂”应理解为指任何介质，其表面上能够具有一或多个用于与受试者腔中的靶和/或另一试剂相互作用的结合位点。在某些实施方案中，“试剂”或“剂”可选自囊泡、脂质体、回波发生性(echogenic)脂质体、多模态回波发生性脂质体、微气泡、微气球(microballoons)、微球体、基质粒子、胶束、基于聚集的构建体、纳米粒子、全氟化碳纳米滴(nanodroplets)以及它们的组合。
[0031]本文所用的术语“造影剂”应理解为用于在成像分析期间提高分辨率以突出器官或组织的物质。造影剂是用于在医学成像中增强机体内结构或流体对比度的物质。
[0032]术语“靶向的造影剂”指附连有生物标志物的造影剂，该生物标志物使造影剂“靶向”与生物标志物结合的靶位点。
[0033]本文所用的术语“靶”应理解为指腔壁表面上出现的任何结构部分，其中靶向试剂对之具有亲合力并因此可与所述结构部分结合。“靶”可以是肽、多肽、蛋白质、表位、抗原、受体、复合体(即，MHC-肽复合体)以及它们的组合或衍生物。[0034]依照此公开并要求权益的发明构思使用的术语“结合位点”应理解为指对另一物质/结合位点具有结合亲合力并能够与之形成复合体、由此提供两试剂/囊泡间亲合力的任何生物分子。例如但非限制，结合位点可以是肽、蛋白、抗原、抗体、抗体片段、受体、配体、糖缀合物以及它们的组合或衍生物。在一个实施方案中，“结合位点”是互补对(例如但非限制，生物素-抗生物素蛋白、抗体-抗原等)的一方。材料一般应选自不会引发变态反应但并非测试腔内惯常存在的组群。可依照此公开并要求权益的发明构思利用的非靶向结合位点(即，被用于扩增、成像和/或治疗试剂与先前靶向试剂或试剂复合体结合的下部结构结合位点(infrastructural binding sites))的示例包括但不限于:蛋白诸如但不限于肌酸酐-激酶-脑-型(CKBB)，或治疗药物诸如但不限于卡马西平、皮质醇、妥布霉素、茶碱、苯妥英、万古霉素、洋地黄毒苷、地高辛、庆大霉素、苯巴比妥和丙戊酸，连同与它们相应的人源化抗体。
[0035]本文所用的术语“多肽”是通称，指具有多肽序列的天然蛋白、片段或类似物。因此，天然蛋白、片段和类似物是多肽属下的种类。
[0036]本文所用的术语“受体”应理解为包括一或多种特定种类的分子(B卩，配体)可与之附连的生物分子。在一个实施方案中，术语“受体”指在待靶向的器官/组织腔壁表面上表达并以容许与循环性靶向试剂相互作用的方式暴露的配体、任意的肽、蛋白质、糖蛋白、多糖或脂质；也就是说，在所述实施方案中，“受体”充当如上文详述的“靶”。可是，应理解，本领域已知或本领域普通技术人员想得到的任何受体均可充当如上文所述的“结合位点”。
[0037]本文所用的应用于一物体的术语“天然存在的”指物体可在自然界中找到的事实。例如，存在于可从自然界来源分离出来的有机体(包括病毒)中并且没有在实验室经人或以另外方式刻意修饰的多肽或多核苷酸序列是天然存在的。
[0038]“抗体”或“抗体肽(一或多种)”指完整抗体，或为特定的结合而与完整抗体竞争的其结合片段。术语“抗体”以最广义使用，且具体涵盖了单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)和抗体片段(例如，Fab、F(ab’)2和Fv)，只要它们显现所希望的生物活性即可。抗体(Ab)和免疫球蛋白(Ig)是具有同样结构特征的糖蛋白。尽管抗体显现对特定抗原的结合特异性，免疫球蛋白既包括抗体又包括缺乏抗原特异性的其它抗体样分子。抗体结合片段通过重组DNA技术产生，或通过完整抗体的酶促或化学裂解产生。结合片段包括Fab、Fab’、F (ab’)2、Fv和单链抗体。除“双特异性”或“双功能性”抗体以外的抗体应理解为其每一结合位点均相同。
[0039]“嵌合”抗体指由至少两种不同来源的组分构成的抗体。在某些实施方案中，嵌合抗体包含与另一分子融合的源自第一物种的抗体的一部分，所述另一分子例如为源自第二物种的抗体的一部分。在某些此类实施方案中，嵌合抗体包含与源自人的抗体的一部分融合的源自非人动物的抗体的一部分。在某些此类实施方案中，嵌合抗体包含与源自人的抗体恒定区融合的源自非人动物的抗体可变区的全部或一部分。
[0040]当抗体是依照与此公开并要求权益的发明构思利用并向人给药时，所述抗体可以“人源化”，以避免引发其免疫应答。“人源化”抗体指经修饰以致与人抗体更紧密匹配(在氨基酸序列中)的非人抗体。人源化抗体经改造以致移除其抗原性部分且替换为人抗体的类似部分，同时保留针对所希望表位的抗体亲合力。这种改造可能仅涉及几个氨基酸，或者可能包括抗体的部分或整个构架区、可变区和/或互补决定区(CDR)。因此，人源化抗体是一类嵌合抗体。使抗体人源化的众多方法是本领域已知的，并公开于US专利6，180，370 (于2001年I月30日授权给Queen等人);6，054, 927 (于2000年4月25日授权给fcickell);5，869，619 (于 1999 年 2 月 9 日授权给 Studnicka)；5, 861，155 (于 1999 年 I 月 19 日授 权给 Lin);5, 712，120(于 1998 年 I 月 27 日授权给 Rodriquez 等人);5，225，539 (于 1993 年 7月6日授权给Winter);和4,816, 567(于1989年3月28日授权给Cabilly等人)，它们的说明书全部据此明确地通过引用以全文并入本文。此外，现有技术有很多与人源化抗体的生成或使用有关的公开论文。这些研究中有许多都教导了能够与此公开并要求权益的发明构思一起使用的有用流程示例，诸如但不限于，Sandborn等人，Gatroenterology, 120:1330(2001);Mihara 等人，Clin.1mmunol.98:319 (2001);Yenari 等人，Neurol.Res.23:72(2001);Morales 等人，Nucl.Med.Biol.27:199(2000);Richards 等人，Cancer Res.59:2096 (1999);Yenari 等人，Exp.Neurol.153:223 (1998);和 Shinkura 等人，AnticancerRes.18:1217 (1998)，它们全部明确地通过引用以全文并入本文。此公开并要求权益的发明构思进一步包括全人单克隆抗体的使用；提供全人单克隆抗体的方法在本领域中是众所周知的，并描述于以下文献，例如但不限于:US专利5，545, 807 ;5，545, 806 ;5，569, 825 ；5，625，126 ;5，633，425 ;5，661，016 ;5，916，771 ;5，939，598 ；PCT 公开 WO 94/02602 ；以及如下非专利参考文献=Kozbor 等人，Hybridoma, 2:7 (1983)；Cole 等人，PNAS 82:859 (1985)Cote 等人，PNAS 80:2026 (1983) ；Cole 等人，(1985) ；Marks 等人，J Biol.Chem.267:16007 (1992) ;Lonberg 等人，Nature, 368:856 (1994) ；Morrison, 1994 ;Fishwild 等人,Nature Biotechnol.14:845 (1996) ；Neuberger, Nat.Biotechnol.14:826 (1996);以及 Lonberg 和 Huszar, Int Rev Tmmunol.13:65 (1995)。
[0041]可是，应理解，本发明构思不限于上述流程，本领域普通技术人员已知的产生人源化抗体或全人抗体的其它流程可依照此公开并要求权益的发明构思来使用。
[0042]术语“有效量”指在按本发明构思方式使用时，在符合合理效益/风险比情况下足以显现可测治疗效果而无过度不良副作用(诸如毒性、刺激和变态反应)的生物学活性分子或者其缀合物或衍生物的量。治疗效果可例如包括但不限于:抑制不希望的组织或恶性细胞的生长。对受试者的有效量将取决于受试者类型、受试者的尺码和健康状态、待治疗病况的性质和严重程度、给药方法、治疗持续时间、并行治疗(如果有的话)的性质、所采用的特定制剂等。因此，不可能预先规定精确的有效量。但是，用于指定情形的有效量可由本领域普通技术人员基于本文所提供的信息、使用常规试验来确定。
[0043]当关系到本文中所述一或多种试剂的应用使用时，措词“配合使用”表明，将所述试剂(一或多种)给药以致它们在有机体上和/或与有机体结合的生理活性存在至少些许时间顺序上的重叠。因此，所述试剂(一或多种)可序贯地给药。在序贯给药中，在给药第二部分之前甚至可能存在些许实质性延迟(例如，数分钟或者甚至数小时或数天)，只要在给药第二给药试剂和/或第二给药试剂在有机体中变得有活性时，第一给药试剂已对有机体产生了些许生理效应和/或保持与有机体的结合即可。
[0044]本文所用的术语“给药”应理解为包括本领域已知的所有给药途径，包括但不限于:口服、局部、透皮、肠胃外、皮下、鼻内、粘膜、肌肉内和静脉途径，包括局部和全身性施用在内。此外，利用本领域众所周知的制剂技术，可将给药方法设计成能提供延迟或控制释放。
[0045]本文所用的术语“腔”应理解为指生物学管状结构的内部空间。依照此公开并要求权益的发明构思使用的腔的示例包括但不限于:血管腔、脊髓腔(spinal lumen)、淋巴管腔等。
[0046]术语“可药用”指在符合合理利益/风险比情况下，适用于向人和/或动物给药而无过分不良副作用诸如毒性、刺激和/或变态反应的化合物和组合物。
[0047]本文所用的“基本上纯”意指目标种是存在的占主导地位的种(即，按摩尔计，它比组合物中任何其它单独的种丰度更高)，并且优选的是，基本上纯化的部分是目标种占所存在的所有大分子种的至少约50% (按摩尔计)的组合物。一般来说，基本上纯的组合物包含的目标种占组合物中所存在的所有大分子种的超过约80%，更优选超过约85%、90%、95%和99%。最优选，目标种纯化至基本均质(通过常规检测方法不能在组合物中测出杂质的种)，其中组合物基本上由单一大分子种组成。
[0048]术语“癌”或“癌性”指或描述哺乳动物的生理状况，其典型特征在于不受管制的细胞生长。癌的示例包括但不限于:癌瘤、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。这些癌的更具体示例包括:鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、胰腺癌、恶性胶质瘤、子宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer )、肾癌(renal cancer )、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)和各种类型的头颈癌。
[0049]本文所用的术语“转移”应理解为指从原发性肿瘤至机体其它部分的癌的扩散。转移是序贯的多步过程，其中肿瘤细胞自原发性肿瘤脱附(detach)、迁移穿越基底膜和细胞外基质、以及侵入淋巴系统和/或血液系统。这之后是远距离位点上继发性肿瘤的建立。
[0050]本文所用的术语“抗癌试剂”指能够抑制癌细胞功能的分子或分子复合体。该试剂可抑制增殖或者可对细胞具有细胞毒性。可使用各种抗癌试剂，包括抑制蛋白质合成的抗癌试剂，以及抑制某些对细胞生长或存活而言关键的基因的表达的抗癌试剂。抗癌试剂包括导致细胞死亡的抗癌试剂，以及抑制细胞生长、增殖和/或分化的抗癌试剂。在一个实施方案中，抗癌试剂可以是对某些癌细胞类型具有选择性毒性而对其它正常细胞无影响或效力较低的抗癌试剂。在另一实施方案中，抗癌试剂可同等地杀灭细胞，但较快生长的细胞被更快地杀灭。在进一步的实施方案中，抗癌试剂是抗肿瘤剂。
[0051]本文所用的术语“抗肿瘤剂”指具有抑制人或动物中肿瘤发展或进展的功能特性的试剂，所述肿瘤特别为恶性(癌性)病变，诸如癌瘤、肉瘤、淋巴瘤或白血病。抑制转移常常是抗肿瘤剂的特性。
[0052]本文所用的术语“患者”包括人和兽类受试者。为治疗目的的“哺乳动物”指任何被归类为哺乳动物的动物，包括人、家畜和农畜、非人灵长类动物和任何其它具有乳腺组织的动物。
[0053]本文所用的术语“健康患者”应理解为指不具有在将要接受治疗的其他患者中所研究的疾病/病况/病症的患者。
[0054]本文所用的术语“治疗”指症状严重程度和/或频率的降低、症状和/或根本原因的消除、对症状和/或其根本原因出现的预防、以及损伤的改善或补救。因此，本文中所用的术语“治疗”患者或个体的方法既包括对易感个体中病症的预防、减少症状出现，也包括临床有症状个体中病症的治疗。
[0055]“病症”是会受益于使用此公开并要求权益的发明构思的组合物进行治疗的任何病况。这包括慢性和急性病症或疾病，包括令哺乳动物易感所述病症的那些病理学状况在内。
[0056]本文所用的术语“治疗癌”或“癌的治疗”意指抑制癌的扩散、降低肿瘤尺寸、使机体内癌细胞缩小或数目减少、和/或改善或减轻与癌关联的症状。如果死亡率和/或发病率降低，或者疾病负担降低(其表现为机体内恶性细胞数目减少)，则认为治疗是有疗效的。
[0057]“预防癌”或“癌的预防”意指防止癌疾病状态的出现或复发。因而，阻碍、抑制或妨碍转移、肿瘤生长或癌增殖的治疗被视为预防性的。
[0058]本文所用的术语“控制癌”包括降低癌患者中癌复发几率、延长患者保持缓解的时间、减少有患癌风险的患者(例如，暴露于高量的福射或致癌材料的患者；感染了与癌出现关联的病毒的患者；和具有癌遗传易感性的患者)中的癌出现以及减少患前恶性(pre-mal ignant)癌或非恶性癌的患者中恶性癌的出现。
[0059]治疗有效量或预防有效量的给药意在提供疾病/病症/病况(诸如但不限于癌)的治疗、预防或控制方面的治疗学效益。具体的治疗有效量可容易地由普通医生确定，并且可依本领域已知因素:患者的历史和年龄、疾病/病症/病况的类型和阶段、其它治疗学组合物的共同给药等而有所变化。
[0060]本文所用的术语“声致穿孔”应理解为指使用声(典型情况下，超声频率)来改变细胞质膜渗透性。该技术常用于分子生物学和非病毒基因治疗中，用以容许大分子诸如DNA摄入细胞中，由此增强向细胞的基因或药物递送。声致穿孔利用微气泡的声空化(即，通过高作用力在液体中形成空穴以及其紧接的内爆)以增强这些大分子的递送。此外，已证实，长时间暴露于低频(〈MHz)超声导致完全细胞死亡(破裂)。
[0061]本文所用的术语“声辐射力”应理解为指由声波与沿其路径所置障碍的相互作用引起的物理现象。一般而言，对障碍施加的作用力会导致障碍的位移。声辐射力被用作一种使自由流动造影剂向内皮移动和由此增强造影剂对靶表面附着的机制。
[0062]本文所用的术语“回波发生性脂质体”应理解为指包含气体的脂质体；回波发生性脂质体反射高频声波，因此能够通过超声技术成像。声辐射力可用于使回波发生性脂质体向内皮移动和由此增强它们对靶表面的附着。微气泡是一类回波发生性脂质体，其中全氟化碳填充整个空穴。[0063]本文所用的术语“消融”应理解为指使用高强度聚焦超声来精准靶向组织以进行治疗(即，移除或破坏组织)。超声消融技术的使用详细地述于Halpern(2005)。简言之，用高强度聚焦超声(HIFU)消融来破坏组织的机理与过热以及空化有关。如诊断成像中所用的低强度超声能量无害地传播穿过组织。高强度聚焦超声消融将身体外的超声源聚焦于特定靶组织。超声能量无害地穿过在去紧密聚焦靶区域途中的上层组织。在靶组织处的快速的能量沉积速率远超过热消散速率，导致快速升温。其它热消融技术受限于热向邻近组织中的耗散，而用高强度超声消融(0.5~1.0秒)所致的超声能量快速聚焦沉积产生局部空化和65~100°C的温度，同时极少加热邻近的组织。I秒高于56°C的温度导致不可逆细胞死亡，连同清晰界定区域的组织坏死。高强度聚焦超声聚焦和准确靶向病灶的能力(通过利用实时超声或核磁共振成像引导)使得任何形状的病灶能得以精准消融，而不损伤周边组织。
[0064]现在转到此公开并要求权益的发明构思，靶向的微气泡是重要的和新出现的超声分子成像和治疗工具，其使造影剂的使用特异性增强。许多疾病状态，诸如但不限于癌、炎症和血栓形成，具有独特的血管腔表面上蛋白的表达。与造影剂附连的生物标志物的使用增强指定位点上造影剂的积聚，由此提高该位点处的有效信号；此外，靶向造影剂的使用降低造影剂的清除速率，由此增大用于成像的有用临床窗口。但是，现有技术靶向造影剂的当前状态具有灵敏度有限的缺点:该技术受限于可用结合位点的数目(即，每一结合位点一个靶向成像试剂)。此外，典型的粘着率较低(约10个泡/微升)，即使加了声辐射力(其典型情况下使粘着率加倍)也如此；因此，结合受限于靶向造影剂与腔上位点的相互作用。
[0065]尽管靶向的超声造影剂表现出良好的疾病特异性，但是疾病状态的诊断受限于成像技术可达到的灵敏度。当造影剂靶向特异性位点时，它们只限于腔内皮表面上可用的结合位点数目，因此一个结合位点仅容许单个微气泡的结合。此外，微气泡与内皮表面上位点的相互作用受限于穿经腔的血流所产生的剪切力；因此，微气泡不能与它不接触的表面结合。因此，利用微气泡和 超声的现有技术方法导致约10个微气泡/微升的典型结合水平。其它成像模式存在类似的限制，其中同样所述方法只限于每一结合位点一个成像囊泡，因此成像囊泡的数目由可用结合位点的浓度决定。
[0066]现有技术的进一步技术限制在于成像设备:对于超声，存在深度和频率依赖性衰减，并且在高功率成像下，高峰值负压导致微气泡爆裂。
[0067]此公开并要求权益的发明构思通过提高来自靶位点的信号而克服了这些现有技术缺点和缺陷。这具体是通过显著提高结合微气泡(或其它介质试剂)数目、由此显著改善靶向成像灵敏度来实现。
[0068]此外，此公开并要求权益的发明构思的增强的靶向和扩增功能使得足够数目的微气泡(或其它介质试剂)能得以递送，用于治疗学超声的更有效应用，诸如但不限于，定向组织加热、声致穿孔和消融。指定组织区域中靶向微气泡数目的增加能实现靶向声能介导的治疗。组织区域中足够数目的气泡会将声穿透区域中声能向热的转化提高到大于周边组织正常吸热的程度。微气泡的单位超声吸收量大于正常组织的单位超声吸收量。但是，只有当定域区域中存在高浓度微气泡时，才出现足够的超声能量吸收来诱导过热。然后，大的组织区域可经声穿透，出现基于靶向气泡浓度的差温加热效应。因此，通过分子水平上的靶向与定向超声能量的组合，能够使治疗定域。
[0069]本文所用的术语“足够数目的微泡”应理解为依诸如但不限于气泡尺寸、接受超声波(即，超声波暴露)频率和强度以及具体施用方法之类的因素而有所变化。例如但非限制，就成像靶向试剂而言，靶向气泡数目的增加会提高反向散射信号、改善信噪比。指定体积内靶向气泡数目加倍将使接受的反向散射声信号接近加倍。扩增也能增强成像穿透度。该效果随频率而变。例如，在3 MHz时，靶向造影剂结合度的两倍增长将实现额外的I厘米声信号穿透度(参见图3)。在另一非限制性示例中，在用气泡使声能转化成热能的治疗学应用中，靶向气泡数目须超过阈值，以克服声能对周边组织的自然加热效应。基于用约3微米的平均气泡直径计算气泡和组织的加热效应，需要20~100个气泡/微升来实现这一作用。依据上列物理因素，有可能需要更少或更多的气泡。就靶向消融而言，靶向气泡数目的增加会导致更强的消融效果。就靶向局部缺血而言，需要足够数目的气泡以在毛细管中导致实质性阻断。例如但非限制，对于10微米直径的毛细管和利用3微米脂质体，双阶段扩增可足以显著地阻断约6~8微米直径的红细胞的流动。随着微气泡尺寸的增大，获得部分堵塞所需的步骤数目减少。并且，一般而言，脂质体将具有较小的直径以使堵塞降至最低限度。
[0070]将组织加热几度能够提高药物活性和血流量，而不诱发永久性组织损伤。更高水平的加热能够诱发永久性组织损伤，这可能具有治疗学效益。除提高加热之外，增加靶向气泡数目也可提高其它治疗学效应诸如空化或气泡溃灭(collapse)，这可用于消融组织或诱导声致穿孔。声致穿孔与增强的药物和基因递送以及治疗学效益相关联。
[0071]除超声应用之外，此公开并要求权益的发明构思还改善其它成像模式(诸如但不限于，MRI和PET)，其独特特性在于靶向试剂局限于腔。
[0072]此公开并要求权益的发明构思提供通用的多模态靶向和治疗系统，其通过扩增克服了靶向材料数量的限制(参见图1和2)。此公开并要求权益的系统兼具成像和治疗应用。该系统的治疗臂能实现向靶向位点递送实质上更多的治疗(诸如但不限于，能量、药物和/或基因)的新的应用。具体示例包括但不限于:声致穿孔和血脑屏障；炎症(即，克罗恩氏病)；靶向和定向化学疗法；经热提高的多种治疗学组合物的活性；靶向和定向消融等。
[0073]如图1和2所示，此公开并要求权益的发明构思涉及可序贯递送的药学试剂的复合体，其可用于经成像检测腔中暴露的靶，其中复合体在腔中形成。所述复合体包含与靶结合(I阶段结合)的至少一个靶向试剂(在本文中也称作“I阶段试剂”或“I阶段囊泡”)、多个扩增试剂(在本文中也称作“II阶段试剂”或“II阶段囊泡”)以及多个成像试剂(在本文中也称作“III阶段试剂”或“III阶段囊泡”)。所述多个扩增试剂中的每一个与至少一个靶向试剂结合(II阶段结合)，且多个成像试剂中的每一个与至少一个扩增试剂结合(III阶段结合)。此外，Ι、Π和/或III阶段试剂中的至少一个可通过成像模式测出，由此使得与靶结合的复合体能得以检测。[0074]1、11和/或III阶段试剂可包含用于经超声进行检测和/或操作的气体。此外，靶向、扩增和/或成像试剂可含有能通过除超声以外的成像模式检测的材料。更进一步，此外，靶向、扩增和/或成像试剂可进一步包含掺入/包封于其中的治疗学组合物。如下文更详细所述，在借助于I阶段(靶向)试剂靶向后，治疗学组合物可得以递送、使用、释放、活化和/或激发。所述释放/活化/激发可能是对热/超声的暴露的响应。
[0075]本文中所用的术语“治疗学组合物”应理解为包括任何产生生物效应并由此具备改变有机体生理系统能力的组合物。“治疗学组合物”可经其自身官能度而具有生物学活性，或者所述组合物可基于其活化或抑制具有自身生物活性的分子的能力而具有生物学活性。可依照此公开并要求权益的发明构思使用的治疗学组合物示例包括但不限于:药物、小分子、核酸(DNA、RNA siRNA等)、蛋白/肽、缀合物、聚合物、聚合物缀合物、糖蛋白、糖蛋白缀合物、气体、能量、以及它们的组合或衍生物。
[0076]在某些实施方案中，提供其上具有至少一个结合位点的试剂，借此每一结合位点是互补对(例如但非限制，生物素-抗生物素蛋白、抗体-抗原、受体-配体等)的一方。I阶段(靶向)试剂可包含一级结合位点和二级结合位点，而II阶段(扩增)试剂可包含至少两个结合位点，诸如但不限于三级结合位点和四级结合位点。扩增试剂的所述至少两个结合位点可相同或不同。III阶段(成像)试剂可包含至少一个结合位点，诸如但不限于，五级结合位点。在该示例中，靶向试剂的一级结合位点与靶形成第一结合复合体，靶向试剂的二级结合位点与扩增试剂的三级结合位点形成第二结合复合体，扩增试剂的四级结合位点与成像试剂的五级结合位点形成第三结合复合体。在一备选方案中，扩增试剂的三级和四级结合位点相同，并与祀向试剂的二级结合位点以及成像试剂的五级结合位点互补。在另一备选方案中，祀向试剂的二级结合位点与扩增试剂的四级结合位点相同，借此祀向试剂的二级结合位点也可与成像试剂的五级结合位点结合形成第三结合复合体。
[0077]I阶段(靶向)试剂包含所述靶/疾病状态所特有的靶向配体；但是，扩增和成像试剂(即，II和III阶段试剂)可以是通用的。也就是说，II和III阶段试剂的试剂含量及其上衔接物/结合位点针对指定成像模式可以是相同的，且不依赖于靶/疾病状态。II和III阶段试剂可与同样的互补对连接，而不依赖于所用的成像模式。此外，II和/或III阶段试剂可以是多模态的，因此含与多重成像模式相关的组分(即，超声、MR1、CR等等试剂的组合)。
[0078]在另一备选方案中，可使用多重成像试剂。在这一情况下，可提供具有针对两个或更多个III阶段试剂的结合位点的II阶段试剂；这些结合位点可以是结合双III阶段试剂的单一结合位点，或可基于待使用的不同III阶段试剂的数目提供多个不同结合位点。
[0079]1、11和/或III阶段试剂仅仅由指定阶段所要求的衔接物界定，而不依赖于它们的内容物(content)(参见图2)。换句话说,该技术类似于包含轮毂(hub)和连接棍(peg)的结构玩具(tinker toy)。连接棍(即,衔接物)界定出阶段；轮毂能含任何东西。
[0080]上文所述结合位点可以是对另一物质有结合亲合力并能够与之形成复合体、由此提供两试剂/囊泡间亲合力的任何生物分子。例如但非限制，结合位点可以是肽、蛋白、抗原、抗体、抗体片段、受体、配体、糖缀合物以及它们的组合或衍生物。
[0081]可依照此公开并要求权益的发明构思使用的具体靶位点示例包括但不限于:ICAM-1、P-选择蛋白、MadCAM-1、VCAM-1卿，针对炎症的靶)；α ν β 3整联蛋白和VEGFR2(本领域中已知针对血管发生的靶);和GP Ilb/IIIa (本领域中已知针对血栓的靶)。可用作一级结合位点的示例性抗体列表可见以下参考文献:Paul Carter, Nature Reviews Cancer,Vol.1, pp.118-129 (2001年11月)；其全部内容据此明确地通过引用并入本文。
[0082]在另一实施方案中，此公开并要求权益的发明构思涉及可序贯递送的药学试剂的复合体，其可用于经成像检测腔中暴露的靶，其中复合体在腔中形成。所述复合体包括附连有多个II阶段(扩增)试剂的至少一个I阶段(靶向)试剂，其中所述至少一个I阶段(靶向)试剂与腔中暴露的靶结合。所述复合体可进一步包含多个III阶段试剂，其中所述多个III阶段试剂中的每一个包含暴露于其表面上的至少一个用于与II阶段试剂结合的结合位点。所述III阶段试剂上的至少一个结合位点也可能能够与至少一个I阶段(靶向)试剂结合。
[0083]此公开并要求权益的发明构思还涉及可序贯递送的可组合制剂。所述制剂包含:第一可给药组合物，其包含能够与腔中暴露的靶结合的I阶段(靶向)试剂；第二可给药组合物，其包含II阶段(扩增)试剂；和第三可给药组合物，其包含III阶段(成像)试剂。II阶段试剂包含对I阶段试剂具有亲合力的第一结构部分，和对III阶段试剂具有亲合力的第二结构部分。Ι、Π和/或III阶段试剂(一或多个)可通过成像模式测出，由此使得与靶结合的靶向试剂信号能得以扩增。所述结构部分包含前文所述的结合位点。
[0084]此公开并要求权益的发明构思进一步涉及增强的受试者机体影像的生成方法。所述方法包括以下步骤:向受试者机体给药上文所述的可序贯递送的可组合制剂，和生成至少一部分所述机体的超声、磁共振、X射线或射线照相影像。
[0085]在上文或下文所述的任一方法中，可序贯递送的可组合制剂可如下给药:首先，向所述机体给药第一可给药组合物，随后向所述机体给药第二可给药组合物，和随后向所述机体给药第三可给药组合物。在某些实施方案中，给药第一可给药组合物之后，让机体酝酿(incubate) —段时间，以容许I阶段(靶向)试剂与腔中暴露的靶结合，以及从腔中实质性清除未结合的I阶段试剂。然后，在给药第二可给药组合物之后，让机体酝酿一段时间，以容许II阶段(扩增)试剂与I阶段试剂结合，以及从腔中实质性清除未结合的II阶段试剂。此外，在给药第三可给药组合物之后，让机体酝酿一段时间，以容许III阶段试剂的结合，以及从腔中实质性清除未结合的III阶段试剂。该方法中也可包括第一、第二和/或第三可给药组合物的额外给药(一或多次)。[0086]通过使用措辞“实质性清除”、“实质上消除”和“实质性洗出”，应理解，在给药另一试剂之前，无须从腔/血流移除一试剂的全部。相反地，这些措辞简明地表明已从腔/血流中清除/洗出足够数目的头一试剂，从而可见足够的对比度和提供足够的信噪比。
[0087]此公开并要求权益的发明构思进一步涉及可用于使腔中的靶成像的试剂盒。所述试剂盒可包括上文所述的可序贯递送的可组合制剂。此外，试剂盒可进一步包括软件模块，其分析由检测III阶段试剂的影像递送装置所生成的信息。
[0088]此公开并要求权益的发明构思进一步涉及由与腔中的靶结合的III阶段(成像)试剂所生成的信号的检测装置。该装置可包括计算系统，以及检测III阶段试剂的影像递送装置。计算系统包含应用模块和处理单元；所述应用模块包含软件模块，其分析由影像递送装置所生成的信息，所述处理单元配置成执行软件模块。由影像递送装置检测的III阶段试剂与至少一个I阶段(靶向)试剂以及多个II阶段试剂复合，所述至少一个I阶段(靶向)试剂与靶结合，所述多个II阶段试剂与I阶段(靶向)试剂结合。在某些实施方案中，影像递送装置还可充当能量递送装置，其向腔中与I/II/III阶段试剂复合体结合的靶递送定向能量。在特别的实施方案中，影像/能量递送装置可以是超声影像/能量递送装置。能量递送装置还可用作声辐射力来源。
[0089]此公开并要求权益的发明构思还涉及提高成像模式所检测信号强度的方法。该方法包括:向受试者给药有效量的I阶段(靶向)试剂，其中I阶段试剂穿越受试者系统并与受试者腔(即，腔壁)表面上暴露的靶结合。然后，向受试者给药有效量的II阶段(扩增)试剂，其中多个II阶段试剂与已与靶结合的I阶段试剂结合。随后，向受试者给药有效量的III阶段试剂，其中III阶段试剂与已经由I阶段试剂与靶位点结合的II阶段试剂结合。然后，经成像模式检测III阶段试剂所产生的信号。
[0090]在上文和下文所述的某些方法的实施方案中，可能希望的是，在给药一试剂(gp，靶向/扩增/成像/治疗试剂)之后，所述方法包括容许未结合的试剂从腔(即，血流)中实质性清除的步骤，然后再给药后一试剂。
[0091]此公开并要求权益的发明构思进一步涉及诊断受试者中病况/病症的方法。在该方法中，向受试者给药有效量的上文所述I阶段(靶向)试剂；1阶段试剂包含结合位点，该结合位点与对所述病况/病症特异的靶结合，并且，I阶段试剂穿越受试者系统并与受试者腔表面上暴露的任意靶结合。随后，向受试者给药有效量的上文所述II阶段(扩增)试剂，其中多个II阶段试剂与已与靶位点结合的I阶段试剂结合。随后，向受试者给药有效量的上文所述III阶段(成像)试剂，其中III阶段试剂与已经由I阶段试剂与靶位点结合的II阶段试剂结合。然后，经一或多种成像模式检测由ι、π和/或III阶段试剂(一或多个)产生的任何信号，如果检测出信号则确定受试者具有所述病况/病症。
[0092]此公开并要求权益的发明构思进一步涉及治疗受试者中病况/病症的方法。在所述方法中，向受试者给药有效量的上文所述I阶段试剂阶段试剂包含结合位点，该结合位点与对所述病况/病症特异的靶结合，并且，I阶段试剂穿越受试者系统并与受试者腔表面上暴露的任意靶结合。随后，向受试者给药有效量的上文所述II阶段试剂，其中多个II阶段试剂与已与靶位点结合的I阶段试剂结合。随后，向受试者给药有效量的III阶段(治疗)试剂，其中III阶段试剂与已经由I阶段试剂与靶位点结合的II阶段试剂结合。ι、π和III阶段试剂的至少其一包括可有效治疗所述病况/病症的治疗试剂。一旦形成复合体，
1、11和/或III阶段试剂中存在的所述治疗试剂可有效治疗所述病况/病症。或者，治疗试剂可在与靶位点结合后激活，借此活化的治疗试剂有效治疗所述病况/病症。
[0093]此公开并要求权益的发明构思进一步涉及向靶位点递送治疗学组合物的方法。在所述方法中，向受试者给药有效量的上文所述I阶段试剂阶段试剂包含结合位点，该结合位点与对所述病况/病症特异的靶结合，并且，I阶段试剂穿越系统并与受试者腔表面上暴露的任意靶结合。随后，向受试者给药有效量的上文所述II阶段试剂，其中多个II阶段试剂与已与靶位点结合的I阶段试剂结合。随后，向受试者给药有效量的III阶段试剂，其中III阶段试剂与已经由III阶段试剂与靶位点结合的II阶段试剂结合。治疗学组合物掺入/包封于1、II和III阶段试剂的至少其一之内。在一个实施方案中，一旦与靶位点结合，治疗学组合物就递送给了靶位点。或者，所述方法可进一步包括以下步骤:激活Ι、π和/或III阶段试剂，以释放所述治疗学组合物并因此将组合物递送给靶位点。
[0094]治疗学应用示例包括但不限于:过热；将组织加热几度(这可提高药物活性和/或提高血流量而无永久性组织损伤)；为治疗学效益，将组织加热至诱发永久性组织损伤的较闻水平；提闻空化和/或试剂溃灭；组织消融；诱导声致穿孔；提闻药物和基因递送等。另一治疗学应用包括诱导血管化组织的局部缺血/坏死，如下文进一步详细描述。
[0095]上文所述的任一成像方法可进一步包括以下步骤:向受试者给药有效量的治疗试剂，其中所述治疗试剂与已经由I阶段试剂与靶位点结合的II阶段试剂和III阶段试剂的至少其一结合。此外，上文所述的任一成像方法可进一步包括以下步骤:向受试者给药有效量的第二 III阶段试剂，其中所述第二 III阶段试剂与已经由I阶段试剂与靶位点结合的II阶段试剂和III阶段试剂的至少其一结合。
[0096]上文或下文所述任一方法中所用的任一试剂可包含气体(B卩，回波发生性脂质体)，因此声辐射力可通过推使一或多类试剂(一或多个)靠着腔内表面来提高靶向效率。例如但非限制，当I阶段试剂包含气体时，超声暴露推使I阶段试剂靠着腔壁，提高I阶段试剂与靶位点相互作用的可能性。任选地，当II阶段试剂包含气体时，超声暴露推使II阶段试剂靠着腔壁，提高II阶段试剂与已与靶位点结合的I阶段试剂相互作用的可能性。
[0097]在上文或下文所述的任一方法中，靶位点可暴露于血脑屏障、卵巢、胰腺、肾、肝、它们任一个的癌性组织和/或它们的供给组织的至少其一的表面上。靶位点可以是疾病特异性的。
[0098]上文或下文所述的任一方法中，其中使用的成像模式可选自:超声、核磁共振成像(MRI)、计算机化断层成像(CO、双源CT (灌注成像)、弥散张量成像(DTI)、延迟增强成像、X射线和荧光透视(对比荧光透视)成像、计算机化SPECT、PET或PET-CT成像以及分子成像(放射性药物)。
[0099]尽管在本文中描述了将1、II和/或III阶段试剂中所布置的气体与超声一起使用，但应理解，此公开并要求权益的发明构思还包括将1、II和/或III阶段试剂中所布置的其它组成物与其它成像/治疗学模式一起使用。例如但非限制，可将钆螯合物衍生物(诸如但不限于，礼-二亚乙基-三胺-五乙酸(例如参见,Accardo等人,2009))与MRI模式一起使用，而可将放射性核素与X射线模式(即，放射疗法)一起使用。
[0100]此外，任一 1、11和/或III阶段试剂可以是多模态回波发生性脂质体一也就是说，所述试剂(一或多个)包含气体以致所述试剂(一或多个)对声辐射力敏感，并且还可包含如上文所述的第二成像模式 (即，MR1、CT、DT1、PET等)。因此，此公开并要求权益的发明构思的另一实施方案包括使用包含多模态回波发生性脂质体/微气泡/囊泡的I阶段(靶向)试剂。所述I阶段试剂可在存在或不存在扩增的情况下使用。
[0101]此公开并要求权益的发明构思还涉及可序贯递送的药学试剂的复合体，其可用于经成像检测腔中暴露的靶，其中复合体在腔中形成。复合体包含至少一个如上文所述的I阶段试剂和多个如上文所述的III阶段(成像)试剂。多个III阶段试剂中的每一个与至少一个I阶段试剂结合，其中I和/或III阶段试剂可通过成像模式测出，由此使得与靶结合的复合体能得以检测。
[0102]此公开并要求权益的发明构思进一步涉及靶向由成像模式可视化的信号的方法。在所述方法中，向受试者给药有效量的I阶段试剂，其中I阶段试剂穿越受试者并与受试者腔表面上暴露的靶位点结合。随后，向受试者给药有效量的III阶段(成像)试剂，借此III阶段试剂与I阶段试剂结合。然后，由成像模式检测I和/或III阶段试剂(一或多个)所产生的信号。
[0103]在本文中所述的任一方法中，在腔中形成的复合体不实质性阻塞腔中流体流动(即，血流(blow flow))。这通过如下方式实现:通过序贯添加试剂、通过限制方法中所用各个试剂的尺寸(结构尺寸)和/或通过限制所用II阶段试剂的量，从而由此形成的复合体的尺寸受到限制且因此不超出腔的尺寸。例如，可提供具有足够小的直径的靶向/扩增/成像试剂，由此三个直径的总和不超出毛细管直径(即，< 10 μ ;Dayton，2002)。
[0104]或者，在本文中所述的任一方法中，在腔中形成的复合体可实质性阻塞受试者腔中靶位点处的血流，由此对受试者的靶向部分(即，组织、器官、机体部分等)引起局部缺血。因此，此公开并要求权益的发明构思进一步涉及在受试者靶位点处产生血管化组织局部缺血和坏死的方法，如上文所述。在所述方法中，如上文所述给药1、II和III阶段试剂。然后，给药多重剂量的II和/或III阶段试剂(一或多个)，直至靶位点处的腔被实质性阻塞。因此，对于随时间进行序贯添加的情况，III阶段试剂还可充当“扩增试剂”用于阻塞腔。
[0105]在腔中形成的复合体可包括本文中所述试剂的任意组合(即，靶向和成像试剂；革巴向、扩增和成像试剂；祀向、扩增和治疗试剂)。此外，当在腔中形成的复合体包括靶向、扩增和成像试剂时，可向受试者进一步给药治疗试剂(即，包括包封在其中的化学治疗或其它细胞毒性物质)以致该治疗试剂与成像试剂结合并向缺血性受损组织递送细胞毒性物质，以提供额外的杀灭机制。任选地，可在给药治疗试剂之前从复合体上移除成像试剂，借此后续给药的治疗试剂会与扩增试剂结合并随后向缺血性受损组织递送细胞毒性物质，以提供额外的杀灭机制。
[0106]在成像后、给药后续试剂(诸如但不限于，另一成像试剂或治疗试剂)之前从复合体上移除III阶段试剂的这同一技术可在上文所述或在此设想到的任一方法中使用。用这种方式，由I阶段试剂和一或多个II阶段试剂所形成的复合体形成基础结构/支架/桥状网络，基于它可实现多重应用(诸如但不限于，多重成像技术或者成像与治疗学技术的组合)。任选地，基础结构还容许随着时间推移进行多重施用。以此方式，支架能够根据需要来重复使用。
[0107]在另一备选方案中，可能需要的是，移除III阶段试剂和II阶段试剂(一或多个)，仅留下I阶段试剂，以形成能重复使用的支架，用于多重应用或多重施用。
[0108]本文中所述的任一方法还可包括在流程(成像和/或治疗流程)施行后降解复合体的至少一部分(或全部复合体)的步骤。降解可能涉及到使用能量、热、化学方法(即，以独特方式还原二硫键)、pH变化、添加竞争试剂(Ab)等。以此方式，当需要时可破坏靶向/扩增/成像/治疗试剂中的一或多个(诸如但不限于，通过超声)；此外，当不再需要复合体时可破坏所有试剂。例如但非限制，如果间隔物是具有由酶裂解的氨基酸序列的肽，则裂解所述间隔物，令复合体降解。酶可附连于所述介质之一上，且可能需要辅助因子或热进行活化。
[0109]如下文更详细描述，通过在囊泡构架上提供多重(B卩，至少两个)附连/结合位点或点，制造依照此公开并要求权益的发明构思使用的I阶段(靶向)试剂。对于I阶段(靶向)试剂，用于与靶结合的一级结合位点经衔接物附连于囊泡构架上，而用于与II阶段试剂结合的二级结合位点经另一衔接物附连于囊泡构架上。
[0110]通过在囊泡构架上提供多重附连点(B卩，多重结合位点)，制造依照此公开并要求权益的发明构思使用的II阶段(扩增)试剂。多重附连点的使用将实现:(1)用于多模态成像的多重附连点；(2)多重施用(随着时间推移);和/或(3)多重应用(诸如但不限于，成像和治疗应用)。可提供具有三级和四级结合位点的扩增试剂(如上文所述)，并且其可进一步具有额外的结合位点，以容许与额外的成像/治疗试剂(即，除与四级结合位点相互作用的成像/治疗试剂外)的相互作用。
[0111]在一个实施方案中，可通过使用衔接物使三级和四级结合位点附连。如下文更详细描述，利用衔接物混合物来制得扩增囊泡上的多个附连点。但是，应理解，对于三级和四级结合位点与扩增试剂的附连来说 ，衔接物不是必需的。[0112]通过在囊泡构架上提供至少一个附连点，制造依照此公开并要求权益的发明构思使用的成像/治疗试剂。所述至少一个附连点可经衔接物附连于囊泡构架上；但是，应理解，对于五级结合位点与成像/治疗试剂的附连来说，衔接物不是必需的。
[0113]依照此公开并要求权益的发明构思使用的靶向/扩增/成像/治疗试剂的制造可从提供微气泡、脂质体或其它类型囊泡作为构架开始，然后向其添加结合位点(即，衔接物/复合试剂(complexing agent))。可用于祀向/扩增/成像/治疗试剂的一般性囊泡构架示例在本领域中众所周知用于成像/治疗应用(所述现有技术囊泡是在不存在用于制造本发明复合体支架的靶向试剂和/或衔接物/复合试剂的情况下产生的)。具体示例包括但不限于以下例子。US专利5，123,414 (1992年6月23日授权给Unger)公开了适合作为超声造影剂的脂质体，所述试剂含各种类型的媒介，包括气体、气态前体和全氟化碳，其通过pH、温度和/或压力来激活。Unger等人(2004)公开了具有诊断和治疗应用(包括能够经超声能量空化，以用于位点特异性地局部递送生物活性材料和用于治疗血管血栓形成)的微气泡，所述微气泡含有截留于脂质包衣内的全氟化碳气体；该参考文献还公开了，血脑屏障(BBB)可利用超声可逆地开启，超声还使大脑微脉管系统内的微气泡空化，以向脑递送低和高分子量治疗剂。Klibanov (2006)的综述公开了，通过在微气泡表面上提供靶向配体，将微气泡造影剂用于靶向超声成像和超声辅助药物递送应用。Hernot和Klibanov (2008)描述了由超声触发的药物和基因递送中的微气泡，其中微气泡增强靶组织中超声能量沉积，并充当空化核(用于提高细胞内药物递送)。Ferrante等人(2009)描述了全氟化碳填充的磷脂微气泡造影剂，通过使聚乙二醇-生物素-链霉抗生物素蛋白桥与mAb MVCAM.A和/或sialyl Lewisx聚合物(PAA_sLex)偶联,所述造影剂革巴向粘着分子P-选择蛋白和VCAM-1。Liu等人(2006)公开了包封的超声微气泡以及它们在药物递送或基因治疗中的应用，所述微气泡表面附连有靶向配体。Suzuki等人(2007和2008)描述了含全氟丙烷的泡泡脂质体(其比常规微气泡直径小)以及它们在基因治疗和超声破坏技术中的用途。Tinkov等人(2009)公开 了用作超声触发药物载体的微气泡的制造和药物加载方法。Jong等人(2009)描述了用以表征超声造影剂(UCA)的不同策略，包括声学和光学方法在内。SchiOeder等人(2009)描述了超声与脂质体的相互作用，以及利用低频超声(LFUS)自脂质体释放药物的机械原理，包括脂质体脂质组成的作用和物理化学特性及脂质体药物释放方面的LFUS参数，以及声空化的用途。Huang (2008)公开了借助于脂质体进行的经超声控制的药物释放和经超声增强的药物递送，所述脂质体含有截留于其中的气体和/或药物。上述每一专利和公开文件的全部内容据此明确地通过引用并入本文。
[0114]此外，可依照此公开并要求权益的发明构思使用的可市购超声造影剂包括但不限
于:S0NAZ0ID?(GE Healthcare, Oslo, Norway)-参见 Otani 等人(2009)有关向其上
附连抗体的公开内容；DEFINITY? (Bristol-Myers Squibb Medical Imaging, Billerica,MA);和0PTIS0N ?(GE Healthcare, Oslo, Norway)?此外，可依照此公开并要求权益的发明构思使用的多种超声造影剂由Targeson, Inc.(San Diego, CA)制造,包括但不限于，TARGESTAR-B?,其为一种生物素化微气泡造影剂，用于生物素化配体的缀合。
[0115]一旦提供了囊泡构架，通过向其上附连结合位点，继续进行所述制造方法；可通过利用衔接物，而使结合位点得以附连。每一衔接物包含复合试剂互补对中的一个成员。在I阶段试剂/11阶段试剂的结合中，I阶段(靶向)试剂包含互补对的第一成员(即，二级结合位点)，而II阶段(扩增)试剂包含所述互补对的第二成员(即，三级结合位点)。在扩增试剂/成像(或治疗)试剂的结合中，扩增试剂包含另一互补对的第一成员(即，四级结合位点)，而成像(或治疗)试剂包含所述互补对的第二成员(即，五级结合位点)。
[0116]依照此公开并要求权益的发明构思使用的衔接物在两末端功能化。当两末端用同一反应性结构部分活化时，衔接物称为“同双功能”衔接物，而如果存在的官能团不同，则衔接物称为“异双功能”衔接物。两末端之一使衔接物附连于囊泡构架上，而另一末端包含复合试剂互补对的一个成员。当利用同双功能衔接物时，在衔接物两端使用同一类接头，由此使衔接物连接至试剂的囊泡构架，并与复合试剂互补对的另一成员相互作用，以使靶向/扩增/成像/治疗试剂与另一靶向/扩增/成像/治疗试剂结合。同双功能衔接物的非限制性示例是抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白(其很容易制造和/或可市购)。许多衔接物可能显现多重结合位点。未经消化的抗体是双齿的；抗生物素蛋白、链霉抗生物素蛋白和中性抗生物素蛋白(neutravidin)各提供至多4个结合位点。多齿分子可代替同双功能衔接物使用。
[0117]当利用异双功能衔接物时，第一类接头用于使衔接物连接到试剂的囊泡构架上，第二不同类接头用于与靶位点和/或复合试剂互补对的另一成员相互作用，以使靶向/扩增/成像/治疗试剂与另一靶向/扩增/成像/治疗试剂结合。异双功能衔接物的非限制性示例是抗生物素蛋白-PEG-抗体。可通过混合适当比例的同和异双功能衔接试剂，制备靶向/扩增/成像/治疗试剂，其中两衔接试剂分享共同的接头类型，其中所述共同的接头类型是附连于基础囊泡上的衔接物的互补对。然后，将混合物加入基础囊泡中，以得到所需要的多重附连点。
[0118]衔接物可进一步包含栓系物(tether)或扩展物(extender)分子,诸如但不限于，肽或PEG。各个试剂的尺寸应足以经由衔接物最大限度地拴系两试剂。拴系物/衔接物应长到足以使试剂结合达到最大限 度的程度，但不长到出现显著拴系物/衔接物缠结的程度。
[0119]在I阶段(靶向)试剂的制造中，使用异双功能衔接物为I阶段试剂附连上一级结合位点。例如但非限制，可提供抗生物素蛋白化脂质体/微气泡(其很容易制造和/或可市购)，并使之与生物素-PEG-抗体相互作用，其中抗体可以是任何可市购或以另外方式为本领域已知的抗体。抗生物素蛋白化囊泡构架-生物素-PEG-的前体提供一通用前体，其可与任何结合分子一起使用以形成任何所希望的I阶段试剂。例如，可提供所述前体，然后可将针对不同类型病症/疾病/癌的不同抗体附连其上。此外，可将多重抗体/结合分子用于一级结合位点。
[0120]然后，可使用异双功能或同双功能衔接物来使二级结合位点(用于与扩增试剂结合)附连于囊泡构架上。例如但非限制，可使用同双功能衔接物——生物素-PEG-生物素，其中生物素形成二级结合位点并因此能与包含生物素化脂质体/微气泡的扩增试剂相互作用，所述生物素化脂质体/微气泡上附连有抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白衔接物(即，抗生物素蛋白形成与生物素二级结合位点相互作用的三级结合位点)。
[0121]在II阶段(扩增)试剂的制造中，可通过本领域已知的任何方法使三级和四级结合位点附连于囊泡构架上。例如，II阶段试剂可只是包含生物素化微气泡，其中II阶段试剂上的生物素包含三级和四级结合位点并与作为二级和五级结合位点的抗生物素蛋白相互作用。此外，II阶段试剂可包含附连于囊泡构架上的额外的结合位点，其中所述额外的结合位点使囊泡变得多功能并因此容许多模态成像、多重施用和/或多重应用(成像和/或治疗)。[0122]在II阶段试剂的另一制造方法中，可使用同双功能或异双功能衔接物来使三级结合位点附连于囊泡构架上，并可使用至少一个额外的异双功能衔接物来使四级结合位点附连于囊泡构架上。此外，II阶段试剂可包含额外的结合位点，该结合位点经由异双功能衔接物附连于囊泡构架上。这些额外的结合位点使囊泡变得多功能并因此容许多模态成像、多重施用和/或多重应用(成像和/或治疗)。例如但非限制，II阶段试剂可包含生物素化脂质体/微气泡，所述生物素化脂质体/微气泡上附连有抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白同双功能衔接物以形成三级结合位点(其与I阶段试剂的生物素二级结合位点相互作用)，II阶段试剂进一步包含异双功能衔接物，诸如但不限于抗生物素蛋白-PEG-生物素，其中该生物素形成与III阶段试剂的五级结合位点相互作用的四级结合位点。此外，不与I阶段试剂结合的附连于II阶段试剂上的任何游离抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白衔接物可进一步作为额外的结合位点用于俘获第二成像/治疗试剂。
[0123]在III阶段试剂的制造中，可通过本领域已知的任何方法使五级结合位点附连于囊泡构架上。例如但非限制，III阶段试剂可只是包含生物素化微气泡，其中III阶段试剂上的生物素(即，五级结合位点)与附连于II阶段试剂上的抗生物素蛋白(即，四级结合位点)相互作用。
[0124]在III阶段试剂的另一制造方法中，可使用同双功能或异双功能衔接物来使五级结合位点附连于囊泡构架上。例如但非限制，可使用同双功能衔接物一抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白，其中抗生物素蛋白形成五级结合位点并因此能与包含生物素化脂质体/微气泡的II阶段试剂相互作用(即，生物素形成与抗生物素蛋白五级结合位点相互作用的四级结合位点)。
[0125]此外，III阶段试剂可进一步包含附连于囊泡构架上的额外的结合位点。这些额外的结合位点可用于容许额外的试剂与之结合(即，另一成像试剂或治疗试剂)。例如但非限制，第一成像试剂(超声造影剂)可包含额外的抗荧光素抗体附连于其上的结合位点。该第一成像试剂可与第二成像试剂一起使用，用于MRI检测，其中第二成像试剂在其表面上带有荧光素。可通过本领域已知的任何方法使这些额外的结合位点附连，包括但不限于，借助于异双功能衔接物进行附连。
实施例
[0126]下文提供实施例。但是，应理解，本发明的应用不局限于这些特定试验、结果和实验室方法。相反地，实施例只不过是作为多种实施方案之一，且意在是示例性而非穷举性的。
[0127]实施例1:1阶段试剂/11阶段试剂/III阶段试剂复合体的活体外形成。
[0128]在该实施例中，所提议的活体外试剂关键原材料(CRM)是荧光素化BSA和2H1 (荧光素抗体)。通过使BSA突光素化和随后使突光素化BSA与聚苯乙烯(pH 8,碳酸氢盐缓冲液(bicarb buffer))结合,制得聚苯乙烯结合表面。突光素化BSA充当I阶段(祀向)试剂的一级结合位点的革巴。
[0129]制备I阶段(祀向)试剂:获得可市购生物素化微气泡(即，靶向试剂，TargestarB,获自Targeson, Inc.，San Diego, CA)和2H1抗体(其与突光素化BSA结合)。抗生物素蛋白-PEG-2H1 (即，靶向试剂上的一级结合位点)由异双功能PEG制得，而抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白(B卩，靶向试剂上的二级结合位点)由同双功能PEG制得。使抗生物素蛋白-PEG-2H1和抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白与生物素化微气泡反应，以分别形成I阶段(靶向)试剂的一级和二级结合位点。
[0130]制备II阶段(扩增)试剂:在本实施例中，可市购生物素化微气泡充当II阶段试剂。生物素化位点充当II阶段试剂的三级和四级结合位点。
[0131]制备III阶段(成像)试剂:提供可市购生物素化微气泡，并使之与抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白反应，以形成III阶段试剂的五级结合位点。
[0132]形成I阶段(祀向)试剂/靶复合体:使I阶段(靶向)试剂与聚苯乙烯结合表面反应，靶向微气泡上的抗生物素蛋白-PEG-2H1与聚苯乙烯结合表面上的荧光素化BSA结合。然后，洗涤聚苯乙烯结合表面以移除任何未结合的微气泡。如有需要，在此时测量结合和超声效果。
[0133]形成扩增复合体:使II阶段(扩增)试剂与结合有I阶段(祀向)试剂的聚苯乙烯结合表面反应，II阶段(扩增)试剂上的生物素化位点(即，三级结合位点)与I阶段(靶向)试剂上的抗生物素蛋白-PEG-抗生物素蛋白(即，二级结合位点)相互作用，由此II阶段(扩增)试剂与已与聚苯乙烯结合表面结合的I阶段(靶向)试剂结合。然后，洗涤结合表面以移除任何未结合的生物素化微气泡(即，II阶段(扩增)试剂)。如有需要，在此时测量结合和超声效果。
[0134]形成成像复合体:使III阶段试剂与结合有I/II阶段试剂的聚苯乙烯结合表面反应，III阶段试剂上的抗生物素蛋白(即，五级结合位点)与II阶段(扩增)试剂上的生物素化位点(即，四级结合位点)相互作用。由此III阶段试剂与II阶段(扩增)试剂结合，其中所述II阶段(扩增)试剂已与I阶段(祀向)试剂结合，所述I阶段(祀向)试剂已与聚苯乙烯结合表面结合。然后，洗涤结合表面以移除任何未结合的微气泡(即，成像试剂)。
[0135]在此时测量结合和超声效果，以证实超声造影剂信号(CPS)的增强，以及验证活体外气泡加热计算结果以证明气泡聚集未受影响。
[0136]此外，用光学显微术研究气泡聚集，以证实所述三个阶段的结合。
[0137]实施例2:靶向/成像试剂复合体的活体内超声应用
制备祀向组分:首先，抗生物素蛋白化单层脂质体制剂根据Szoka和Papahadjopoulos(1978)所述程序制得，区别之处在于将磷脂抗生物素蛋白化。生物素-PEG3tl-抗体由获自Thermo-Fisher的异双功能交联剂制得。此例中的抗体可采自以下文献提供的列表=NatureReviews Cancer, Vol.1, pp.118-129 (2001 年 11 月)。生物素-PEG3tl-生物素由获自Thermo-Fisher的同双功能交联剂制得。将生物素-PEG3tl-生物素和生物素-PEG3tl-抗体与抗生物素蛋白化单层脂质体混合，以制得靶向试剂。
[0138]制备成像组分:使用可市购生物素化微气泡。抗生物素蛋白-PEG3tl-抗生物素蛋白由获自Thermo-Fisher的同双功能交联剂制得。将生物素化微气泡与抗生物素蛋白-PEG3tl-抗生物素蛋白混合，以得到成像组分。
[0139]在使用方法中，将靶向组分/脂质体制剂注入血流中，让患者带着所述组分酝酿足够长的一段时间(诸如但不限于，约3~10分钟)以便发生靶向以及循环性游离脂质体从血流中实质性洗出。然后，给患者注射有效量的成像组分，并让患者带着所述组分酝酿足够长的一段时间(诸如但不限于，约3~10分钟)以便发生二级靶向以及循环性游离微气泡从血流中实质性洗出。随后进行靶向试剂或靶向治疗活性的诊断成像。
[0140]实施例3:祀向/扩增/成像试剂复合体的活体内超声应用
制备IE向组分:首先，生物素化单层脂质体制剂根据Szoka和Papahadjopoulos( 1978)所述程序制得。抗生物素蛋白-PEG3tl-抗体由获自Thermo-Fisher的异双功能交联剂制得。此例中的抗体可采自以下文献提供的列表:Nature Reviews Cancer, Vol.1, pp.118-129(2001年11月)。抗生物素蛋白-PEG3tl-抗生物素蛋白由获自Thermo-Fisher的同双功能交联剂制得。将抗生物素蛋白-PEG3tl-抗生物素蛋白和抗生物素蛋白-PEG3tl-抗体与生物素化单层脂质体混合，以制得靶向试剂。
[0141]制备扩增组分:生物素化单层脂质体制剂根据Szoka和Papahadjopoulos (1978)所述程序制得。
[0142]制备超声成像组分:使用可市购链霉抗生物素蛋白超声成像试剂(Targestar SA,获自 Targeson, Inc., San Diego, CA)。[0143]在使用方法中，将靶向组分/脂质体制剂注入血流中，让患者带着所述组分酝酿足够长的一段时间(诸如但不限于，约3~10分钟)以便发生靶向以及循环性游离脂质体从血流中实质性洗出。然后，给患者注射有效量的扩增组分，并让患者带着所述组分酝酿足够长的一段时间(诸如但不限于，约3~10分钟)以便发生二级靶向以及循环性游离囊泡从血流中实质性洗出。然后，给患者注射有效量的成像组分，并让患者带着所述组分酝酿足够长的一段时间(诸如但不限于，约3~10分钟)以便发生二级靶向以及循环性游离囊泡从血流中实质性洗出。随后进行靶向试剂或靶向治疗活性的诊断成像。
[0144]实施例4:靶向/扩增/成像试剂复合体的活体内MRI应用
本实施例以与实施例3类似的方式进行，区别在于用MR成像组分代替超声成像组分。MR成像组分如下制得:将造影剂截留于生物素化脂质体的内部含水间隙内；造影剂应具有高分子量以增强信号。造影剂示例包括但不限于:大分子钆(III)螯合物诸如树状聚体、线性聚合物、礼富勒烯(gadofullurenes)、礼纳米管(gadonanotubes)和大的蛋白(例如参见，Accardo 等人，2009)。
[0145]将亲脂性造影剂掺入进多层脂质体的脂双层中。抗生物素蛋白-PEG3tl-抗生物素蛋白由获自Thermo-Fisher的同双功能交联剂制得。将生物素化脂质体与抗生物素蛋白-PEG3tl-抗生物素蛋白混合，以得到MR成像组分。
[0146]Gd-DTPA是常见的MRI造影剂。典型剂量是0.17 mmol/kg体重。该分子的分子量为 0.56 kDa，直径为 10.0 A (Higgins 等人，2006)。
[0147]0.17Χ10-3摩尔/kg X 100 kg/机体 X 6.022X IO23个分子/摩尔=1.02X IO23个分子/机体。
[0148]假定每一机体6升血，则在常规试剂剂量中，将有1.7X IO15个粒子/μ L血。血构成指定组织区域体积的约10%(5~14%，取决于组织类型)，因此一 μ L组织中约有1.7 X IO14个粒子。
[0149]造影剂分子的表面加载:半径的球体表面积为4 Jir2。3 ym直径的球体的表面积为 2.8Xl(Tn Hi2t5Gd-DTPA 分子的横断面积为 7.85X1(T19 m2。因此，约 36X IO6 个 Gd-DTPA粒子将会拟合围绕着(fit around)每一球体的表面。
[0150]假定I μ L靶向区域中存在100个球体，则这将会提供以全粒子堆积围绕每一球体的3.6 X IO9个靶向的Gd-DTPA粒子。这是常规剂量的约0.002%。
[0151]但是,在University of Wisconsin的一些研究中，产生了每一分子能够结合100个Gd离子的抗体(Glazer等人,2004)。这项工作提及,低达0.1 μΜ的抗体浓度足以用于活体内成像。
[0152]0.1Χ10-6个分子/升 X IO-6^/μ L X 6.022X IO23个分子/摩尔=60.2X IO9抗体/μ L — 6.02X IO12 Gd 离子/μ L。
[0153]根据这项研究,约6Χ IO12 Gd配合物(complexes) / μ L应取得MRI影像。这需要在所述假定100个球体全粒子堆积例基础上扩增超过1600倍。
[0154]因此，本实施例利用具有较好对比度的MRI试剂，以给靶向球体提供更多的靶向Gd-DTPA粒子。在一个实施方案中，PEG链提供额外的结合位点，这些额外的结合位点可大大提高与每一球体结合的Gd-DTPA粒子数目。
[0155]造影剂分子的体积加载:半径r的球体的体积为4/3 π r3。3 μ m直径球体的体积为 1.4X 1(T17 m3。Gd-DTPA 分子的体积为约 5.28X 1(T28 m3。因此，约 26 X IO9 个 Gd-DTPA 粒子应会拟合于每一球体体积内。令这 些分子悬浮或以某种方式束缚以便MRI反应达到最大限度。
[0156]按照革巴向10个球体/ μ L,将达到约260X IO9个Gd配合物(complexes) / μ L,其为MRI成像所需值(6Χ IO12个复合体/μ L)的约1/23。扩增23倍可达到MRI检测限。更高扩增水平可放宽对须加载到球体上的Gd-DTPA粒子数目的要求。
[0157]提高祀向球体的体积以便能够加载更多Gd配合物(complexes),这也会有所帮助。直径增加10%将会导致Gd有效加载能力提高30%。
[0158]结论:通过使递送至一区域的Gd配合物(complexes)数目提高到足以检测的水平，扩增使得靶向MRI对比成像能得以实现。扩增的靶向MRI造影剂限制于血管腔。
[0159]实施例5:向机体内定域位点递送热以治疗疾病状态/微恙/癌的方法
提供抗体包被的一组脂质体，所述抗体祀向机体内定域位点。该组脂质体上还包被有复合试剂互补对的一个成员。
[0160]提供一组微气泡，其中该组微气泡上包被有复合试剂互补对的另一成员。该组微气泡的每一个都填充了气体。
[0161]给患者注射有效量的所述组的脂质体，并让患者带着所述脂质体酝酿足够长的一段时间(诸如但不限于，约3~10分钟)以便发生靶向以及循环性游离脂质体从血流中实质性洗出。然后，给患者注射有效量的所述组的微气泡，并让患者带着所述微气泡酝酿足够长的一段时间(诸如但不限于，约3~10分钟)以便发生二级靶向(即，扩增)以及循环性游离微气泡从血流中实质性洗出。
[0162]随后，向患者一定域部分施加超声，由此超声以适当的频率和幅度施加以致声能被材料所吸收并转化为热。以此方式，所述定域组织被加热到发生坏死而最小限度损伤周边组织的程度。
[0163]在该方法中，对气泡尺寸进行选择以使声吸收达到最大限度而不阻断血流。
[0164]实施例6:靶向/成像试剂复合体的活体内治疗应用如实施例2中那样制得靶向组分。
[0165]制备用于US和PET应用的治疗组分:使用可市购生物素化微气泡用于超声应用。使用可市购生物素化放射性药物用于PET应用。抗生物素蛋白-PEG3tl-抗生物素蛋白由获自Thermo-Fisher的同双功能交联剂制得。将生物素化微气泡与抗生物素蛋白-PEG3tl-抗生物素蛋白混合，以得到治疗组分。
[0166]在使用方法中，将靶向组分/脂质体制剂注入血流中，让患者带着所述组分酝酿足够长的一段时间(诸如但不限于，约3~10分钟)以便发生靶向以及循环性游离脂质体从血流中实质性洗出。然后，给患者注射有效量的成像组分，并让患者带着所述组分酝酿足够长的一段时间(诸如但不限于，约3~10分钟)以便发生二级靶向以及循环性游离微气泡从血流中实质性洗出。二级靶向游离气泡活性可用成像模式进行监控。随后进行靶向试剂和/或祀向治疗活性的诊断成像。
[0167]一些常见的 PET 示踪同位素是 nC、13N、150、18F、64Cu、62Cu、1241、76Br、82Rb 和 68Ga,以及18F0 PET扫描仪的典型灵敏度容许检测10_n~10_12 mol/L浓度。本实施例还预期具有几毫米数量级的分辨率。
[0168]10-η 摩尔/L X 6.022 X IO23 个分子 / 摩尔 X KT6L/μ L = 6 X IO6 个分子 / μ L 假定在I μ L靶向区域中存在100个靶向球体，则每一靶向球体中需要约60，000个同
位素粒子。
[0169]由5 nm厚的磷脂酰胆碱双层组成的100 nm (0.1 μπι)直径单层脂质体含
【权利要求】
1.一种可序贯递送的药学试剂的复合体，其可用于经成像检测腔中暴露的靶，其中所述复合体在腔中形成，所述复合体包含: 至少一个I阶段试剂，其与靶结合； 多个II阶段试剂； 多个III阶段试剂； 其中所述多个II阶段试剂中的每一个与至少一个I阶段试剂结合，且其中所述多个III阶段试剂中的每一个与至少一个II阶段试剂结合，且其中I阶段、II阶段和III阶段试剂中的至少一个可通过成像模式测出，由此使得与靶结合的复合体能得以检测。
2.权利要求1的复合体，其中I阶段、II阶段和III阶段试剂中的至少一个选自囊泡、脂质体、回波发生性脂质体、多模态回波发生性脂质体、微气泡、微气球、微球体、基质粒子、胶束、基于聚集的构建体、纳米粒子、全氟化碳纳米滴以及它们的组合。
3.权利要求1的复合体，其中I阶段、II阶段和III阶段试剂中的至少一个包含气体。
4.权利要求1的复合体，其中I阶段、II阶段和III阶段试剂中的至少一个进一步包含掺入/包封于其中的治疗学组合物。
5.权利要求4的复合体，其中，在借助于I阶段试剂靶向后，治疗学组合物得以递送、释放、活化和/或激发。
6.权利要求5的复合体，其中释放/活化/激发是对热、超声和化学方法中至少一种的暴露的响应。
7.权利要求1的复合体，其中: (a)I阶段试剂进一步限定为包含一级结合位点和二级结合位点； (b)II阶段试剂进一步限定为包含三级结合位点和四级结合位点； (c)III阶段试剂进一步限定为包含五级结合位点； (d)其中，I阶段试剂的一级结合位点与靶形成第一结合复合体，I阶段试剂的二级结合位点与II阶段试剂的三级结合位点形成第二结合复合体，II阶段试剂的四级结合位点与III阶段试剂的五级结合位点形成第三结合复合体。
8.权利要求7的复合体，其中下述情形中至少一种: (a)II阶段试剂的三级和四级结合位点相同，并与I阶段试剂的二级结合位点以及III阶段试剂的五级结合位点互补；和 (b)I阶段试剂的二级结合位点与II阶段试剂的四级结合位点相同，借此I阶段试剂的二级结合位点也可与III阶段试剂的五级结合位点结合以形成第三结合复合体。
9.权利要求8的复合体，其中一级、二级、三级、四级和五级结合位点各自选自肽、蛋白、抗原、抗体、抗体片段、受体、配体、糖缀合物以及它们的组合或衍生物。
10.权利要求1的复合体，其中II阶段试剂与多个III阶段试剂结合，且其中复合体进一步包含至少第二 III阶段试剂。
11.权利要求10的复合体，其中所述至少两个III阶段试剂是相同的。
12.权利要求10的 复合体，其中所述至少两个III阶段试剂是不同的。
13.一种可序贯递送的药学试剂的复合体，其可用于经成像检测腔中暴露的靶，其中所述复合体在腔中形成，所述复合体包含: 附连有多个II阶段试剂的至少一个I阶段试剂，其中所述至少一个I阶段试剂与腔中暴露的靶结合。
14.权利要求13的复合体，其中III阶段试剂上的至少一个结合位点也能够与I阶段试剂结合。
15.—种可序贯递送的可组合制剂，该制剂包含: 第一可给药组合物，其包含能够与腔中暴露的靶结合的I阶段试剂； 第二可给药组合物，其包含II阶段试剂； 第三可给药组合物，其包含III阶段试剂； 其中II阶段试剂包含对I阶段试剂具有亲合力的第一结构部分，和对III阶段试剂具有亲合力的第二结构部分，且其中I阶段、II阶段和III阶段试剂中的至少其一可通过成像模式测出，由此使得与靶结合的I阶段试剂能得以检测。
16.一种生成增强的受试者机体影像的方法，该方法包括以下步骤: 向所述机体给药权利要求15的可序贯递送的可组合制剂；和 生成至少一部分所述机体的超声、磁共振、X射线或射线照相影像。
17.权利要求16的方法，其中所述给药步骤进一步限定为: 向所述机体给药第一可给药组合物；和随后 向所述机体给药第二可给药组合物；和随后 向所述机体给药第三可给药组合物。
18.权利要求17的方法，其中所述给药步骤进一步限定为: 向所述机体给药第一可给药组合物； 让机体酝酿一段时间，以容许I阶段试剂与腔中暴露的靶结合，以及从腔中实质性清除未结合的I阶段试剂； 向所述机体给药第二可给药组合物； 让机体酝酿一段时间，以容许II阶段试剂与I阶段试剂结合，以及从腔中实质性清除未结合的II阶段试剂； 向所述机体给药第三可给药组合物；和 让机体酝酿一段时间，以容许III阶段试剂的结合，以及从腔中实质性清除未结合的III阶段试剂。
19.一种可用于使腔中的靶成像的试剂盒，该试剂盒包含: 第一可给药组合物，其包含能够与腔中暴露的靶结合的I阶段试剂； 第二可给药组合物，其包含II阶段试剂； 第三可给药组合物，其包含III阶段试剂； 其中II阶段试剂包含对I阶段试剂具有亲合力的第一结构部分，和对III阶段试剂具有亲合力的第二结构部分，且其中I阶段、II阶段和III阶段试剂中的至少其一可通过成像模式测出，由此使得与靶结合的I阶段试剂能得以检测。
20.权利要求19的试剂盒，其进一步包含软件模块，该软件模块分析由检测一或多个I阶段、II阶段和/或III阶段试剂的影像递送装置所生成的信息。
21.检测与腔中的靶结合的一或多个I阶段、II阶段和/或III阶段试剂所生成的信号的装置，该装置包含: 计算系统，其包含应用模块和处理单元，所述应用模块包含软件模块，该软件模块分析由影像递送装置所生成的信息，且所述处理单元配置成执行所述软件模块；和 检测一或多个I阶段、II阶段和/或III阶段试剂的影像递送装置，其中III阶段试剂与至少一个与靶结合的I阶段试剂以及至少一个与I阶段试剂结合的II阶段试剂复合。
22.权利要求21的装置，其中影像递送装置还充当能量递送装置，其向腔中与I阶段试剂/11阶段试剂/III阶段试剂复合体结合的靶递送定向能量。
23.权利要求22的装置，其中影像/能量递送装置是超声影像/能量递送装置。
24.一种提高成像模式所检测信号强度的方法，该方法包括以下步骤: 向受试者给药有效量的I阶段试剂，其中I阶段试剂穿越受试者并与受试者腔壁表面上暴露的靶结合； 向受试者给药有效量的II阶段试剂，其中多个II阶段试剂与已与靶结合的I阶段试剂结合； 向受试者给药有效量的III阶段试剂，其中III阶段试剂与已经由I阶段试剂与靶位点结合的II阶段试剂结合；和 经成像模式检测I阶段、II阶段和III阶段试剂中的至少其一所产生的信号。
25.—种诊断受试者中病况/病症的方法，该方法包括以下步骤: 向受试者给药有效量的I阶段你 试剂，其中I阶段试剂包含结合位点，该结合位点与对所述病况/病症特异的靶结合，且其中I阶段试剂穿越受试者并与受试者腔壁表面上暴露的任意IE结合； 向受试者给药有效量的II阶段试剂，其中多个II阶段试剂与已与靶位点结合的I阶段试剂结合； 向受试者给药有效量的III阶段试剂，其中III阶段试剂与已经由I阶段试剂与靶位点结合的II阶段试剂结合；和 经成像模式检测由I阶段、II阶段和III阶段试剂中的至少其一产生的任何信号；和 如果检测出信号则确定受试者具有所述病况/病症。
26.一种治疗受试者中病况/病症的方法，该方法包括以下步骤: 向受试者给药有效量的I阶段试剂，其中I阶段试剂包含结合位点，该结合位点与对所述病况/病症特异的靶结合，且其中I阶段试剂穿越受试者并与受试者腔壁表面上暴露的革巴结合; 向受试者给药有效量的II阶段试剂，其中多个II阶段试剂与已与靶位点结合的I阶段试剂结合；和 向受试者给药有效量的III阶段试剂，其中III阶段试剂与已经由I阶段试剂与靶位点结合的II阶段试剂结合，且其中ι、π和III阶段试剂中的至少其一包含治疗学组合物。
27.—种向靶位点递送治疗学组合物的方法，该方法包括以下步骤: 向受试者给药有效量的I阶段试剂，其中I阶段试剂包含结合位点，该结合位点与对所述病况/病症特异的靶结合，且其中I阶段试剂穿越系统并与受试者腔壁表面上暴露的靶结合； 向受试者给药有效量的II阶段试剂，其中多个II阶段试剂与已与靶位点结合的I阶段试剂结合；和 向受试者给药有效量的III阶段试剂，其中III阶段试剂与已经由I阶段试剂与靶位点结合的II阶段试剂结合，且其中所述1、II和III阶段试剂中的至少其一包含掺入于其中的治疗学组合物。
28.一种在受试者中诱导靶向位点处血管化组织的局部缺血和坏死的方法，该方法包括以下步骤: (a)向受试者给药有效量的I阶段试剂，其中I阶段试剂包含结合位点，该结合位点与对所述病况/病症特异的靶结合，且其中I阶段试剂穿越受试者并与受试者腔壁表面上暴露的任意祀结合； (b)向受试者给药有效量的II阶段试剂，其中多个II阶段试剂与已与靶位点结合的I阶段试剂结合； (C)向受试者给药有效量的III阶段试剂，其中III阶段试剂与已经由I阶段试剂与靶位点结合的II阶段试剂结合；和 (d)重复步骤(b)和(C)的至少其一，直至靶位点处的腔被实质性阻塞。
29.权利要求24~28中任一项的方法，其中在给药有效量的I阶段试剂的步骤中，所述I阶段试剂包含气体。
30.权利要求29的方法，其进一步包括以下步骤:在给药I阶段试剂后将受试者暴露于超声，借此，超声暴露推使I阶段试剂靠着腔壁，并提高I阶段试剂与靶位点相互作用的可能性。
31.权利要求24~30中任一项的方法，其中所述II阶段试剂包含气体。
32.权利要求31的方法，其进一步包括以下步骤:在给药II阶段试剂后将受试者暴露于超声，借此，超声暴露推使II阶段试剂靠着腔壁，并提高II阶段试剂与已与靶位点结合的I阶段试剂相互作用的可能性。
33.权利要求24~32中任一项的方法，其中所述III阶段试剂包含气体。
34.权利要求33的方法，其进一步包括以下步骤:在给药III阶段试剂后将受试者暴露于超声，借此，超声暴露推使III阶段试剂靠着腔壁，并提高III阶段试剂与已与靶位点结合的II阶段试剂及I阶段试剂中的至少其一相互作用的可能性。
35.权利要求24~34中任一项的方法,其中祀位点暴露于血脑屏障、卵巢、胰腺、肾、肝、它们任一个的癌性组织和/或它们的供给组织的至少其一的表面上。
36.权利要求35的方法，其中靶位点是疾病特异性的。
37.权利要求24~36中任一项的方法，其中I阶段试剂/11阶段试剂/III阶段试剂复合体不实质性阻塞腔中流体流动。
38.权利要求24~37中任一项的方法，其中成像模式选自:超声、核磁共振成像(MRI)、计算机化断层成像(CO、双源CT (灌注成像)、弥散张量成像(DTI)、延迟增强成像、X射线和荧光透视(对比荧光透视)成像、计算机化SPECT、PET或PET-CT成像以及分子成像(放射性药物)。
39.权利要求24~38中任一项的方法，其中所述受试者是人类或兽类受试者。
40.权利要求24~39中任一项的方法，其进一步包括以下步骤:向受试者给药有效量的第二 III阶段试剂，其中所述第二 III阶段试剂与已经由I阶段试剂与靶位点结合的II阶段试剂和III阶段试剂中的至少其一结合，且其中所述第二 III阶段试剂包含成像试剂和治疗试剂中的至少其一。
41.权利要求25或26的方法，其中所述病况/病症选自卵巢癌、胰腺癌、肾癌、肝癌、炎症(克罗恩氏病)、血管发生和血栓形成。
42.权利要求26的方法，其进一步包括以下步骤:激活III阶段试剂以治疗所述病况/病症。
43.权利要求24~42中任一项的方法，其进一步包括以下步骤:降解I阶段/11阶段/III阶段复合体的至少一部分。
44.权利要求24~43中任一项的方法，其进一步包括以下步骤: 从复合体上移除III阶段试剂，由此留下与靶位点附连的I阶段试剂/11阶段试剂支架； 向受试者给药有效量的第二 III阶段试剂，由此所述第二 III阶段试剂与已经由I阶段试剂与靶位点结合的II阶段试剂结合。
45 .权利要求24~43中任一项的方法，其进一步包括以下步骤: 从复合体上移除扩增和III阶段试剂，由此留下与靶位点附连的I阶段试剂支架； 向受试者给药有效量的第二 III阶段试剂，由此所述第二 III阶段试剂与I阶段试剂结合 ?
46.权利要求44或45的方法，其中所述第二III阶段试剂包含成像试剂和治疗试剂中的至少其一。
47.权利要求46的方法，其中所述第二III阶段试剂包含成像试剂，且其中所述方法进一步包括以下步骤:经第二成像模式检测由第二 III阶段试剂所产生的任何信号。
48.一种靶向由成像模式可视化的信号的方法，该方法包括以下步骤: 向受试者给药有效量的I阶段试剂，其中I阶段试剂穿越受试者并与受试者腔上暴露的靶位点结合；和随后 给药有效量的II阶段试剂，其中多个II阶段试剂与I阶段试剂结合；和 由成像模式检测I阶段和II阶段试剂中的至少其一所产生的信号。
49.权利要求48的方法，其中在给药有效量的I阶段试剂的步骤中，所述I阶段试剂包含气体。
50.权利要求49的方法，其进一步包括以下步骤:在给药I阶段试剂后将受试者暴露于超声，借此，超声暴露推使I阶段试剂靠着腔壁，并提高I阶段试剂与靶位点相互作用的可能性。
51.权利要求48~50中任一项的方法,其中祀位点暴露于卵巢、胰腺、肾、肝、它们任一个的癌性组织和/或它们的供给组织的至少其一的表面上。
52.权利要求51的方法，其中靶位点是疾病特异性的。
53.权利要求48~52中任一项的方法,其中成像模式选自:超声、核磁共振成像(MRI)、计算机化断层成像(CO、双源CT (灌注成像)、弥散张量成像(DTI)、延迟增强成像、X射线和荧光透视(对比荧光透视)成像、计算机化SPECT、PET或PET-CT成像以及分子成像(放射性药物)。
54.权利要求48~53中任一项的方法，其中所述受试者是人类或兽类受试者。
55.一种成像组合物，其在暴露于声辐射力后具有增强的结合，所述成像组合物包含与靶结合的多模态回波发生性脂质体，其中所述多模态回波发生性脂质体包含气体和第二成像模式。
56.权利要求55的成像组合物，其中第二成像模式选自:核磁共振成像(MRI)、计算机化断层成像(CO、双源CT (灌注成像)、弥散张量成像(DTI)、延迟增强成像、X射线和荧光透视(对比荧光透视)成像、计算机化SPECT、PET或PET-CT成像、分子成像(放射性药物)以及它们的组合。
57.一种生成受试者机体影像的方法，该方法包括以下步骤: 向所述机体给药权利要求55或56的成像组合物； 在给药所述成像组合物后将受试者暴露于超声，借此，超声暴露推使成像组合物靠着腔壁，并提高I阶段试剂与靶位点相互作用的可能性；和 利用成像组合物的第二成像模式，生成所述机体至少一部分的影像。
58.一种可用于使腔中的靶成像的试剂盒，该试剂盒包含权利要求55或56的成像组合物。
【文档编号】A61K9/127GK103648484SQ201180055777
【公开日】2014年3月19日 申请日期:2011年9月26日 优先权日:2010年9月28日
【发明者】L.奥彭海默, I.古拉卡尔 申请人:美国西门子医疗解决公司